专利名称：3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法。
背景技术：
生物催化具有明显的绿色、高效和经济等特点。利用转氨酶选择性将酮基转化为氨基，是最重要的生物转化反应之一。转氨酶(transaminase, amino transferase)是用于合成手性氨或氨基 酸的一类酶。其中β_氨基酸类物质在药物合成中的应用十分广泛，可以用于合成一系列二肽肽酶-1V抑制剂，是重要的抗肿瘤、抗感染和治疗代谢紊乱的药物(Pharmacol. 2004, 404:239, BMC Endocr. Disord. 2008，8:14)。在利用生物转化的方法制备氨基酸类物质的两种主要选择中，相较于步骤繁琐，收率较低的酶拆分法(Org.Biomol. Chem. 2010，8:793-799，产物收率42%，光学纯度96%)，利用转氨酶直接合成的方法具有十分明显的优越性。而在利用化学合成方法合成该类物质的报道中，其收率较低(68%)，而且需要在高压和氢气、钌金属催化剂存在的条件下反应，安全性和环境友好性较差(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17: 2622)。利用转氨酶进行生物转化的报道中，Codexis公司的Savile等人改造并利用来自节杆菌的转氨酶ATA-117，催化1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[1，2，4]三唑[4，3_a]批嗪_7 (8H)-基)-4-(2, 4, 5- 二氟苯基)丁烧-1，3- 二酮转化为3-氨基-1-(3-( 二氟甲基)-5,6-二氢-[1，2，4]三唑[4, 3-a]吡嗪 _7 (8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁烷-1-酮，即Merck公司的治疗糖尿病药物西他列汀(Sitagliptin，商品名JANUVIA)是利用转氨酶进行生物转化的优秀实例(Science2010，329:305)。3-羰基_4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯是上述反应的模型底物之一，也是重要的潜在手性药物前体。但是，到目前为止，还未有利用转氨酶将3-羰基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用重组转氨酶将3-羰基_4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案一种3-氨基-4-(2，4，5_三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其以3_羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子、氨基供体和助溶剂的存在下发生反应生成目标产物3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化剂为重组转氨酶，所述的重组转氨酶的制备方法为将含有转氨酶的单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40°C下活化8-12小时，将活化后得到的培养物转接到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40°C下扩大培养至0D600值达到O. 6-0. 8，加入诱导剂，于25-35°C继续培养8-12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得到悬浮液，将悬浮液置于冰浴中超声波破碎8-12分钟，再离心，将上清液预冻至温度为-1(T-25°C，然后再冻干24-48小时，即得重组转氨酶，所述的反应在pH为6. 0-9. O的水相缓冲液中进行。进一步地，在起始时的反应体系中，所述的重组转氨酶所述的辅因子所述的氨基供体所述的3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的质量比为O. 4-0. 6 :0. 01-0.1 5-7 :1。优选地，所述的诱导剂为异丙基_β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。优选地，所述的辅因子为磷酸吡哆醛。优选地，所述的氨基供体为异丙胺。优选地，所述的助溶剂为二甲基亚砜。优选地，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。优选地，所述的反应在pH为7. O的水相缓冲液中进行。进一步地，所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入所述的水相缓冲液、底物3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯、所述的氨基供体、所述的助溶剂、所述的辅因子和所述的重组转氨酶，搅拌均匀，在25-45°C和氮气吹扫的条件下反应，利用HPLC检测反应进程，待转化率达90-99%时，调节pH至2_3，硅藻土过滤，在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，旋转蒸发蒸发脱去溶剂，即得3-氨基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯产品。根据本发明，除重组转氨酶外，其余原料均可由通用渠道商购获得。本发明的有益效果在于本发明首次实现了采用重组转氨酶将3-羰基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，与传统的化学法相比，本发明能耗低，操作简单方便，副产物少，并且产物的光学活性较高。
具体实施例方式本发明的反应式如下
权利要求
1.一种3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于其以3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子、氨基供体和助溶剂的存在下发生反应生成目标产物3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化剂为重组转氨酶，所述的重组转氨酶的制备方法为将含有转氨酶的单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40°C下活化8-12小时，将活化后得到的培养物转接到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于35-40°C下扩大培养至0D600值达到O.6-0. 8，加入诱导剂，于25-35°C继续培养8-12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得到悬浮液，将悬浮液置于冰浴中超声波破碎8-12分钟，再离心，将上清液预冻至温度为-1(T-25°C，然后再冻干24-48小时，即得重组转氨酶，所述的反应在pH为6. 0-9. O的水相缓冲液中进行。
2.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于在起始时的反应体系中，所述的重组转氨酶所述的辅因子所述的氨基供体所述的3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的质量比为O. 4-0. 6 :0. 01-0.1 :5_7 Io
3.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷或乳糖。
4.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的辅因子为磷酸吡哆醛。
5.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的氨基供体为异丙胺。
6.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的助溶剂为二甲基亚砜。
7.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或三乙醇胺盐酸缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的3-氨基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的反应在pH为6. 0-9. O的水相缓冲液中进行。
9.根据权利要求1或2所述的3-氨基-4-(2，4，5_三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其特征在于所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入所述的水相缓冲液、底物3-羰基-4-(2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯、所述的氨基供体、所述的助溶剂、所述的辅因子和所述的重组转氨酶，搅拌均匀，在25 45°C和氮气吹扫的条件下反应，利用HPLC检测反应进程，待转化率达9(Γ99%时，调节pH至2_3，硅藻土过滤，在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，旋转蒸发蒸发脱去溶剂，即得3-氨基-4- (2，4，5-三氟苯基)丁酸甲酯女口广叩ο
全文摘要
一种3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的生物制备方法，其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子、氨基供体和助溶剂的存在下发生反应生成目标产物3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，所述的生物催化剂为重组转氨酶，所述的反应在pH为6.0-9.0的水相缓冲液中进行。本发明首次实现了采用重组转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯转化为3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯，与传统的化学法相比，本发明能耗低，操作简单方便，副产物少，并且产物的光学活性较高。
文档编号C12N9/10GK103014081SQ201210555608
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者乐庸堂, 鞠鑫 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司