专利名称：稳定的多肽组合物的制作方法
稳定的多肽组合物本申请是申请日为2007年03月19日、中国申请号为200780017774.3、发明名称为“稳定的多肽组合物”的发明申请的分案申请。相关申请本申请要求享有以下美国临时专利申请的优先权，其每一篇为所有目的而全文纳入本文参考:I)美国临时专利申请60/783，622号，其提交于2006年3月17日，其名称为“稳定化的多肽和用于评估和增加其稳定性的方法”；2)美国临时专利申请60/812,688号，其提交于2006年6月9日，其名称为“稳定化的多肽和用于评估和增加其稳定性的方法”；3)美国临时专利申请60/873，502号，其提交于2006年12月8日，其名称为“用于评估和增强多肽生物物理性质的方法”;和4)美国临时专利申请60/873，996号，其提交于2006年12月8日，其名称为“稳定化的多肽组合物”。本说明书中引用的任何专利、专利申请、和参考文献的内容都全文纳入本文参考。
背景技术：
现在，蛋白质稳定性被认为是蛋白质(如，抗体分子)开发和升级的中心议题。抗体的重链和轻链可变区序列处在选择压力之下，其序列可在不同抗体之间有显著差别(Wu和Kabat，1970)。在人基因 组内嵌有大量功能性胚系可变重链Γ40 ；Tomlinson等，1992 ；Tomlinson 等，1994 ；Matsuda 和 Honjo, 1996)、可变 κ 链( 40 ；Meindl 等，1989 ；Cox 等，1994 ;Barbie 和 Lefranc, 1998)和可变 λ 链( 30 ;Williams 等，1996 ;Kawasaki,等，1997)基因。免疫系统产生许多重链和轻链可变区胚系组合的能力是产生抗体多样性的一种机制(Edelman, 1959 ;Fraftek, 1961)。其它多样性源自在可变区和恒定结构域之间插入可变连接肽区域——J-连接肽(加上重链的D-连接肽)(Leder，1982)。选择抗特定抗原的胚系抗体，接着，表达单一抗体(所述抗体带有所选择的可变区胚系和(D-)J-连接肽)的B细胞在可变重链和轻链结构域内进行超体细胞突变(hypersomatic)过程,从而增加针对抗原的抗体亲和性(Leder, 1982 ;Tomlinson等，1996)。在可变区内也经常可观察到超体细胞插入或缺失，然而其比超体细胞突变频率低得多(de Wildt等，1999)。因而，抗特定抗原而加以选择的成熟的抗体将具有高度独特的可变区序列，不必对其稳定性进行优化。当在多种细胞系统中(如在细菌或哺乳动物表达系统中)表达时,稳定性差可影响抗体或抗体结构域适当折叠的能力。错误折叠或稳定性不良也可导致部分非功能性材料群体(Martsev等，1998)和/或有形成大的可溶聚集体倾向的抗体,所述聚集体在用于治疗时有潜在危险或有免疫原性。其他稳定性问题包括重折叠受阻、降解、亲合性削弱、聚集，或储存后丧失活性。稳定性问题不限于天然产生的抗体，也可发生在基因工程化的抗原结合分子中，例如用于生产和临床目的的重组抗体文库(Hoogenboom，2005)、抗体片段(Holt等，2003 ；Todorovska 等，2001 ;Worn 和 Pliickthun, 2001 ;Reiter 和 Pastan, 1996)和基因工程化的或人源化的治疗性抗体(Ewert等,2004 ；Carter和Merchant, 1997)。另外，多价形式的抗体(如双特异性分子)可有稳定性的问题。尽管双特异性抗体因其能用于人的治疗所以是所希望的，但是其生产是不可预测的。例如，双特异性抗体可导致热稳定性、产品产量的实质性减少，或导致形成低分子量聚集体。在人源化啮齿动物抗体时，也可出现Vh和'结构域的非天然改变。通常将啮齿动物互补决定区(CDR)移植到最相似的人胚系可变区上来进行人源化(Hurle和Gross，1994)。被选择来进行人源化的胚系不可能以高频率地被免疫系统所使用，而且为获得足够的抗原结合性经常需要改变人框架。蛋白质不稳定会产生许多问题，包括以下的一个或多个:不适合在生物反应器中规模化生产(例如因为产量低，不需要的副产品(如未组装的产物和/或聚集材料)的水平显著高)，蛋白质难以纯化，和不适于药物制备和使用(如，由于分解产物的水平显著高、产品质量差、和/或药物动力学性质不良)。抗体、Fab、Fv、或单链Fv(ScFv)的可变区内的不稳定性可导致这些问题中的许多问题。scFv构建体尤其已显示出稳定性、溶解性、表达、聚集、分解产物、和在细菌和哺乳动物表达系统中整体可制造性的问题(参见Worn和Pluckthun, 2001)。另外，将scFv分子整合入原本稳定的重组抗体产物中，经常给新的重组设计带来这些通常不需要的特性。因此，需要预测蛋白质(如抗体)稳定性的改进方法和对于适于规模化生产的改进的稳定化抗原结合分子。也需要一些改进的方法，以规模化生产适于药物应用的稳定化的抗原结合分子群。发明简述本发明至少部分基于开发改进的多肽组合物(如改进的结合分子)和制备它们的方法，所述多肽组合物包括稳定性改善的scFv分子,或由稳定性改善的scFv分子组成。
在一个方面，本发明涉及稳定化的scFv分子群，其中稳定化的scFv分子包含:i)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh结构域中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或ii)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中乂11和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子具有大于49° C的
丁50°在另一个方面，本发明涉及稳定化的scFv分子，其中稳定化的scFv分子包含:i) scFv接头，其具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中Vh和\结构域由Vh氨基酸44位和\氨基酸100位之间的二硫键连接；ii) Vh结构域和'结构域，其中该分子具有至少一个替换，所述替换选自由如下组成的组:a)在VH的Kabat 13位上进行氨基酸替换；b)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换；c)在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换；d)在VL的Kabat 49位上进行氨基酸替换；e)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；
f)在VL的Kabat 49和50位上进行氨基酸替换；g)在VH的Kabat 101位上进行氨基酸替换；h)在VH的Kabat 20位上进行氨基酸替换；i)在VH的Kabat 48位上进行氨基酸替换；j)在VL的Kabat 3位上进行氨基酸替换；k)在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换；I)在VH的Kabat 67位上进行氨基酸替换；m)在VH的Kabat 6位上进行氨基酸替换；η)在VH的Kabat 32位上进行氨基酸替换；ο)在VH的Kabat 49位上进行氨基酸替换；P)在VH的Kabat 43位上进行氨基酸替换；q)在VH的Kabat 72位上进行氨基酸替换；r)在VH的Kabat 79位上进行氨基酸替换；s)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；t)在VL的Kabat 75位上进行氨基酸替换；
`
u)在VH的Kabat 80位上进行氨基酸替换；V)在VH的Kabat 83位上进行氨基酸替换；或iii)在scFv的VH和VL之间带有稳定界面的Vh结构域和Vlj结构域,其中所述分子在直接位于界面内的氨基酸位置上和/或在支撑VH和VL间相互作用的氨基酸位置上具有至少一个替换，其中所述至少一个氨基酸位置选自由如下所组成的组:按照Kabat编号的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和104L，而且其中该稳定化的scFv分子的T5tl大于没有经过替换的scFv分子的
丁50°在另一个方面，本发明涉及稳定化的scFv分子，其包含插入Vh结构域和\结构域之间的(Gly4Ser)4ScFv接头，其中V1^P \结构域由Vh中的氨基酸和\中的氨基酸间的二硫键连接。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及包含￥11结构域和'结构域的稳定化的scFv分子，其中该分子具有至少一组选自由如下所组成的组的替换:a)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；b)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；和在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上进行氨基酸替换，例如用天冬氨酸。在另一个具体实施方式
中，稳定化的scFv分子具有在热攻击条件下与常规Fab片段相等的稳定性。在一个具体实施方式
中，稳定性通过测量结合靶分子的能力而测量。在一个具体实施方式
中，scFv分子包含氨基酸序列，其由选自由SEQ IDNO:9、14、16、和18组成的组的核苷酸序列编码。在一个具体实施方式
中，scFv分子包含选自由SEQ ID NO: 10、15、17、和19组成的
组的氨基酸序列。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及包含稳定化的scFv分子的融合蛋白。在一个具体实施方式
中，融合蛋白包含至少2个抗原结合位点。在另一个方面，本发明涉及稳定化的多价抗原结合分子群，其中稳定化的结合分子包含至少一个稳定化的scFv分子,所述稳定化的scFv分子包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由二硫键连接，所述二硫键位于Vh中的氨基酸和'结构域中的氨基酸之间，而且其中稳定化的结合分子群包含单体形式的可溶蛋白，其中不超过10%以聚集形式呈现。在一个具体实施方式
中，稳定化的多价抗原结合分子在CHO或NSO细胞中表达。在另一个方面，本发明涉及稳定化的多价抗原结合分子群，其中每个多价抗原结合分子包含:i)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和Vlj结构域之间的scFv接头,其中Vh和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中至少一个scFv分子的Vh和\结构域 具有大于55° C的Tm值；或ii)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和Vlj结构域之间的scFv接头,其中V1^P \结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中多价抗原结合分子的至少一个scFv分子具有大于49° C的T5(l。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及稳定化的多价抗原结合分子，其包含:i)至少一个稳定化的scFv分子,其中稳定化的scFv分子包含插入Vh结构域和\结构域之间的(Gly4Ser)n scFv接头,而且其中Vh和Vlj结构域由二硫键连接；ii)至少一个稳定化的scFv分子,其包含具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh第44位氨基酸和\第100位氨基酸之间的二硫键连接；iii)至少一个稳定化的scFv分子,其中该稳定化的scFv分子包含至少一个选自由如下所组成的组的替换:a)在VH的Kabat 13位上进行氨基酸替换；b)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换；c)在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换；d)在VL的Kabat 49位上进行氨基酸替换；e)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；f)在VL的Kabat 49和50位上进行氨基酸替换；g)在VH的Kabat 101位上进行氨基酸替换；h)在VH的Kabat 20位上进行氨基酸替换；i)在VH的Kabat 48位上进行氨基酸替换；
j)在VL的Kabat 3位上进行氨基酸替换；k)在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换；I)在VH的Kabat 67位上进行氨基酸替换；m)在VH的Kabat 6位上进行氨基酸替换；η)在VH的Kabat 32位上进行氨基酸替换；ο)在VH的Kabat 49位上进行氨基酸替换；P)在VH的Kabat 43位上进行氨基酸替换；q)在VH的Kabat 72位上进行氨基酸替换；r)在VH的Kabat 79位上进行氨基酸替换；s)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；t)在VL的Kabat 75位上进行氨基酸替换；u)在VH的Kabat 80位上进行氨基酸替换；V)在VH的Kabat 83位上进行氨基酸替换；或iv) Vh结构域和\结构域，其带有位于scFv的VH和VL之间的稳定界面,其中该分子在直接位于界面内的氨基酸位置上和/或在支撑VH和VL间相互作用的氨基酸位置上具有至少一个替换，其中该 至少一个氨基酸位置选自由如下所组成的组:按照Kabat编号的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L,58L,74L,77L,83L，89L，和 104L。在另一个方面，本发明涉及稳定化的多价抗原结合分子，其包含至少一个稳定化的scFv分子，所述稳定化的scFv分子包含插入Vh结构域和Vlj结构域之间的(Gly4Ser)4ScFv接头,其中Vh和\结构域由二硫键连接,所述二硫键位于Vh中的氨基酸和'结构域中的氨基酸之间。ii)至少一个稳定化的scFv分子,其包含scFv接头,所述接头具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \结构域由二硫键连接，所述二硫键位于Vh44位氨基酸和'100位氨基酸之间；或iii)至少一个稳定化的scFv分子,其中该稳定化的scFv分子包含至少一个选自由如下所组成的组的替换:a)替换在VL的Kabat 3位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、或甘氨酸；b)替换在VL的Kabat 46位上的氨基酸(如，丝氨酸)，例如用亮氨酸；c)替换在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，丝氨酸)，例如用酪氨酸或丝氨酸；d)替换在VL的Kabat 50位上的氨基酸(如，丝氨酸或缬氨酸)，例如用丝氨酸、苏氨酸、和精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、或赖氨酸；e)分别用酪氨酸和丝氨酸；酪氨酸和苏氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；丝氨酸和精氨酸；或丝氨酸和赖氨酸替换在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，丝氨酸)和Kabat 50位上的氨基酸(如，丝氨酸)；f)替换在VL的Kabat 75位上的氨基酸(如，缬氨酸)，例如用异亮氨酸；g)替换在VL的Kabat 80位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用丝氨酸或甘氨酸；
h)替换在VL的Kabat 83位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、或苏氨酸；i)替换在VH的Kabat 6位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用谷氨酰胺；j)替换在VH的Kabat 13位上的氨基酸(如，赖氨酸)，例如用谷氨酸；k)替换在VH的Kabat 16位上的氨基酸(如，丝氨酸)，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；I)替换在VH的Kabat 20位上的氨基酸(如，缬氨酸)，例如用异亮氨酸；m)替换在VH的Kabat 32位上的氨基酸(如，天冬酰胺)，例如用丝氨酸；η)替换在VH的Kabat 43位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用赖氨酸或精氨酸；ο)替换在VH的Kabat 48位上的氨基酸(如，甲硫氨酸)，例如用异亮氨酸或甘氨酸；P)替换在VH的Kabat 49位上的氨基酸(如，丝氨酸)。例如用甘氨酸或丙氨酸；q)替换在VH的Kabat 55位上的氨基酸(如，缬氨酸)，例如用甘氨酸；r)替换在VH的Kabat 67位上的氨基酸(如，缬氨酸)，例如用异亮氨酸或亮氨酸；S)替换在VH的Kabat 72位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用天冬氨酸或天冬酰胺；t)替换在VH的Kabat 79`位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用丝氨酸、缬氨酸、或酪氨酸；和u)替换在VH的Kabat 101位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用天冬氨酸。在另一个方面，本发明涉及多价抗原结合分子，其包含至少一个稳定化的scFv分子，其中该稳定化的scFv分子包含至少一组选自由如下所组成的组的替换:a)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；b)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；和在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换，例如用赖氨酸；在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上进行氨基酸替换，例如用天冬氨酸。在一个具体实施方式
中，至少一个稳定化的scFv分子是通过基因工程与抗体融合的。在另一个具体实施方式
中，两个稳定化的scFv分子是通过基因工程与抗体融合的。在一个具体实施方式
中，至少一个稳定化的scFv分子是通过基因工程与抗体轻链或重链的羧基末端融合。在一个具体实施方式
中，至少一个稳定化的scFv分子通过基因工程与抗体轻链或重链的氨基末端融合。在一个具体实施方式
中，本发明结合分子包含至少一个结合位点，该位点结合优先在癌细胞上表达的分子。
在一个具体实施方式
中，本发明的scFv分子Vh结构域源自BHAlO抗体。在一个具体实施方式
中，本发明的scFv分子'结构域源自BHAlO抗体。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含至少一个结合位点，该位点特异于选自由下列所组成的组的分子:HER1，HER3，CD80，CD86，PD_1，CTLA4，B7-H4, RON, CD200，CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR，受体 TNF 家族的成员，Tie 受体，MET, IGFl, IGF2, TNF，TNF配体，IL-6, TWEAK, Fnl4, CD20, CD23, CRIPTO, HGF，α 4β I 整联蛋白，α 5β I 整联蛋白，α6β4整联蛋白，和ανβ6整联蛋白。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含至少一个结合位点，该位点结合参与调节免疫应答的分子。在一个具体实施方式
中，所述分子是Fe受体。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含至少一个结合位点，该位点结合参与调节血管生成的分子。在一个具体实施方式
中，本发明的所述结合分子结合VEGF或血管生成素(angiopoitin)。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含至少一个结合位点，该位点结合神经学上的靶。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子是多特异性的。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子是双特异性的。在另一个具体实施方式
中，本发明的结合分子结合TNF受体家族的两个成员。在一个具体实施方式
中，本 发明的结合分子结合LTiiR和Trail R2。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包括通过基因工程方法与14A2抗体融合的BHAlOscFv分子。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含具有下述序列的重链，所述序列选自由 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:53，和 SEQ IDNO:55 所组成的组。在一个具体实施方式
中，本发明的结合分子包含编码下文项4_8、11、12、和18_22之任一的分子的多肽的核苷酸序列。在一个具体实施方式
中，本发明涉及含核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列编码稳定化的scFv分子或编码含本发明的稳定化的scFv分子的结合分子。在一个具体实施方式
中，核酸分子在载体中。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及包含这种载体的宿主细胞。在一个具体实施方式
中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如CHO细胞或NSO细胞。在一个具体实施方式
中，本发明涉及结合分子的群体，所述结合群体含scFv分子，该群体的聚集度与表达含常规scFv分子的结合分子群体的宿主细胞相比至少低10%。在一个方面,本发明涉及产生稳定化的结合分子的方法,包括在能产生稳定化的结合分子的条件下培养宿主细胞。在一个具体实施方式
中，每升宿主细胞培养基产生至少IOmg稳定化的结合分子，而且其中以聚集形式呈现的结合分子不超过10%。在一个方面，本发明涉及治疗会受益于用本发明的结合分子治疗的受试者的方法，包括向受试者施用结合分子，以使所述治疗发生。在一个具体实施方式
中，受试者患有选自由下列所组成的组的疾病或病症:癌症、自身免疫性疾病或病症、和神经学上的疾病或病症。
在一个方面,本发明涉及稳定化scFv分子的方法,其包括用(Gly4Ser)nScFv接头通过基因工程方法融合Vh结构域和\结构域，并基因工程化Vh结构域以在44位氨基酸上包含半胱氨酸，和基因工程化' 结构域以在100位氨基酸上包含半胱氨酸，从而形成稳定化的scFv分子。在一个方面，本发明涉及制备包含稳定化的scFv分子的稳定化的多价抗体的方法，该方法包括通过基因工程方法将稳定化的scFv分子与抗体分子轻链或重链的氨基末端或羧基末端融合。在一个具体实施方式
中，本发明涉及制备稳定化的scFv分子的方法，包括替换在scFv分子的VH/VL界面中的至少一个氨基酸和/或支撑scFv分子的VH/VL界面的至少一个氨基酸。与常规scFv分子相比，所述一个或多个替换同时改善scFv分子VH和VL结构域的热稳定性。在又一具体实施方式
中，本发明涉及制备稳定化的scFv分子的方法，包括替换在VH结构域或VL结构域中至少一个与VH和VL结构域之间界面上的两个或多个氨基酸共变(covary)的氨基酸。在又一具体实施方式
中，本发明涉及制备含scFv分子的稳定化的融合蛋白分子的方法，包括替换在scFv分子的VH/VL界面中的至少一个氨基酸和/或替换在scFv分子的VH/VL支架(scaffold)中的至少一个氨基酸，并通过基因工程方法将scFv分子与多肽融合，由此制备稳定化的融合蛋白。
在又一具体实施方式
中，本发明涉及改善含至少一个scFv分子的多价分子的稳定性的方法，该方法包括将至少一个稳定化突变导入所述至少一个scFv分子中，由此改善多价分子的稳定性。在又一具体实施方式
中，本发明涉及改善scFv分子的稳定性的方法，该方法包括将至少一个稳定化突变导入scFv分子中，由此改善scFv分子的稳定性。在又一方面，本发明涉及大规模制备稳定化的融合蛋白的方法，该方法包括:(a)进行scFv分子的热稳定性测试以确定候选scFv分子的热稳定性；(b)将候选scFv分子的热稳定性与合适对照比较，以鉴定与对照相比热稳定性增加的稳定化scFv分子，(c)选择步骤(b)中鉴定出的稳定化的scFv分子；(d)通过基因工程方法将至少一个稳定化的scFv分子与蛋白质融合，以形成稳定化的融合蛋白；(e)用带有编码稳定化的融合蛋白的核酸分子转染哺乳动物宿主细胞，(g)在能使稳定化的融合蛋白表达的条件下培养步骤(f)的宿主细胞；其中当在IOL或更大的培养基中生长时，稳定化的融合蛋白被表达后蛋白质聚集不超过10%。在又一方面，本发明涉及从含候选氨基酸序列的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中确定蛋白质折叠的热稳定性的方法，该方法包括以下步骤:a)提供序列的辅助参考集(curated reference set)的比对,所述序列与多肽的Ig折叠对应；b)计算比对的序列氨基酸残基之间的共变(covariation),以产生出共变数据；
c)从共变数据内的共变中确定候选序列内氨基酸位置的序列位置特异性共变评分；和d)储存或输出氨基酸位置特异性序列共变评分以作为多肽稳定性量度。在一个具体实施方式
中，对于数种免疫球蛋白(Ig)超家族多肽，该方法包括至少重复步骤c)和d)。在又一具体实施方式
中，基于候选序列的序列位置特异性共变评分，该方法进一步包括从数种免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中选出用于生产的Ig超家族多肽的步骤。 在另一个具体实施方式
中，该方法进一步包括生产所选择的Ig超家族多肽和为治疗用途而制备它的步骤。在另一个具体实施方式
中，Ig超家族多肽源自选自由下列所组成的组的蛋白质:免疫球蛋白或其抗原结合片段、免疫球蛋白受体、细胞粘附蛋白、整联蛋白、过敏原、T-细胞受体、和主要组织相容性复合物(MHC)。在一个具体实施方式
中，Ig超家族多肽选自由重链可变区(VH)、轻链可变区(')、和单链抗体(scFv)所组成的组。在另一个具体实施方式
中，Ig折叠选自由V类折叠、I类折叠、Cl类折叠、和C2类折叠所组成的组。在一个具体实施方式
中，辅助参考集或比对具有至少50%的多样性。在一个具体实施方式
中，比对中的每个序列与比对中的其它每个序列具有小于90%的同一性。在另一个具体实施方式
中，至少一个序列来自哺乳动物物种，而且至少一个序列来自非哺乳动物物种。在一个具体实施方式
中，对于在比对的相应位置上找到的令人满意的正共变，候选序列被赋予残基位置特异性共变正评分。在一个具体实施方式
中，对于在比对的相应位置上找到的令人满意的负共变，候选序列被赋予残基位置特异性共变负评分。在一个具体实施方式
中，正共变的Φ关联系数(phi association coefficient)(Φ)约 +0.25 至约 +1.0。在一个具体实施方式
中，负共变的Φ关联系数(Φ)约-0.25至约-1.0。在一个具体实施方式
中，比对选自由下列所组成的组:基于结构的序列比对、基于序列的序列比对、和基于结构的结构比对。在一个具体实施方式
中，确定比对中每个残基位置上的所有可能残基对的位置特异性共变评分。在一个具体实施方式
中，比对通过如下来获得:(i)由初始比对产生隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model, HMM) ；(ii)用HMM获得其他序列；和(iii)将其他序列与初始比对进行比对。在一个方面，本发明涉及计算机程序或计算机程序产品或计算机可读介质，其具有处理器可执行指令集，当执行时，所述指令集使处理器进行本发明的方法。 在又一具体实施方式
中，本发明涉及适用于电子设备中的计算机程序或计算机程序产品或计算机可读介质，其包括对应于本发明方法的比对的数据。
在又一具体实施方式
中，本发明涉及适用于电子设备中的计算机程序或计算机程序产品或计算机可读介质，其包括本发明方法的共变数据。在一个具体实施方式
中，本发明涉及被安排来执行本发明方法的设备。在一个方面，本发明涉及计算设备中的系统，包括:(i)初始序列收集过程；(ii)能从下文项58-74之任一的比对中保存序列数据的储存位置(storagelocation)；(iii)分析工具(analysis facility),其程序性地分析比对内残基对之间的共变以获得共变数据；
(iv)与所述电子设备有交互界面的输出设备，所述输出设备输出所述共变数据。在一个具体实施方式
中，本发明涉及计算设备中的介质，其保存进行包括本发明方法任何步骤的方法的可执行步骤。在又一具体实施方式
中，对残基使用频率数据的显示包括矩阵，其包括(i)对应于多肽序列的连续残基位置；和(ii)针对每个残基位置上的残基类型的残基使用频率。在又一具体实施方式
中，符号化描述残基使用频率。在一个具体实施方式
中，要表示所有20种天然氨基酸、缺口、和不明确的残基。在一个具体实施方式
中，残基使用频率与符号大小相关。在一个具体实施方式
中，残基使用频率与符号大小正相关。在一个具体实施方式
中，(i)残基位置以列显示；和(ii)残基使用频率以行显示。在另一个具体实施方式
中，共变残基中的共变由网络覆盖图来描述。在一个方面,本发明涉及图形用户界面(graphical user interface),包括用图形显示:(i)栅格布局(grid layout)，其包括多肽序列参考集的残基使用频率数据集；和(ii)共变覆盖图(covariation overlay) 在一个具体实施方式
中，界面进一步包括:(iii)对感兴趣的序列的显示。在一个方面，本发明涉及产生具有改善的生物物理性质的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽的方法，所述方法包括以下步骤:a)提供对应于多肽的Ig折叠的序列辅助参考集的比对；b)计算比对的序列残基之间的共变以鉴定出共变的残基；c)替换未能满足与在比对的相应位置上找到的共变残基的共变的多肽残基。在另一个具体实施方式
中，生物物理性质选自由下列所组成的组:热稳定性、pH解折叠谱、糖基化的稳定去除、溶解性、生化功能、和其组合。在一个具体实施方式
中，生化功能选自由蛋白质靶或化学部分的识别所组成的组，该化学部分选自由磷酸、甲基、乙酰基、脂、去污剂、金属离子、卤素、RNA、DNA、寡核苷酸、和寡核苷所组成的组。在一个具体实施方式
中，Ig超家族多肽源自蛋白质，所述蛋白质选自由抗体或其抗原结合片段、免疫球蛋白受体、细胞粘附蛋白、整联蛋白、过敏原、T-细胞受体、和主要组织相容性复合物(MHC)分子所组成的组。在一个具体实施方式
中，Ig超家族多肽选自由重链可变区(VH)、轻链可变区(')、和单链抗体(sFv)所组成的组。在一个具体实施方式
中，Ig折叠选自由V类折叠、I类折叠、Cl类折叠、和C2类折叠所组成的组。在另一个具体实施方式
中，Ig超家族多肽是修饰的抗体，所述修饰的抗体选自由结构域抗体、人源化抗体、人抗体、非人单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、含scFv的抗体、和结构域缺失的抗体所组成的组。在一个具体实施方式
中，共变的残基是选自由二硫键、盐桥、配体结合口袋或表面的一部分、和范德华网络、氢键、和/或电荷-电荷相互作用所组成的组的结构特征的一部分。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及产生具有改善的稳定性的抗体或修饰的抗体的方法，所述方法包括以下步骤:a)提供经实验确认为稳定的模板抗体的高解析度结构模型；b)用结构模型鉴定模板抗体中的VH/VL界面和/或支撑界面的残基；c)用同源模型鉴定抗体或修饰的抗体中对稳定界面至关重要的相应VH/VL界面残基；和d)用来自模板蛋白质的界面残基替换抗体或修饰的抗体中的相应VH/VL界面残基。在一个具体实施方式
中，模板蛋白质的界面残基掩盖(bury)该界面中至少10A2:的表面区域。在一个具体实施方式
中，修饰的抗体选自由单结构域抗体、人源化抗体、人抗体、非人单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、含scFv的抗体、和结构域缺失的抗体所组成的组。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及本发明的方法产生的多肽。在一个具体实施方式
中，多肽显示出生物物理性质有改善，所述生物物理性质选自由热稳定性、PH解折叠谱、糖基化的稳定去除、溶解性、生化功能、和其组合所组成的组。在一个具体实施方式
中，生化功能是配体结合亲和性或特异性。在另一个方面，本发明涉及产生含稳定化的scFv分子的文库的方法，该方法包括:(a)提供对应于scFv分子可变区序列的序列参考集；(b)鉴定可变区内在参考集中相应位置上缺失或以低频率存在的氨基酸；和(c)将该信息与共变数据相组合，所述共变数据提示修饰参考集中以低频率鉴定出的氨基酸可满足可变区内现有的共变限制；和(d)用候选稳定化氨基酸替换步骤(b)的氨基酸，由此产生含稳定化的scFv分子的文库。在一个具体实施方式
中，步骤(b)的氨基酸具有小于0.5的共有(concensus)评分。在另一个具体实施方式
中，步骤(b)的氨基酸在参考集的序列中少于10%。在另一个具体实施方式
中，步骤(b)的氨基酸是非共有残基。在一个具体实施方式
中，候选的稳定化氨基酸在参考集内相应位置上被发现。在又一具体实施方式
中，候选的稳定化氨基酸是共有氨基酸。
在一个具体实施方式
中，通过分析可变区序列的3-D结构来鉴定候选的稳定化氨基酸。在另一个具体实施方式
中，通过侧链重包装计算(side-chain repackingcalculation)来鉴定稳定化氨基酸。
在又一方面，本发明涉及产生稳定化的scFv分子的方法，该方法包括:(a)提供根据下文项56的方法设计的scFv文库，(b)用热攻击试验筛选scFv文库以鉴定候选scFv分子，(c)将scFv文库的候选scFv分子的热稳定性与合适对照比较，由此，候选scFv分子的热稳定性相对于对照增加，则鉴定出作为稳定化的scFv分子的候选scFv分子。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及用本发明的方法鉴定出的稳定化的scFv分子或含本发明稳定化的scFv分子的融合蛋白。在另一个方面，本发明涉及预测候选蛋白质的稳定性的方法，所述候选蛋白质含具有候选结构域序列的氨基酸序列，该方法包括:(a)提供氣基酸序列参考集，其对应于候选蛋白质的候选结构域序列；(b)确定在测试结构域序列内的各氨基酸位置上的残基频率以获得共有评分；和(C)用共有评分预测候选蛋白质的稳定性，其中共有评分与候选蛋白质的稳定性相关。在另一个方面，本发明涉及预测候选蛋白质的稳定性的方法，该方法包括:(a)提供序列参考集，其对应于候选蛋白质的测试结构域序列；(b)确定在测试结构域序列内的各氨基酸位置上的残基频率以获得共有评分；和(C)用共有评分预测候选蛋白质的稳定性，其中共有评分与候选蛋白质的稳定性相关。在另一个具体实施方式
中，本发明涉及预测候选蛋白质的稳定性的方法，该方法包括:(a)提供序列参考集，其对应于候选蛋白质的测试结构域序列；(b)确定在测试结构域序列内的氨基酸位置上的残基频率以获得共有评分；(C)确定在参考集序列内的相应氣基酸位置上的残基频率以确定平均共有评分；(d)比较共有评分与平均共有评分以确定序列评分；和(e)用序列评分预测候选蛋白质的稳定性，其中共有评分与候选蛋白质的稳定性直接相关。在又一具体实施方式
中，本发明涉及预测候选抗体或候选修饰的抗体的稳定性的方法，该方法包括:(a)提供VH结构域的序列参考集，其对应于候选抗体或修饰的抗体的测试VH结构域序列；(b)确定在测试VH结构域序列内的氨基酸位置上的残基频率以获得共有评分；(c)确定在参考集序列内的相应氨基酸位置上的残基频率以确定平均共有评分；(d)比较共有评分与平均共有评分以确定序列评分；和(e)用序列评分预测候选抗体或修饰的抗体的稳定性，其中共有评分与候选抗体或修饰的抗体的稳定性直接相关。
在一个具体实施方式
中，参考集包含蛋白质序列，所述蛋白质序列来自带有与候选蛋白质类别相同的蛋白质折叠的蛋白质。在另一个具体实施方式
中，参考集包含直系同源序列(orthologous sequence)。在一个具体实施方式
中，参考集包含人序列，如人VH序列，诸如同一 Kabat类别的人VH序列。在一个具体实施方式
中，参考集包含人VH胚系序列。在一个具体实施方式
中，测试结构域序列是候选蛋白质的结构域序列的一部分。在一个具体实施方式
中，确定测试序列每个位置的共有评分，以获得总共有评分，其中总共有评分与蛋白质稳定性相关。在另一个具体实施方式
中，用以下公式计算总共有评分:
权利要求
1.稳定化ScFv分子群,其中所述稳定化scFv分子包含 i)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh结构域中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或 )插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中V1^P \结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子具有大于49° C的T5Q。
2.稳定化scFv分子,其包含 i)具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh位置44的氨基酸和\位置100的氨基酸之间的二硫键连接； ii)VH结构域和\结构域，其中该分子具有至少一个选自由如下所组成的组的替换: a)在VH的Kabat位置13上替换氨基酸； b)在VH的Kabat位置16上替换氨基酸； c)在VL的Kabat位46上替换氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替换氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替换氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替换氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替换氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替换氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替换氨基酸； k)在Kabat位置55上替换氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替换氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替换氨基酸； η)在VH的Kabat位置32上替换氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替换氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替换氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替换氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替换氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸； t)在VL的Kabat位置75上替换氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替换氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替换氨基酸；或 iii)带有位于scFv的VH和VL之间的稳定化界面的Vh结构域和\结构域，其中该分子在直接位于所述界面内的氨基酸位置上和/或在支撑VH和VL间相互作用的氨基酸位置上具有至少一个替换，其中该至少一个氨基酸位置选自由如下所组成的组:按照Kabat编号的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L,而且其中该稳定化scFv分子具有比缺少所述替换的scFv分子大的T5(l。
3.稳定化多价抗原结合分子群，其中所述稳定化结合分子包含至少一个稳定化scFv分子，其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中所述稳定化结合分子群包含单体的可溶蛋白，这种蛋白中不超过10%以聚集形式呈现。
4.稳定化多价抗原结合分子群，其中每个多价抗原结合分子包含 i)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头,其中Vh和Vl结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中至少一个scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或 ii)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头,其中Vh和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中多价抗原结合分子的至少一个scFv分子具有大于49° C的T5(l。
5.稳定化多价抗原结合分子，其包含 i)至少一个稳定化scFv分子,其包含插入Vh结构域和Vlj结构域之间的(Gly4Ser)nscFv接头，而且其中V1^P \结构域由二硫键连接； ii)至少一个稳定化scFv分子,其包含scFv接头,所述接头具有插入Vh结构域和Vlj结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \结构域由由Vh位置44的氨基酸和 '位置100的氨基酸之间的二硫键连接； iii)至少一个稳定化scFv分子,其中该稳定化scFv分子包含至少一个选自由如下所组成的组的替换: a)在VH的Kabat位置13上替换氨基酸； b)在VH的Kabat位置16置上替换氨基酸； c)在VL的Kabat位置46上替换氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替换氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替换氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替换氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替换氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替换氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替换氨基酸； k)在VH的Kabat位置55上替换氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替换氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替换氨基酸； η)在VH的Kabat位置3 2上替换氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替换氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替换氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替换氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替换氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸；t)在VL的Kabat位置75上替换氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替换氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替换氨基酸；或 iv)带有位于scFv的VH和VL之间的稳定化界面的\^结构域和Vlj结构域,其中该分子在直接位于所述界面内的氨基酸位置上和/或在支撑VH和VL间相互作用的氨基酸位置上具有至少一个替换，其中该至少一个氨基酸位置选自由如下所组成的组:按照Kabat编号的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L。
6.稳定scFv分子的方法，其包括用(Gly4Ser)nscFv接头通过基因工程将Vh结构域和Vl结构域融合，并改造Vh结构域使之在位置44的氨基酸上包含半胱氨酸和改造\结构域使之在氨基酸100位上包含半胱氨酸，从而形成稳定化scFv分子。
7.制备包含稳定化scFv分子的稳定化多价抗体的方法，该方法包括通过基因工程将稳定化scFv分子与抗体分子轻或重链的氨基末端或羧基末端融合。
8.制备稳定化scFv分子的方法，包括替换scFv分子的VH/VL界面中的至少一个氨基酸和/或替换支撑scFv分子的VH/VL界面的至少一个氨基酸，其中所述替换使scFv分子的VH结构域和VL结构域两者的热稳定性都比常规scFv分子的提高。
9.制备稳定化scFv分子的方法，包括替换VH结构域或VL结构域中的至少一个氨基酸，该氨基酸与位于所述VH和VL结构域之间界面上的两个或多个氨基酸一起变化。
10.制备含ScFv分子的稳定化融合蛋白的方法，包括替换scFv分子的VH/VL界面中的至少一个氨基酸和/或scFv分 子的VH/VL支架中的至少一个氨基酸，并通过基因工程将所述scFv分子与多肽融合，由此制备稳定化融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及稳定的多肽组合物。本发明至少部分基于开发由稳定化scFv组成或包含它的稳定化结合分子和制备这些稳定的分子的方法。
文档编号C12N15/13GK103073639SQ20121056303
公开日2013年5月1日 申请日期2007年3月19日 优先权日2006年3月17日
发明者斯蒂芬.德马雷斯特, 斯科特.格拉泽, 布赖恩.R.米勒, 吴秀凤, 威廉.B.斯奈德, 诺曼.王, 莉萨.J.克罗纳, 亚历克西.A.卢戈夫斯科伊 申请人:比奥根艾迪克Ma公司