专利名称：共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术生产门冬氨酸鸟氨酸的技术领域，涉及通过基因工程共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶，继而微生物酶法转化生产门冬氨酸鸟氨酸的方法。
背景技术：
门冬氨酸鸟氨酸，化学名称为(S)-2，5-二氨基戊酸-(S)-2-氨基丁二酸盐，是L-天门冬氨酸与L-鸟氨酸经过化学反应而形成的盐，分子式为C9H19N306。门冬氨酸鸟氨酸在体内形成门冬氨酸和鸟氨酸，直接参与尿素循环。鸟氨酸是尿素循环中的起始底物，是鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸合成酶的活化剂，与血液循环中氨等有毒代谢物结合，促进尿素合成，加速体内有毒物质特别是氨的代谢；天门冬氨酸则参与干细胞中谷氨酰胺和核酸的合成，既可促进肝脏内谷氨酰胺的合成，又间接参与三磷酸循环和核酸的合成，并提供能量代谢的中间产物，促进肝细胞自身的修护和再生，回复肝脏功能，增强肝脏解毒功能，从而能迅速降低体内异常升高的血氨浓度。门冬氨酸鸟氨酸有颗粒剂和注射剂两种剂型，最先于20世纪70年代在德国用于临床，1991年收载德国药典，并被美国FDA批准用于治疗肝性脑病。目前门冬氨酸鸟氨酸的制备方法主要可以归纳为两大类第一类，是以L-精氨酸为初始原料，采用化学或生物催化方法制备L-鸟氨酸中间体，继而加入L-天门冬氨酸，制备门冬氨酸鸟氨酸。德国专利(DE4020980)采用精氨酸酶催化精氨酸生成鸟氨酸，再与L-天门冬氨酸反应而得。但其所采用的精氨酸酶价格昂贵，工艺成本高，不具备工业化价值。中国专利(CN101843587A)以精氨酸为原料，加入氢氧化钡使精氨酸水解为鸟氨酸，再加入天门冬氨酸，搅拌反应后，加入钡离子沉淀剂以去除钡离子，再用有机溶剂进行重结晶。该方法引入钡离子和有机溶剂，污染环境且成本较高。第二类，是以L-鸟氨酸盐酸盐或硫酸盐为初始原料，采用树脂柱或化学方法获得游离L-鸟氨酸，继而与L-天门冬氨酸成盐。英国专利(GB965637)方法一是将L-鸟氨酸盐酸盐溶解于水，通过阳离子交换树脂获得游离L-鸟氨酸，再与L-天门冬氨酸在水溶液中，通过加入甲醇析出结晶，但此方法采用了离子交换树脂，操作复杂；方法二是梯度结晶，采用消旋的游离DL-鸟氨酸与L-天门冬氨酸先在水溶液中溶解，再加入甲醇析出D-鸟氨酸门冬氨酸盐，过滤后的母液继续加入甲醇，析出L-门冬氨酸-L-鸟氨酸盐，此方法梯度结晶不容易控制，得到的产品纯度较差，且成盐拆分收率低。英国专利(GB1067742)采用强酸性离子交换树脂来使L-鸟氨酸盐酸盐游离，再与L-天门冬氨酸成盐，经过结晶处理，最后得收率52%的L-鸟氨酸-L-天门冬氨酸盐一水合物。该方法采用树脂脱盐，且收率较低，不环保。欧洲专利(EP477991)将L-鸟 氨酸盐酸盐水溶液通过Diaion SKIB树脂吸附，氨水解吸附，脱氨后与L-天门冬氨酸成盐，加入甲醇回流处理，获得结晶，该方法同样具有污染环境、成本高等缺点。中国专利(CNlO 1798275A)将L-鸟氨酸醋酸盐溶解于水后，加入L-天门冬氨酸，然后用氨调PH至6-9，活性炭脱色，极性有机溶剂重结晶，该方法引入了大量的有机溶剂，成本较高。中国专利(CN101100435A)将L-鸟氨酸硫酸盐溶解于水中，加入L-天门冬氨酸，加热溶解后，用过量氢氧化钡中和硫酸，过滤，用树脂螯合残余的钡离子，过滤除去树脂，减压浓缩溶液，活性炭脱色，无水乙醇结晶制得，该方法引入了剧毒的钡离子，且需采用树脂去除金属离子，操作工艺复杂，耗时长。中国专利(CN102475697A)以L-鸟氨酸盐酸盐为原料，加入氢氧化钠，然后加入天门冬氨酸反应后，采用纳滤技术一步实现脱盐、浓缩，浓缩液加入极性有机溶剂进行重结晶。酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素，反应式见图1。不过，精氨酸酶的来源不易。传统的酶法采用的精氨酸酶一般提取自动物的肝脏，或者来自某些微生物菌株体内，直接以微生物细胞作为转化体系来生产鸟氨酸。这些菌株的生长周期一般不少于24h，且由于其自身表达酶活水平有限，在转化体系中添加一定量的酶源细胞后，势必转化后的分离提取工艺相对繁琐。生物酶法是目前工业上合成L-天门冬氨酸的主要方法。其原理见图2，是利用天门冬氨酸酶催化延胡索酸和氨加成反应生成L-天门冬氨酸。该方法具有收率高、光学纯度 高的优点。生物酶法又可分为固定化细胞法(也称固定化酶法)和游离细胞法(游离酶法)。与固定化细胞法生产L-天门冬氨酸相比，游离细胞法工艺流程简洁、设备投资少、生产成本低，具有较强的市场竞争力。综上，现有的天门冬氨酸鸟氨酸的制备方法存在以下不足化学合成方法，都经过了一个鸟氨酸盐酸盐、醋酸盐或硫酸盐的中间体，增加了反应的操作过程，降低了收率。且由于引入的C1_、CH3C00_或S042_等离子杂质，给产物的分离纯化带来麻烦，增加了成本。而以L-精氨酸为初始原料的方法中，酶法所采用的精氨酸酶价格昂贵，工艺成本高，不具备工业化价值。化学法引入钡离子和有机溶剂，污染环境且成本较高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种新的天门冬氨酸鸟氨酸制备方法，该方法操作简便、成本低廉、绿色环保。本发明提供的共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法包括首先PCR扩增来源于枯草芽孢杆菌的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法构建重组表达质粒pET-20b (+) -asp ;然后以pET-20b (+) -asp为模板，PCR扩增获得产物为5 ’端带有T7启动子和rbs序列的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，将该基因克隆到pET-24a(+) -arg中，获得重组质粒pET_24a(+)-arg-asp ;将重组表达载体转化至E. coliBL21 (DE3)，获得共表达基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a (+)-arg-asp。以该重组菌为酶源，在同一个反应体系中，分别催化底物L-精氨酸和延胡索酸铵，其中底物L-精氨酸的用量为O.1至lmol/L，延胡索酸铵的用量为O.1至lmol/L，菌体的添加量为4_6g/L，在30至45°C下，pH8至10,以lmmol/L无水硫酸镁为辅助因子,经酶法转化反应4至12h,生成L-鸟氨酸和L-天门冬氨酸；收集转化液后，通过I万截留分子量中空纤维素柱去除大分子量杂质及活性炭脱色，最后减压浓缩，加入3倍体积无水乙醇，冰水浴搅拌冷却析出，收集沉淀得天门冬氨酸鸟氨酸。酶促反应液中，底物L-精氨酸的用量优选为lmol/L，底物延胡索酸铵的用量优选为lmol/L，菌体细胞的添加量优选为5g/L，优选转化温度为37°C，优选转化pH9，优选转化时间12h。所述的共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的基因工程重组菌为大肠杆菌BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp,表达载体为 pET24a (+) -arg-asp 重组表达载体,重组菌体细胞能同时表达有高活性的精氨酸酶和天门冬氨酸酶。其中，菌体细胞的精氨酸酶活力可达560U/g，天门冬氨酸酶活力可达490U/g。本发明的优点和有益效果本发明利用自行构建的高效共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌株BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp的发酵菌体为酶源，在同一个反应体系中，双酶分别催化底物L-精氨酸和延胡索酸铵，生成L-鸟氨酸和天门冬氨酸。产物经过中空纤维素柱过滤和活性炭脱色、减压浓缩，最后加入无水乙醇结晶析出天门冬氨酸鸟氨酸。该方法具 有生产成本低、条件温和、周期短、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，为天门冬氨酸鸟氨酸提供了新的绿色环保制备方法，具有很好的产业化应用前景。
图1是精氨酸酶催化L-精氨酸生成L-鸟氨酸的反应示意图；图2是天门冬氨酸酶催化延胡索酸铵生成L-天门冬氨酸的反应示意图；图3是以本发明构建的基因重组菌菌体为酶源考察底物L-精氨酸和延胡索酸铵的转化率；A :反应温度与底物转化率的关系；B :pH与底物转化率的关系；C :反应时间与底物转化率的关系；D :菌体添加量与底物转化率的关系；E :底物浓度与转化率的关系。图4是天门冬氨酸鸟氨酸的薄层层析图谱。其中，第I道L_鸟氨酸标准品；第2道=L-天门冬氨酸标准品；第3道天门冬氨酸鸟氨酸标准品；第4道样品。
具体实施例方式一、L-精氨酸酶活力的测定采用化学显色法测定L-精氨酸酶活力，原理是在一定条件下，L-精氨酸酶催化L-精氨酸，生成L-鸟氨酸，利用鸟氨酸能与茚三酮反应生成一种红色物质，该物质在510nm处有最高吸收峰。在一定范围内，红色的深浅与L-鸟氨酸含量成正比，与同样处理的L-鸟氨酸标准液比色，求得酶活力。具体操作过程如下( I)标准曲线的建立用50mL混酸溶液(6M磷酸醋酸=1 :3)溶解1. 25g茚三酮配制O. 25g/L的显色溶液，分别配制0、0. 04,0. 08,0. 12,0. 16,0. 2mM的L-鸟氨酸500 μ L，加入2mL茚三酮显色溶液，沸水浴Ih后510nm测定吸光度，以L-鸟氨酸浓度为横坐标，510nm吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。(2)精氨酸酶活力的测定催化体系25mMGlycine-NaOH pH9. 5, ImM MnCl2,0_20mM 的 L-精氨酸,一系列梯度浓度的实施例2得到的湿菌体，37°C催化反应lh。
酶活力定义在上述反应条件下，于37°C，lmin催化形成Ιμπιο L-鸟氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。二、L-天门冬氨酸酶活力的测定于20mM PBS pH8. 5，ImM MgCl2, 20mM的延胡索酸铵，加入一系列梯度浓度的实施例2得到的湿菌体，37°C催化反应30min。然后立即置于沸水中煮沸5min以终止反应。空白样品采用预先煮沸过的大肠杆菌细胞代替酶源细胞进行同样操作。离心，取0.2mL上清液，加入20mL蒸馏水，5mL浓硫酸，混匀后加热至沸腾，然后用O.1M的KMnO4标准溶液滴定至30s不褪色为终点。空白和样品滴定值之差为延胡索酸的消耗量。根据不同浓度延胡索酸标准液绘制的标准曲线计算出延胡索酸的转化量。酶活力定义在上述反应条件下，于37°C，Imin催化消耗I μ mo I延胡索酸所需要 的酶量为一个酶活力单位。三、天门冬氨酸鸟氨酸的薄层层析法检测薄层层析条件分别为，展开剂是正丙醇氨水=2 :1，显色液是4g/L的茚三酮乙醇溶液，显色温度105°C，显色时间5min。实施例1共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌的构建根据NCBI数据库收录的大鼠的精氨酸酶基因序列，设计上游引物argl 5’-GGAATTCCATAT GAG CTC CAAGCC AMGCC-3’和下游引物arg2 :5’_CCC GAATTC TTATTTCGGTGG TTT A-3’。提取大鼠肝脏总RNA，反转录制备cDNA。以大鼠肝脏cDNA为模板，PCR扩增得到精氨酸酶基因。采用基因工程方法，构建重组表达质粒pET-24a(+)-arg。将重组表达载体pET-24a(+)-arg转化至E. coli BL21 (DE3)，获得基因工程菌株Argl。根据NCBI数据库收录的枯草芽孢杆菌的天门冬氨酸酶基因序列，设计上游引物 aspl :5’ -GGG AAT TCC ATA TGT TAA ACG GCC AAA AAG-3’ 和下游引物 asp2 :5’ -CCGCTCGAG TTA TTT TTC TAA TAG TTC-3，。提取枯草芽孢杆菌的基因组，PCR扩增得到天门冬氨酸酶基因。采用基因工程方法，构建重组表达质粒pET-20b(+)-asp。将重组表达载体pET-20b (+) -asp 转化至 Ε· coIi BL21 (DE3)，获得基因工程菌株 Aspl。为了同时实现精氨酸酶和天门冬氨酸酶在重组大肠杆菌中的高水平表达，首先以 pET-20b(+)-asp 为模板，设计上游引物为 T7f :5’ -AAG GAAGAG CTC TAATAC GACTCACTATAG-3’ 和下游引物 asp2 :5’ -CCG CTC GAG TTATTT TTC TAATAG TTC-3’。PCR 扩增获得产物为5’端带有T7启动子和rbs序列的天门冬氨酸酶基因。然后采用基因工程方法，将该基因克隆到pET-24a (+) -arg中，获得重组质粒pET_24a (+) -arg-asp。将重组表达载体转化至 E. co I i BL21 (DE3)，获得共表达基因工程菌株 BL21 (DE3) -pET24a (+) -arg-asp。将阳性重组菌株接种于4mL含有卡那霉素100 μ g/mL的LB培养基中过夜培养，随后以1%转接量接入IOOmL含有卡那霉素100 μ g/mL的新鲜LB培养基中，37°C振荡培养3h，然后，加入终浓度为ImM的IPTG诱导液，特异性诱导精氨酸酶和天门冬氨酸酶的表达。所得培养液于4°C下6，OOOrpm离心lOmin，收集菌体，获得共表达L-精氨酸酶和天门冬氨酸酶的基因工程重组菌，用50mM的磷酸缓冲液(pH8. O)悬浮洗涤后再离心，收集菌体作为酶源细胞。实施例2共表达基因工程重组菌的发酵将实施例1中的共表达基因工程菌株BL21 (DE3)_pET24a(+)-arg-asp接种于4mL含100 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中过夜培养作为一级种子液；随后以1%转接量接入IOOmL含100μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，于37°C，200rpm培养8-12h作为二级种子液；二级种子液以1%接种量转接于100L发酵罐中，发酵培养基为新鲜的LB培养基，培养温度37°C，初始转速300rpm，初始pH7. 2。定时取样，菌液0D600nm达到1. 0-1. 2时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导液诱导。下罐发酵液4°C下3，OOOrpm离心15min收集菌体细胞，得到共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞。按方法一测定，精氨酸酶活力可达560U/g ;按方法二测定,天门冬氨酸酶活力可达490U/g。实施例3共催化体系中温度的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入菌体5g/L,底物L-精氨酸100mmol/L,延胡索酸铵100mmol/L,无水硫酸镁lmmol/L,转化pH值9，转化时间lh。考察转化温度30-45°C时两个催化反应各自底物L-精氨酸和延胡索酸的转化率的影响。结果见图3A。实施例4共催化体系中pH的考察 以上述实施例2制备的发酵菌体细胞作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入菌体5g/L，底物L-精氨酸lOOmmol/L，延胡索酸铵lOOmmol/L，无水硫酸镁ImM，转化温度为37°C，转化时间lh。考察转化pH值8-10时两个催化反应各自底物L-精氨酸和延胡索酸的转化率的影响。结果见图3B。实施例5共催化体系中反应时间的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入菌体5g/L，底物L-精氨酸lmol/L，延胡索酸铵lmol/L，无水硫酸镁lmmol/L，转化温度为37°C，转化pH值为9。考察转化时间对两个催化反应各自底物L-精氨酸和延胡索酸的转化率的影响。结果见图3C。实施例6共催化体系中菌体量的考察以上述实施例2制备的发酵菌体细胞作为酶原，分别在每升的转化体系中，加入底物L-精氨酸lmol/L，延胡索酸铵lmol/L，无水硫酸镁lmmol/L，转化温度为37°C，转化pH值为9，转化时间12h。考察菌体添加量对两个催化反应各自底物L-精氨酸和延胡索酸的转化率的影响。结果见图3D。从结果可见，以ImM无水硫酸镁为辅助因子，在30-45°C，pH值为8_10，菌体量为4_6g/L，反应4-12h，共表达系统的精氨酸酶和天门冬氨酸酶可以分别催化各自底物，生产L-鸟氨酸和L-天门冬氨酸。同时，通过分析实验结果，结合考虑实际操作以及成本，优选的转化条件为L-精氨酸1M，延胡索酸铵1M，无水硫酸镁ImM，菌体量5g/L，反应温度37°C，pH值9，反应时间12h。在该优选条件下进行验证实验，L-精氨酸和延胡索酸的转化率分别为99% 和 98. 5%ο实施例7天门冬氨酸鸟氨酸盐的提取分离转化液反应结束后，于4000rpm离心15min收集上清液；然后采用I万截留分子量的中空纤维素柱去除大分子量杂质；收集液按照0. 5% (质量体积比)加入活性炭，于60°C脱色30min ;过滤去除活性炭后，在75°C下旋转蒸发至饱和溶液，然后加入3倍体积的无水乙醇，冰水浴中搅拌；采用真空泵抽滤样品，将析出物真空干燥，得到天门冬氨酸鸟氨酸 ’最后，称重，采用薄层层析法检测产品，结果见附图4。
权利要求
1.一种共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于该方法包括 首先PCR扩增来源于枯草芽孢杆菌的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法构建重组表达质粒pET-20b (+) -asp ;然后以pET-20b (+) -asp为模板，PCR扩增获得产物为5 ’端带有T7启动子和rbs序列的天门冬氨酸酶基因，采用基因工程方法，将该基因克隆到pET-24a (+) -arg中，获得重组质粒pET_24a (+)-arg-asp ;将重组表达载体转化至E. coliBL21 (DE3)，获得共表达基因工程菌株BL21 (DE3)-pET24a(+) -arg-asp,该重组菌体细胞能同时表达有高活性的精氨酸酶和天门冬氨酸酶； 以该重组菌为酶源，在同一个反应体系中，分别催化底物L-精氨酸和延胡索酸铵，其中底物L-精氨酸的用量为O.1至lmol/L，延胡索酸铵的用量为O.1至lmol/L，菌体的添加量为4-6g/L，在30至45°C下，pH8至10，以lmmol/L无水硫酸镁为辅助因子，经酶法转化反应4至12h，生成L-鸟氨酸和L-天门冬氨酸，收集转化液后，通过I万截留分子量中空纤维素柱去除大分子量杂质及活性炭脱色，最后减压浓缩，加入3倍体积无水乙醇，冰水浴搅拌冷却析出，收集沉淀得天门冬氨酸鸟氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶促反应液中，底物L-精氨酸的用量优选为lmol/L，底物延胡索酸铵的用量优选为lmol/L，菌体细胞的添加量优选为5g/L，优选转化温度为37°C，优选转化pH9，优选转化时间12h。
全文摘要
一种共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶制备门冬氨酸鸟氨酸的方法。本发明采用基因工程方法，构建能高效共表达精氨酸酶和天门冬氨酸酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET24a(+)-arg-asp，以发酵菌体细胞为酶源，在同一个反应体系内，双酶分别催化底物L-精氨酸、延胡索酸铵反应，生成L-鸟氨酸和L-天门冬氨酸，转化液收集后通过1万截留分子量中空纤维素柱去除大分子量杂质及活性炭脱色、减压浓缩，加入无水乙醇，冰水浴搅拌冷却析出得天门冬氨酸鸟氨酸。本发明提供了一种新的门冬氨酸鸟氨酸的绿色生产工艺方法，该方法具有条件温和、周期短、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，有很好的产业化应用前景。
文档编号C12N15/63GK103014087SQ201210575299
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者高智慧, 丁国钰 申请人:天津启仁医药科技有限公司