专利名称：一种制备肌氨酸氧化酶的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程技术高效制备肌氨酸氧化酶的方法，产物可用于生产肌氨酸检测试剂盒。
背景技术：
美国密歇根大学安阿伯分校辛莱岩(Chinnaiyan)等发表在2009年2月12日《自然》杂志(Nature 2009,457 :910)上的研究称，一种名为肌氨酸(sarcosine，亦名N-甲基甘氨酸，甘氨酸的代谢物)的物质可有效反映前列腺癌的侵袭性，辨别癌细胞的生长行为(缓慢生长还是高度侵袭)。该研究的另两个重要发现是肌氨酸参与了前列腺的癌变过程，是细胞癌变的元凶之一；尿肌氨酸检测诊断前列腺癌的准确性优于目前临床上常用的血前列腺特异性抗原(PSA)检测。研究者发现，至少有6种代谢物的水平在良恶性前列腺组织中存在显著差异，其中又以肌氨酸最为显著。肌氨酸水平在良性前列腺中极低，在局限性前列腺癌中呈现大幅升高，在转移性前列腺癌中则升得更高。目前用于检测肌氨酸的方法主要有液相色谱或气象色谱与质谱联用检测法、肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法、肌氨酸氧化酶分光光度检测法。色谱-质谱联用检测法虽然检测灵敏度、准确度、精密度均较高，但由于色谱-质谱设备昂贵，检测成本较高，检测速度慢，很难大批量检测，且操作复杂一般人很难掌握。因此，常应用于科研，很难应用临床大样本量诊断检测。肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法其检测灵敏度、准确度、精密度略低于色谱-质谱联用检测法，但也可满足临床的需求。此两种方法的检测成本较色谱-质谱联用检测法已大大降低，但在检测时仍需购置专门的检测装置，如荧光检测器、毛细光电泳仪等专门设备。并且人工操作的部分很高，对应用于常规临床检测来讲仍有一定的难度。肌氨酸氧化酶分光光度检测法，其检测成本低、可应用于目前任何一种全自动生化分析仪，可应用于临床高速大样本量的检测需要。检测原理
权利要求
1.一种制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，该方法包括 1)改造并全基因合成人源化肌氨酸氧化酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子； 2)将步骤I)中改造后的肌氨酸氧化酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达； 3)将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导； 4)所得菌体破菌，离心分离，过N1-NTA柱纯化； 其中，步骤I)中改造后的全基因合成人源化肌氨酸氧化酶编码基因序列为 ATGGCTTCTT CTACTGGTGA TCGTTCTCAG GCTGTTCGTC ATGGTCTGCG TGCGAAAGTT CTGACCCTGG ACGGCATGAA CCCGCGTGTT CGTCGCGTCG AATACGCCGT GCGTGGCCCG ATCGTTCAGC GTGCTCTGGA ACTGGAACAA GAACTGCGTC AGGGCGTTAA AAAGCCGTTC ACCGAGGTTA TCCGCGCCAA CATCGGCGAT GCCCAGGCTA TGGGTCAGCG TCCTATCACC TTCCTGCGCC AGGTCCTGGC GCTGTGCGTA AACCCAGACC TGCTGAGCTC TCCGAACTTC CCGGACGACG CTAAGAAACG TGCGGAACGC ATCCTGCAGG CATGCGGTGG CCACAGCCTG GGCGCTTACA GCGTTTCCTC CGGTATCCAG CTGATTCGTG AAGATGTTGC CCGTTACATC GAGCGCCGTG ATGGCGGTAT CCCGGCGGAC CCTAACAACG TATTCCTGTC TACCGGTGCG TCCGATGCCA TTGTTACCGT TCTGAAGCTG CTGGTGGCTG GCGAGGGTCA CACCCGTACC GGTGTCCTGA TTCCGATTCC ACAGTATCCG CTGTATTCTG CTACTCTGGC TGAACTGGGT GCGGTGCAGG TAGACTATTA CCTGGATGAG GAGCGCGCTT GGGCGCTGGA CGTCGCAGAG CTGCACCGCG CACTGGGCCA GGCACGTGAC CACTGCCGTC CGCGTGCGCT GTGCGTGATT AACCCGGGCA ACCCGACGGG CCAAGTTCAG ACCCGTGAAT GCATCGAAGC TGTGATTCGT TTTGCTTTCG AAGAACGTCT GTTCCTGCTG GCGGACGAAG TTTATCAGGA CAACGTTTAC GCAGCCGGTA GCCAGTTTCA TTCTTTCAAG AAAGTTCTGA TGGAAATGGG TCCGCCGTAT GCGGGTCAGC AAGAACTGGC ATCCTTCCAC TCTACCTCCA AAGGTTATAT GGGTGAGTGT GGCTTCCGTG GTGGTTATGT TGAAGTAGTT AATATGGACG CGGCTGTGCA GCAGCAGATG CTGAAGCTGA TGTCTGTGCG CCTGTGCCCG CCTGTGCCGG GTCAAGCCCT GCTGGATCTG GTTGTGTCTC CGCCTGCTCC GACTGATCCG TCCTTCGCAC AATTCCAGGC TGAGAAACAG GCCGTTCTGG CGGAACTGGC AGCGAAAGCC AAACTGACGG AACAAGTGTT CAACGAAGCG CCGGGTATCT CCTGCAATCC GGTACAAGGC GCGATGTATA GCTTCCCGCG CGTTCAGCTG CCGCCACGCG CAGTAGAACG TGCACAGGAA CTGGGCCTGG CTCCGGACAT GTTCTTCTGT CTGCGCCTGC TGGAAGAAAC CGGTATTTGC GTTGTACCTG GCAGCGGCTT CGGTCAACGT GAAGGTACTT ACCACTTCCG TATGACCATC CTGCCTCCGC TGGAAAAACT GCGTCTGCTG CTGGAAAAGC TGTCCCGTTT TCACGCGAAA TTCACTCTGG AATATTCTTA G
2.如权利要求1所述制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述表达载体为pRSF Duet, pET表达系列。
3.如权利要求1所述制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤2)中所述大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)，Rosetta (DE3)。
4.如权利要求3所述制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，所述BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体的基因。
5.如权利要求4所述制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，λ噬菌体DE3区含有Τ7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上形成所述BL21 (DE3)。
6.如权利要求1所述制备肌氨酸氧化酶的方法，其特征在于，步骤4)中所述破菌方法为高压破碎、超声或者溶菌酶酶解。
7.一种利用权利要求1所述制备肌氨酸氧化酶的方法制成的产物作为诊断试剂用于肌氨酸检测试剂盒的研制。
全文摘要
本发明公开了一种制备肌氨酸氧化酶的方法，该方法包括改造全基因合成人源化肌氨酸氧化酶编码基因序列，去除大肠杆菌稀有密码子；将改造后的肌氨酸氧化酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达；将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导；所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化；本发明制备肌氨酸氧化酶操作非常简单，制备成本低，成品产率高，纯度高而且具有高生物活性，作为诊断试剂用于肌氨酸检测试剂盒的研制。
文档编号C12N9/06GK103013941SQ20121057848
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者刘明, 王萌, 张传宝, 肖飞, 王大光 申请人:卫生部北京医院