专利名称：一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物发酵生产薯蓣皂素的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备薯蓣皂素的方法，特别是一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法。属于生物提取技术领域。
背景技术：
从黄姜中提取薯蓣皂苷元(皂素)最常用的方法就是酸水解法，这种最早的生产工艺存在水解不完全、收率低(得率一般仅在1.7%左右)、废水量巨大和严重污染环境等诸多问题。目前各个企业采用改进后的自然发酵和酸水解法耦联的方法。自然发酵通过黄姜自身内源酶的酶解作用，使一部分呋茁醇皂素转化为螺茁醇皂素，后者更易转化为薯蓣皂苷元。因此这种耦联的方法生产皂素，其产率比直接酸水解法可提高10°/Γ25%。但由于有多种微生物参与发酵和转化，体系内酶种类复杂，随着发酵时间的延长，则可能生成皂苷元酮而使提取物中杂质增多，熔点降低，且依然存在酸水解不完全、收率低(得率一般仅在1.8%左右)、废水量巨大和严重污染环境等诸多问题。为解决上诉现状问题，国内多家科研单位选择利用微生物发酵的方法进行薯蓣皂素的微生物转化。其中使用的微生物菌种主要以霉菌为主，据不完全统计，这些霉菌菌种覆盖杂色云芝versicolor),小克银汉霉属iCunnonghamelIa)，毛霉属iMucor)，黑曲霉(AspergiIIus niger),黄曲霉(AspergiIIus fIavus),米曲霉(AspergiIIusoryzae ), 土曲霉(AspergiIlus terreus ),烟曲霉(AspergiIlus fumiga tus )和青霉属(Penicillium)等多个不同的属或种的霉菌菌株。利用霉菌产酶进行薯蓣皂苷水解，其劣势在于酶的水解特异性较差，而且霉菌本身的生长周期也决定了发酵周期的长期性(目前报道多为5-7)，另外黄姜的多糖成分降解程度低，增加了后续的提取难度，使生产成本偏高，因此难于应用于工业化生产。为此，人们又提出酶解发酵法，即在黄姜粉碎调浆后，加入一定量的淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等进行酶解，后接入霉菌种子液进行液体发酵，生产薯蓣皂素.这种方法利用多种酶液降解淀粉，纤维素等多糖成分，解除淀粉等对薯蓣皂苷产生的“包裹”与“屏蔽”作用，使其更能充分水解。但由于大量使用酶制剂，使生产成本大幅度提高，使酶解发酵法离工业化生产相去甚远。总之，虽然微生物转化法生产薯蓣皂素代表皂素行业发展的一个新方向，但由于筛选菌种种类的单一化(仅限于霉菌菌株)和实验菌种的酶解效率低等问题，使这一方法迟迟未能突破实验室的瓶颈而进入工业化应用。因此如何筛选出酶解薯蓣皂苷效率高，处理能力强(干姜粉与水的混合比例高)且能同时降解黄姜多糖成分(减低后续提取成本)的微生物菌株是微生物酶解转化法生产薯蓣皂素的关键所在
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，解决微生物转化法生产薯蓣皂素的瓶颈问题，本发明旨在提供一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法。该方法水解完全，生产薯蓣皂素的效率高，处理能力强且成本低，有望实现大规模工业化生产。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为:一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物发酵生产薯蓣皂素的方法，其特征是:将黄姜干粉和自来水按质量体积比1:5 12的比例混合，并补入为黄姜干粉质量4.0%的尿素、为黄姜干粉质量1.0%的酵母提取物和为自来水体积0.2%的无机盐,配成转化衆液,接入体积约为自来水体积5%的芽孢杆菌属Qiaccilus)菌株XBT2011种子液，在培养温度40°C，控制pH 6.0,搅拌速度为30(T400rpm，通气条件为2.5 4.0 Ι/min的培养条件下转化56 72hrs，转化浆液经过滤，干燥得到水解物，水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，经反复结晶得到薯蓣皂素成品；所述的rpm为转/分钟，hrs为小时；所述芽孢杆菌属{Baccilus)菌株XBT2011的保藏号:CGMCCN0.6301。在转化过程中，每隔6hrs从发酵罐中取5ml转化液检测薯蓣皂素转化情况；向液样中加入2倍液样体积的水饱和正丁醇试剂，超声波超声20min后高速离心5min，取上清液至坩埚中于100°C烘干，再向坩埚中加一倍液样体积的甲醇溶液，经反复溶解后过滤，取适量滤液点样于薄层层析板上，用体积比为7:3:0.5的氯仿/甲醇/水展开剂展开，喷IOml质量百分比浓度10% H2SO4溶液加热显色，与薯预皂苷元标品对照，观察薯蓣总皂苷的水解程度和薯蓣皂苷元转化程度；培养浆液经工业滤布过滤，于85°C烘干得到水解物，水解物用约一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，并添加工业用活性炭除色素，经反复结晶得到薯蓣皂素成品。该方法中所得水解物干重，为所添加黄姜干粉干重28 33%，薯蓣皂素得率在2.7 3.05%。所述的无机盐为NaCl、MgS04、k2HP04、FeSO4和CaCl2的混合物。所述的无机盐是由质量体积百分比分为0.1% NaCU0.05%MgS04、0.05%k2HP04、
0.005%FeS04 和 0.001%CaCl2 组成。所述种子液的制备为取5ml菌体密度在IO8 109/ml的aryabhattaiXBT2011悬液接种于150ml种子培养液中，在40°C，200rpm的摇瓶培养条件下培养14hrs制得；其中所述的种子培养液是由以下成分按下述质量体积百分比组成:黄姜干粉5%、尿素 0.3%、酵母提取物 0.1%、Na Cl 0.1%、MgSO4 0.05%、k2HP04 0.05%、FeSO4 0.005%、CaCl20.001%。本技术的优点是:为彻底改变皂素行业的生产现状，经大量艰苦的筛选工作，从102个不同土样中反复富集筛选，从近10000株菌株得到450株候选菌株，再经转化效率复筛最终遴选了 3株理想菌株。其中一株经鉴定为芽孢杆菌属{Baccilus)的菌株XBT2011，于2012年06月27日保藏，保藏单位名称:中国科学院微生物研究所，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101 ;保藏编号:CGMCC N0.6301，分类命名:阿氏芽孢杆菌{BadIlus aryabha t tai)。经过约40次5L发酵罐(Sartorius, Germany)实验，将黄姜干粉和自来水按质量体积比1:5 12的比例混合，并补入为黄姜干粉质量4.0%的尿素、为黄姜干粉质量1.0%的酵母提取物和为自来水体积0.2%的无机盐，配成转化浆液，接入体积约为自来水体积5%的芽孢杆菌属mccilus)菌株XBT2011种子液，在培养温度40°C，控制pH 6.0左右，搅拌速度为30(T400rpm，通气条件为2.5 4.0 Ι/min的培养条件下转化56 72hrs，转化浆液经过滤，干燥得到水解物，水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，经反复结晶得到薯蓣皂素成品。所得水解物干重，为所添加黄姜干粉干重28 33%，薯蓣皂素得率在2.7 3.05%。本工艺方法可使薯蓣总皂苷接近完全转化成薯蓣皂苷元，处理量达到工业化水平，所产生的废液量约为目前工业化现状的1/3，且不含糖分，pH接近于中性，可最大限度地降低环境污染。与最近公告的专利CN101012474B相比较，本发明在国内第一次选用细菌菌株作为薯蓣皂苷转化菌种，该菌株不仅酶解薯蓣总皂苷完全，转化生产薯蓣总皂苷元效率高，其主要的优势在于能最大程度地提高黄姜处理量(黄姜干粉和水以质量体积比为1:5进行混合)，接近工业生产的实际处理水平，是专利CN101012474B提及的黄姜料液浓度的近7倍，因而能降低转化成本，最大限度减少废水的生成量，有望实现大规模工业化生产。下面通过给出的具体实施例可以进一步清楚的说明本发明，但不作为对本发明的限定。
具体实施例方式一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物发酵生产薯蓣皂素的方法，其特征是:将黄姜干粉和自来水按质量体积比1:5 12的比例混合，并补入为黄姜干粉质量4.0%的尿素、为黄姜干粉质量1.0%的酵母提取物和为自来水体积0.2%的无机盐，配成转化浆液，接入体积为自来水体积5%的芽孢杆菌属{Baccilus)菌株XBT2011种子液，在培养温度40°C，控制pH 6.0，搅拌速度为30(T400rpm，通气条件为2.5 4.0 Ι/min的培养条件下转化56 72hrs，转化浆液经过滤，干燥得到水解物，水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs,经反复结晶得到薯菌阜素成品；所述的rpm为转/分钟，hrs为小时；所述芽孢杆菌属(Baccilus)菌株 XBT2011 的保藏号:CGMCCN0.6301。实施例1 种子液的制备
取 5ml 菌体密度在 IO8 109/ml 炫^Bacillus aryabhattai XBT2011 悬液接种于 150ml种子培养液中，在40°C，200rpm的摇瓶培养条件下培养14hrs制得种子液。其中种子培养液是由以下成分按下述质量体积百分比组`成:黄姜干粉5%、尿素0.3%、酵母提取物0.l%、NaCl 0.1%、MgSO4 0.05%、k2HP04 0.05%、FeSO4 0.005%、CaCl2 0.001%。转化浆液的制备
加500g黄姜干粉和3000 m L自来水水于5L发酵罐中，并添加尿素20g，酵母提取物
5.0g, NaCl 3.0g, MgSO4 1.5g，k2HP04 1.5g，FeSO4 0.15g，CaCl2 0.03g 成分，其中无机盐为自来水体积0.2%，调ρΗ7.0±0.2。于121°C，0.1Mpa压力条件下灭菌15min (分钟)。薯蓣皂素的转化
向已灭菌的转化衆液中接入上述种子液150ml,于40°C, 350rpm转速和3.0 L/min通气条件下培养。实验过程中，间歇性地流加20%氨水控制pH于6.0左右，同时流加约5ml消泡剂控制泡沫产生。培养转化64hrs至薯蓣皂素转化完全后放罐。培养浆液经工业滤布过滤，于85°C烘干得到水解物干重155.Sg，为所添加黄姜干粉干重的31.1%。水解物用约一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，并添加工业用活性炭除色素，经反复结晶得到薯蓣皂素成品14.5g，薯蓣皂素成品得率为2.9%，RP-HpLC测定其薯蓣皂素含量为95.6%。所述的rpm为转/分钟,hrs为小时；所述芽孢杆菌属iBaccilus)菌株XBT2011的保藏号:CGMCCN0.6301。
在转化过程中，每隔6hrs从发酵罐中取5ml转化液检测薯菌阜素转化情况。向液样中加入2倍液样体积的水饱和正丁醇试剂，超声波超声20min后高速离心5min，取上清液至坩埚中于100°C烘干，再向坩埚中加一倍液样体积的甲醇溶液，经反复溶解后过滤，取适量滤液点样于薄层层析板上，用体积比为7:3:0.5的氯仿/甲醇/水展开剂展开，喷约IOml质量百分比浓度10% H2SO4溶液加热显色，与薯蓣皂苷元标品对照，观察薯蓣总皂苷的水解程度和薯蓣皂苷元转化程度。薄层层析结果显示，随着薯蓣总皂苷的转化，总皂苷色斑逐渐变浅以至于消失，同时薯蓣皂苷元的色斑显色愈加明显，转化64hrs后可使薯蓣总皂苷的色斑完全消失。薯蓣皂素结构的检测
取0.5g上述水解物用2ml氯仿超声辅助提取，将提取液过滤后取适量滤液点样于薄层层析板上，用体积比为9:1的氯仿/丙酮展开剂展开，喷约IOml质量百分比浓度10%H2SO4溶液加热显色，与标品薯蓣皂苷元的色斑进行对照，结果显示转化薯蓣皂苷元与标品薯蓣皂苷元色斑的Rf值完全一致。取少量样品于80°C烘干后，与KBr研磨压片制样，用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000 — 400cm-10实验结果表明薯蓣皂苷元标准品和薯蓣皂素成品红外光谱图一致。将少量样品装入坩埚内，AL2O3坩埚作为参比坩埚。采用高纯氮气作为保护气及吹扫气，两者流量调整为30mL/min，热解炉升温速率为5°C /min。样品从室温升至250°C，同时高纯氮气将分解产物吹扫出热解炉，记录热重曲线和差示扫描量热曲线，从差示扫描量热(DSC)曲线可以看出，薯蓣皂素成品熔点温度为20(T203°C。根据以上检测结果可以确认黄姜薯蓣总皂苷经细菌菌株XBT2011转化后，其转化产物为薯预皂苷元。薯蓣皂苷元含量的测定方法(反相高效液相色谱RP-HpLC): AgilentllOO高效液相色谱系统；色谱柱:ZorbaxC18 (150mmX4.6mm1.d.),流动相:甲醇 / 水=90/10 (v/v),检测波长:210nm,流速:lmL/min,柱温为常温。实施例2
同实施例1基本相同，不同之处是:
加600g黄姜干粉和3000 m L自来水于5L发酵罐中，添加尿素25g，酵母提取物6.0g,NaCl 3.0g, MgSO4 1.5g，k2HP04 1.5g, FeSO4 0.15g, CaCl2 0.03g 等成分配成转化浆液，其中无机盐为自来水体积0.2%。向灭菌的转化浆液接入培养14hrs的XBT2011菌株种子液200ml,在40°C，400rpm，3.5 1/min，控制pH 6.0的培养条件下转化72hrs。转化浆液经过滤，干燥，最终得到水解物干重198.7g,为所添加黄姜干粉干重的33.1%。水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，并添加工业用活性炭除色素，经反复结晶得到薯蓣皂素成品16.5g，薯蓣皂素得率为2.7%，RP-HpLC测定其薯蓣皂素含量为95.6%。实施例3
同实施例1 2基本相同，不同之处是:
加250g干黄姜粉和3000 m L水于5L发酵罐中，添加尿素10g，酵母提取物2.5g，NaCl
3.0g, MgSO4 1.5g, k2HP04 1.5g, FeSO4 0.15g, CaCl2 0.03g 等成分配成转化浆液，其中无机盐为自来水体积0.2%。向灭菌的转化浆液接入培养14hrs的XBT2011菌株种子液200ml，于40°C，300rpm，2.5 1/min，控制pH 6.2的培养条件下转化56hrs。培养浆液经过滤，干燥得到水解物干重70.5g,为所添加黄姜干粉干重的28.2%。水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，并添加工业用活性炭除色素，经结晶得到薯蓣皂素成品7.63g，皂薯蓣素得率为3.05%, RP-HpLC测定其薯蓣皂素含量为96.2%。薄层层析结果表明薯蓣总皂苷的转化率为100%。所述的酵母浸出物是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩、干燥等工艺制成的一种富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分的生物培养基产品，属于公知技术不做详细描述。本工艺中所得水解物干重，为所添加黄姜干粉干重28 33%，薯蓣皂素得率在
2.7 3.05%。本工艺方法可使薯蓣总皂苷接近完全转化成薯蓣皂苷元，处理量达到工业化水平，所产生的废液量约为目前工业化现状的1/3，且不含糖分，pH接近于中性，可最大限度地降低环境污染。本实 施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索至IJ，这里不一一叙述。
权利要求
1.一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物发酵生产薯蓣皂素的方法，其特征是:将黄姜干粉和自来水按质量体积比1:5 12的比例混合，并补入为黄姜干粉质量4.0%的尿素、为黄姜干粉质量1.0%的酵母提取物和为自来水体积0.2%的无机盐，配成转化浆液，接入体积约为自来水体积5%的芽孢杆菌属{Baccilus)菌株XBT2011种子液，在培养温度40°C，控制pH6.0，搅拌速度为30(T400rpm，通气条件为2.5 4.0 Ι/min的培养条件下转化56 72hrs，转化浆液经过滤，干燥得到水解物，水解物用一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs,经反复结晶得到薯蓣皂素成品；所述的rpm为转/分钟，hrs为小时；所述芽孢杆菌属(Baccilus)菌株 XBT2011 的保藏号:CGMCCN0.6301。
2.根据权利要求1所述的一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，其特征是:在转化过程中，每隔6hrs从发酵罐中取5ml转化液检测薯蓣皂素转化情况；向液样中加入2倍液样体积的水饱和正丁醇试剂，超声波超声20min后高速离心5min，取上清液至坩埚中于100°C烘干，再向坩埚中加一倍液样体积的甲醇溶液，经反复溶解后过滤，取适量滤液点样于薄层层析板上，用体积比为7:3:0.5的氯仿/甲醇/水展开剂展开，喷IOml质量百分比浓度10% H2SO4溶液加热显色，与薯预皂苷元标品对照，观察薯蓣总皂苷的水解程度和薯蓣皂苷元转化程度；培养浆液经工业滤布过滤，于85°C烘干得到水解物，水解物用约一倍体积的120 #汽油提取12-16hrs，并添加工业用活性炭除色素，经反复结晶得到薯蓣皂素成品。
3.根据权利要求1或2所述的一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，其特征是:该方法中所得水解物干重，为所添加黄姜干粉干重28 33%，薯蓣皂素得率在 2.7 3.05%。
4.根据权利要求1所述的一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，其特征是:所述的无机盐为NaCl、MgS04、k2HP04、FeSO4和CaCl2的混合物。
5.根据权利要求1或4所述 的一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，其特征是:所述的无机盐是由质量体积百分比分为0.1% NaCl、0.05%MgS04、 0.05%k2HP04、0.005%FeS04 和 0.001%CaCl2 组成。
6.根据权利要求1所述的一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，其特征是:所述种子液的制备为取5ml菌体密度在IO8 109/ml饱BaciIIus aryabhattaiXBT2011悬液接种于150ml种子培养液中，在40°C，200rpm的摇瓶培养条件下培养14hrs制得；其中所述的种子培养液是由以下成分按下述质量体积百分比组成:黄姜干粉5%、尿素 0.3%、酵母提取物 0.1%、Na Cl 0.1%、MgSO4 0.05%、k2HP04 0.05%、FeSO4 0.005%、CaCl2.0.001%。
全文摘要
本发明公开了一种由盾叶薯蓣-黄姜经微生物转化生产薯蓣皂素的方法，将黄姜干粉和自来水按质量体积比15~12的比例混合，并补入为黄姜干粉质量4.0%的尿素、为黄姜干粉质量1.0%的酵母提取物和为自来水体积0.2%的无机盐，配成转化浆液，接入体积为自来水体积5%的芽孢杆菌属菌株XBT2011种子液，在培养温度40℃,控制pH6.0左右,搅拌速度为300~400rpm，通气条件为2.5~4.0l/min的培养条件下转化56~72hrs，转化浆液经过滤,干燥得到水解物，水解物用一倍体积的120﹟汽油提取12-16hrs,经反复结晶得到薯蓣皂素成品；所述芽孢杆菌属菌株XBT2011的保藏号CGMCCNo.6301。本发明的水解物干重为所添加黄姜干粉干重28～33%，使薯预总皂苷接近完全转化成薯蓣皂苷元，处理量大，且不含糖分,pH接近于中性，降低了环境污染。
文档编号C12R1/07GK103146795SQ201210577968
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者熊本涛 申请人:西安绿泉生物技术有限公司