专利名称：纯种野猪鉴定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种纯种野猪鉴定试剂盒。
背景技术：
从上个世纪九十年代开始，全国各地都开展了利用野猪杂交改良现有家猪品种的养殖与育种工作。但因为野猪难以捕获和养殖，现市场上出现了许多名为纯种野猪，其实为野猪与家猪杂交后代的个体，养殖者购买时因缺少检测设备只能人为从体型外貌、毛色以及生活习性等方面区分，但二者上述特点非常类似根本无法检测和区分，一旦购买后将其作为父本进口繁殖，其后代会出现明显的性状分离，造成巨大的经济损失。实用新型内容本实用新型的目的是针对上述存在的问题提供一种纯种野猪鉴定试剂盒，能够准确检测和区分野猪与其他家猪品种。上述的目的通过以下的技术方案实现纯种野猪鉴定试剂盒，其组成包括盒体,所述的盒体包括并排的圆口盛样槽及方口盛样槽，所述的圆口盛样槽旁边有标签，所述的圆口盛样槽和所述的方口盛样槽底部为尖嘴状，所述的盛样槽底部有小孔，所述的盒体内部有密闭的样品反应槽，所述的样品反应槽底面是倾斜的，所述的样品反应槽外壁底部有加热装置，所述的盛样槽尖嘴伸入到样品反应槽内，所述的盒体内有暗箱，所述的暗箱内装有加样吸管。所述的纯种野猪鉴定试剂盒，所述的圆口盛样槽顺次连接，所述的圆口盛样槽连接所述的方口盛样槽，所述的方口盛样槽连接所述的样品反应槽，所述的样品反应槽连接电泳槽，所述的电泳槽连接紫外凝胶成像仪，所述的盒体内有电泳槽，所述的电泳槽内装有琼脂糖，所述的方口盛样槽内装有引物，所述的圆口盛样槽为一组，顺次盛装去离子水，内切酶缓冲液，Acc II内切酶，PCR扩增产物。有益效果I.本实用新型采用密闭的样品反应槽使判断结果更客观。带有紫外凝胶成像仪，使人肉眼即可见酶切片段，达到判定的目的。本实用新型特设了一个加热装置，对于去离子水，内切酶缓冲液，Acc II内切酶，PCR扩增产物混合时所需的温度可有效控制。黑素皮质素受体I基因(MClR)是一个人工驯化基因，与毛色相关，野猪与家猪之间存在着明显不同的进化方式。可以通过对该基因的检测，快速、有效的鉴定和区分纯种野猪与家猪和野家杂交猪。在DNA模板、引物、4种dNTP和Taq DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。用特异设计的PCR引物扩增结束后，由于扩增片段内特定位点的碱基突变而导致了内切酶酶切位点的改变(从有到无或从无到有)，以至出现多态现象。将扩增产物进行相应的内切酶酶切，酶切后的产物进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到酶切片段。
附图I是本产品打开的结构示意图。附图2是盒体盛样槽部剖面图。
具体实施方式
实施例I :所述的纯种野猪鉴定试剂盒，其组成包括盒体(1)，其特征是所述的盒体包括并排的圆口盛样槽(2)及方口盛样槽(3)，所述的圆口盛样槽旁边贴有标签(4)，所述的圆 口盛样槽和所述的方口盛样槽底部为尖嘴状，所述的盛样槽底部有小孔(5)，所述的盒体内部有密闭的样品反应槽(6)，所述的样品反应槽底面是倾斜的，所述的样品反应槽外壁底部有加热装置(7)，所述的盛样槽尖嘴伸入到样品反应槽内，所述的盒体内有暗箱(8)，所述的暗箱内装有加样吸管(9 )，所述的盒体内有电泳槽(10 )。实施例2 所述的纯种野猪鉴定试剂盒，所述的圆口盛样槽顺次连接，所述的圆口盛样槽最后连接所述的方口盛样槽，所述的方口盛样槽连接所述的样品反应槽，所述的样品反应槽连接电泳槽，所述的电泳槽连接紫外凝胶成像仪(U)。实施例3 所述的纯种野猪鉴定试剂盒，所述的电泳槽内装有琼脂糖，所述的方口盛样槽内装有引物，所述的圆口盛样槽分别盛装去离子水，内切酶缓冲液，Acc II内切酶，PCR扩增产物。扩增以血液或组织样(一般为耳组织)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，每份总体积25 μ L，取23. 8 μ L PCR反应液(用前混匀)，O. 2 μ L Taq DNA聚合酶，I μ L模板DNA(浓度彡50ng/yL)。在PCR扩增仪上进行以下程序94 V 5 min ；94 V 30 S，58 V30 s，72 V 30 s，30 个循环；72 °C延伸 7 min ；4 °C保存。酶切使用引物I扩增的反应液,取7. 8 μ L去离子水，2 μ L内切酶缓冲液，O. 2 μ LAcc II内切酶，10 uL PCR扩增产物，混匀，37 °C水浴锅3 h ;使用引物2扩增的反应液，取7.8 μ L去离子水，2 μ L内切酶缓冲液，O. 2 μ L BspH I内切酶，10 μ L PCR扩增产物，混匀，37 °C水浴锅3 h。结果判定 (I)电泳称4 g琼脂糖放于100 mL锥形瓶中，加入I X TAE电泳缓冲液100 mL(取2 mL 50X TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至100 mL)，于微波炉中熔解，再加入2 μ L EB替代物混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将酶切产物10 μ L点样于琼脂糖凝胶孔中，以150 180 V电压于IXTAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。(2)基因型判定被检样品(引物I)出现380 bp为ΑΑ，出现194 bp、186bp为BB、出现380 bp、194bp、186 bp为AB;同一被检样品(引物2)出现694 bp为AA，出现286 bp,408 bp为BB，出现694 bp、286 bp、408 bp 为 AB。[0034](3)结果判定同一个体Acc II / BspH I基因型组合为BB/AA型为纯种野猪个体，其余均含有家猪血统。XTAE 电泳缓冲液242 g Tris溶于800 mL水中，加入 100 mL 的 0. 5 mol/L EDTA(pH 8.0)和57. I mL冰醋酸，定容至1000 mL，高压灭菌，贮 存于室温。上样缓冲液0. 25%溴酚蓝、0. 25% 二甲苯青、40% (W/V)蔗糖水溶液PCR反应液17.3 UL去离子水，2. 5 ii L PCR缓冲液，2 U L dNTP，上下游引物各I UL (# IOu mol),按此比例混合引物I :上游引物 5 ’ - AGCACCCTCTTCATCGCCTACTACC _3 ’、下游引物 5 ’ - CTGCGGAAGGCGTAGATGAGG _3’ ；引物 2 :上游引物 5’ -CGCCAACCAGACCAACCAGACGG-3’，下游引物5， -TGCCCAGCAGAGGAGGAAGACGC-3，dNTP :dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的等摩尔数混合物(各 3. 2 u mol)内切酶AccII 和 BspH IMarker DL2000 DNA Marker,由 DNA片段2000 bp、1000bp、750 bp>500 bp、250 bp以及100 bp组成,共6条带。
权利要求1.一种纯种野猪鉴定试剂盒，其组成包括盒体，其特征是所述的盒体包括并排的圆口盛样槽及方口盛样槽，所述的圆口盛样槽旁边有标签，所述的圆口盛样槽和所述的方口盛样槽底部为尖嘴状，所述的盛样槽底部有小孔，所述的盒体内部有密闭的样品反应槽，所述的样品反应槽底面是倾斜的，所述的样品反应槽外壁底部有加热装置，所述的盛样槽尖嘴伸入到样品反应槽内，所述的盒体内有暗箱，所述的暗箱内装有加样吸管。
2.根据权利要求I所述的纯种野猪鉴定试剂盒，其特征是所述的圆口盛样槽顺次连接，所述的圆口盛样槽连接所述的方口盛样槽，所述的方口盛样槽连接所述的样品反应槽，所述的样品反应槽连接电泳槽，所述的电泳槽连接紫外凝胶成像仪，所述的盒体内有电泳槽，所述的电泳槽内装有琼脂糖，所述的方口盛样槽内装有引物，所述的圆口盛样槽为一组，顺次盛装去离子水，内切酶缓冲液，Acc II内切酶，PCR扩增产物。
专利摘要本实用新型涉及一种纯种野猪鉴定试剂盒。现市场上出现了许多名为纯种野猪，其实为野猪与家猪杂交后代的个体，养殖者购买时因缺少检测设备。本实用新型组成包括本产品组成包括盒体(1)，盒体包括并排的圆口盛样槽(2)及方口盛样槽(3)，圆口盛样槽旁边贴有标签(4)，圆口盛样槽和方口盛样槽底部为尖嘴状，盛样槽底部有小孔(5)，盒体内部有密闭的样品反应槽(6)，样品反应槽底面是倾斜的，样品反应槽外壁底部有加热装置(7)，盛样槽尖嘴伸入到样品反应槽内，盒体内有暗箱(8)，暗箱内装有加样吸管。本产品用于检测和区分野猪与其他家猪品种。
文档编号C12M1/34GK202558866SQ20122007847
公开日2012年11月28日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者张冬杰, 刘娣, 汪亮, 王文涛 申请人:黑龙江省农业科学院畜牧研究所