专利名称：一种蛋白质表达质粒及其在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及到一种蛋白质表达质粒，该质粒能够将表达的外源蛋白展示在细胞表面，并且能够将表达的外源蛋白从细胞表面自动释放出来。
背景技术：
细胞表面展示技术是以细胞表面蛋白为运载蛋白，通过基因工程手段将外源蛋白与细胞表面蛋白进行融合表达，通过细胞表面蛋白的携带将外源蛋白展示在细菌或者酵母菌的细胞表面，从而使完整细胞具有了新的功能。自上个世纪八十年代中期第一个细菌细胞表面展示体系建立以来，细胞表面展示技术在活体疫苗、肽库筛选、抗体生产、生物吸附、 全细胞催化、生物传感器和酶定向进化等生物领域得到了广泛应用。在各种运载蛋白中， 冰核蛋白(Ice Nucleation Protein, INP)是载运能力最大的运载蛋白，运载蛋白的分子量最高可达到100kD。假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Xanthomonas)和欧文氏菌属 (Erwinia)中的某些细菌，其细胞表面包含INP，在过冷条件下INP能催化水生成冰晶。研究表明，天然INP具有三个结构域，N端结构域与磷脂层的外层相互作用，C端结构域高度亲水并暴露于外膜，中间是重复序列，作为冰晶核模板起到催化作用。根据INP的结构特点， 已经构建了 INP全长展示系统、无中间重复序列展示系统以及含部分中间重复序列的展示系统。
目前以INP为运载蛋白，已经成功地将金属调整蛋白(metal Ioregulatory protein, MerR)> 有机憐水解酶(organophosphate hydrolase)、羧酸酯酶 (carboxy I esterase )> 甲基对硫憐水解酶(Methyl parathion dydrolase)、纤维素酶 (cellulase)展示在大肠杆菌、根瘤菌(Rhizobium)、摩拉克氏菌(Moraxella)、假单胞菌细胞的表面。虽然这些蛋白被成功的展示在了细胞表面，发挥了它们的作用，但这些蛋白也被固定在了细胞表面，对进一步研究(如纯化、性质表征和定向进化等)和应用带来了很多限制。为了克服上述问题，我们期望能够构建一种新的细胞表面展示质粒，使展示在细胞表面的外源蛋白能够从细胞表面解离下来，从而拓展细胞表面展示技术的应用范围。
蛋白内含子(Intein)又称内蛋白子，是前体蛋白质中的一段插入序列。其功能是在蛋白翻译后成熟过程中，能自动准确切除蛋白内含子及两侧蛋白外显子序列，并以正常的肽键连接形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接(protein splicing)。Intein对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白质基因存在于同一开放阅读框 (openreadingframe, 0RF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当形成蛋白质前体之后， Intein从宿主蛋白质中被切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。蛋白内含子目前主要用于蛋白的纯化、毒性蛋白的表达、蛋白环化等方面。
基于目前细胞表面展示技术存在的不足以及Intein所具有的生物学功能，本发明拟将这两项技术相结合，构建具有细胞表面展示并自动释放功能的蛋白质表达载体，以拓展细胞表面展示技术的应用范围。发明内容
本发明的目的是为生物技术领域提供一个新的细胞表面展示质粒，是在质粒 pET20b的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段。
该质粒既可以使插入到多克隆位点的外源蛋白展示在细胞表面，又可以在一定条件下使外源蛋白从细胞表面自动释放出来，可用于外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达、蛋白质和酶的定向进化、全细胞的生物催化。
本发明首先提供了一种新的细胞表面展示质粒,其特点是在商品质粒pET20b的多克隆位点插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端构建了多克隆位点(MCS， 包括Nco I，Xba IjEcoR I和Xho I)。通过分子生物学技术将外源蛋白基因插入到质粒多克隆位点后，获得重组表达载体；再将重组表达载体转入大肠杆菌表达宿主，如BL21，经诱导表达后，插入到质粒多克隆位点的外源蛋白基因不但能够展示在细胞表面，而且能够在 Intein的剪切作用下自动从细胞表面释放出来。
所述的INP基因，其编码的氨基酸序列与来源于细菌Pseudomonas syringae的冰核蛋白(在GenBank中的登录号为CBI99147.1)的N端部分片段以及C端部分片段相一致， 删除了原始蛋白中的中间片段。
所述的Intein基因，其编码的氨基酸序列与来源于古菌Synechocystis Sp. Pcc6803的Intein氨基酸序列(在GenBank中的登录号为ABD24064.1)的部分片段相一致，但是根据大肠杆菌密码子的偏嗜性，对Intein氨基酸所对应的密码子进行了重新编码和人工设计合成。
其次，本发明提供了一种利用上述载体将外源蛋白展示在细胞表面并能够使目标蛋白自动从细胞表面解离下来的方法，其特点是包括以下步骤
a.使用常规分子生物学技术，如酶切连接、基因重组等方法，将外源蛋白基因插入到质粒ρΙΝΡ-1ntein的多克隆位点，获得重组表达载体；
b.可以使用常规的转化方法，如化学转化、电转化等，将所构建的重组表达载体转入表达宿主，如大肠杆菌B121，通过添加IPTG进行诱导表达，获得融合蛋白并被展示在细胞表面，所述融合蛋白包括所述冰核蛋白片段(INP)，所述蛋白内含子(Intein)，所述外源蛋白和所述寡聚组氨酸亲和纯化标签。
c.融合蛋白中的蛋白内含子(Intein)可以自动将位于其C端的外源蛋白和寡聚组氨酸亲和纯化标签从细胞表面剪切下来，剪切下来的外源蛋白的C末端融合寡聚组氨酸亲和纯化标签，因而外源蛋白容易被浓缩纯化。
所述的蛋白内含子自动剪切作用，其效率可以通过外界条件的变化而发生变化。
所述的外界条件包括温度，pH值，时间以及β_巯基乙醇，所述的温度，其范围为 (20至40)°C，所述的pH范围为4. O至7. 9，所述的时间范 围为2_60小时，所述β -巯基乙醇，其浓度范围为0%至O. 1%。
本发明的优势
本发明提出了一种新的细胞表面展示并能使被展示的蛋白从细胞表面自动解离下来的方法，本发明所设计构建的表达质粒拥有如下优势
I)插入到多克隆位点的外源蛋白基因经诱导后，以融合蛋白的形式展示在细胞表面；
2)展示在细胞表面的外源蛋白可以自动从细胞表面解离下来，通过改变外界因素可以对外源蛋白的解离速度和效率加以控制；
3)在未额外加入终止子的条件下，外源蛋白的C末端会融合表达组氨酸标签，可以方便的使用亲和层析的方法把外源蛋白纯化出来。
本发明所提出的方法以及所设计构建的表达质粒在蛋白质及多肽文库的筛选、酶和抗体的制备以及全细胞生物催化等方面具有潜在的应用价值。
图1 :本发明的重组质粒pET20b_INP的载体图谱；其中INP是指冰核蛋白基因， MCS是指多克隆位点，包括Nco1、Xba1、Eco I和Xho I限制性酶切位点。
图2 :本发明图1所示重组质粒pET20b_INP的构建流程图3 :本发明构建的重组质粒pET20b_INP序列测定图，其中黑框标出的是目的片段部分。
图4 :本发明的重组质粒pINP-1ntein的载体图谱，其中INP是指冰核蛋白基因， Intein是指蛋白内含子基因，MCS是指多克隆位点，包括Nco1、Xba1、Eco I和Xho I限制性酶切位点；
图5 :本发明图4所示重组质粒pINP-1ntein的构建流程图6 :本发明构建的重组质粒pINP-1ntein序列测定图，其中黑框标出的是目的片段部分。
图7 :检验大肠杆菌(E. coli BL21-CodonPlus DE3)包含不同质粒诱导表达状况的变性蛋白电泳(SDS-PAGE)图。泳道 I pINP-1ntein(53. 7KDa);泳道 2 marker(116. OkDa, 66.2kDa,45. OkDa,35. OkDa, 25. OkDa)；泳道 3 :pINP_Intein-RFP(80. 7KDa)；泳道 e4 : PINP-RFP (60. 7kDa);泳道 5 pET20b-1NP (33. 7kDa);泳道 6 pDsRed-Monomer (27kDa);泳道 7 pET20bo
图8、温度对包含质粒 pINP-1ntein-RFP 的大肠杆菌(Ε· coli BL21_CodonPlus DE3)释放红色突光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的影响示意图。1、37°C;2、25°C;3、20。。;4、对照样品。
图9、pH 值对包含质粒 pINP-1ntein-RFP 的大肠杆菌(Ε· coli BL21_CodonPlus DE3)释放红色突光蛋白(Red fluorescent protein, RFP)的影响示意图。1-5管的pH值分别是6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，7. 9 ;6号管为对照样品。
图10、β- 巯基乙醇的浓度对包含质粒pINP-1ntein-RFP的大肠杆菌(Ε· coli BL21_CodonPlus DE3)释放红色突光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的影响不意图。 1-8管β -巯基乙醇的浓度分别是0% ；0. 01% ；0. 05% ；0. 1% ；0. 5% ；1%和2%。
图11、检验包含质粒 pINP-1ntein-RFP 的大肠杆菌(Ε. coli BL21_CodonPlus DE3)释放红色突光蛋白(Red fluorescent protein, RFP)的变性蛋白电泳图(SDS-PAGE)； 泳道 I marker(116. OkDa, 66. 2kDa,45. OkDa, 35. OkDa, 25. OkDa, 18. 4kDa);泳道 2 :释放前样品(80. 7KDa);泳道3 :释放后的沉淀；泳道4 :释放后上清液。
具体实施方式
(一)本发明实验中使用的细菌菌株和质粒
(I)菌株大肠杆菌 E. coli XL-blue 和 E. coli BL21-CodonPlus (DE3)购自 Novagen公司，分别作为基因的扩增和表达宿主菌。
(2)质粒pET_20b购自Novagen公司，蛋白表达载体；pGF101 (由美国弗吉尼亚理工大学 Percival Zhang 教授赠予，(Liu, et al, Applied and Environment Microbiology, 2010, 76:4914-4917),质粒 pDsRed-Monomer 购自 Takara 公司。
(二)本发明实验中使用的培养基
(I) LB液体培养基
1000 毫升培养基中含 IOg 蛋白腺(Bacto-Tryptone), 5g 酵母粉(Bacto-Yeast Extract), 5g NaCl ρΗ7· 0,121°C条件下灭菌 20min。
(2) LB固体培养基(％):用于E. coli的培养与筛选在LB液体培养基的基础上，加1. 5% (g/g)琼脂，ρΗ7· 0,121°C灭菌 20min。
其它缓冲液及所使用试剂为实验室常用方法，可参见常用工具书，如分子克隆实验指南(J萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002 )。
(三)本发明实验中使用的试剂
质粒提取试剂盒、PCR clean纯化试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒均购于OMEGA公司，克隆重组试剂盒(CloneEZOPCR Cloning Kit)购于GenSeripe公司，限制性内切酶、DNA 聚合酶等分子生物学工具酶和相应试剂均购自TAKARA公司，其它常用化学试剂均为国产分析纯。
(四)本发明实验中PCR引物合成和DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
如无特殊说明，本发明实施例中所采用的方法以及试剂均为公开常用技术，主要来源于所使用的试剂盒中所提供的使用说明或分子生物学实验技术中常用工具书，如分子克隆实验指南(J萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)。
实施例1 :细胞表面展示质粒pET20b_INP的构建。
本实例构建了一种细胞表面展示质粒pET20b_INP，作为实施例2和实施例3的对照和实验材料。构建的质粒pET20b-1NP载体图谱见图1，重组质粒pET20b-1NP的构建流程图见图2。
1.冰核蛋白INP基因的提取
1.1引物设计合成
根据pGFlOl质粒上INP基因序列，设计PCR引物，上游引物Pl序列为5’_CTGTTC CATATGACTCTCGACAAGGCG-3，(SEQ ID NO. 1)，含有 Nde I 酶切位点，下游引物 P2 序列为 5’-GAATTACTCGAGCCATGGCTTTACCTCTATCC (SEQ ID NO. 2)，含有 Nco I 和 Xho I 两个酶切位点。 弓I物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1. 2INP基因的PCR扩增
在PCR反应溶液中包含50ng的质粒pGFlOl做为模板，20umol的引物Pl和P2， 20ul 的 5XPS 缓冲液，IOul 的 dNTP (各 2. 5mM), Iul 的 DNA 聚合酶(Prime STAR,Tacara 公司)，用去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸60秒的程序进行30个循环反应，最后在72 °C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与冰核蛋白(INP)基因长度一致的基因片段(SEQ ID NO. 3)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
1. 3INP基因PCR扩增产物的双酶切
纯化后的PCR产物用限制性内切酶处理。在酶切反应体系中，加入PCR产物lug， 限制性内切酶NdeI和XhoI各Iul，10 X K缓冲溶液2ul，去离子水补充至20ul，37°C下保温 2小时。反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收与冰核蛋白(INP)基因长度一致的基因片段(约930bp)，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
2.质粒pET_20b的提取及双酶切
2.1 质粒 pET_20b 的提取
含质粒pET_20b的大肠杆菌XL-blue在LB培养基中过夜培养(37°C )，离心收集， 使用质粒提取试剂盒获得质粒pET-20b，实验操作按试剂盒说明书进行。
2. 2质粒pET_20b的双酶切和去磷酸化
得到的质粒pET_20b用限制性内切酶处理。在酶切反应体系中，pET_20b质粒lug， 限制性内切酶NdeI和XhoI各Iul，10 X K缓冲溶液2ul，去离子水补充至20ul，37°C下保温 2小时。反应完成后，加入30U的碱性磷酸酶CIAP和2ul缓冲液，37°C下保温I小时，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收与质粒pET-20b长度一致的基因片段(约3700bp)，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
3.重组质粒pET20b_INP的构建
3.1大肠杆菌E. coli XL化学感受态细胞的制备
大肠杆菌E. coli XL化学感受态细胞的制备方法参见《分子克隆实验指南(第三版)》。
3. 2冰核蛋白(INP)基因与质粒pET20b的连接
在连接体系中，分别加入50ng的经上述步骤处理的质粒pET_20b, 140ng的经上述步骤处理的PCR产物，350U 了40嫩连接酶，2 4 1缓冲液，去离子水补足20 μ 1，16°C连接过夜。
3. 3大肠杆菌E. coli XL的转化及鉴定
连接产物按照常规方法转入大肠杆菌E. coli XL化学感受态细胞。将转化产物完全涂布在含有O. lmg/ml氨苄青霉素的LB培养基固 体平板上，37 °C培养过夜。从连接产物转化的平板上挑5个单克隆，分别接种于5ml含有O. lmg/ml Amp的LB培养基的试管中，37°C 培养6-8h。以菌液为模板，以上述PCR条件进行检验，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。用质粒提取试剂盒从上述菌液中提取质粒，NdeI和XhoI双酶切处理质粒，反应条件同1. 3，最后用1%的琼脂糖凝胶电泳检验酶切结果。
3. 4重组质粒的测序鉴定
由上海生工生物工程技术服务有限公司对重组质粒中的冰核蛋白(INP)基因进行测序鉴定，测序图谱见图3，序列拼接由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。结果表明重组质粒中包含冰核蛋白(INP)基因序列(SEQ ID NO. 3)，其编码的氨基酸序列与来源于细菌Pseudomonas syringae的冰核蛋白(在GenBank中的登录号为CBI99147.1)的N端部分片段以及C端部分片段相一致。本发明的冰核蛋白(INP)氨基酸序列为
MTLDKALVLRTCANNMADHCGLIffPASGTVESRYWQSTRRHENGLVGLLffGAGTSAFLSVHADARWIV CEVAVADIISLEEPGMVKFPRAEVVHVGDRISASHFISARQADPASTSTSTSTSTLTPMPTAIPTPMPAVASVTLP VAEQARHEVFDVASVSAAAAPVNTLPVTTPQNLQTATYGNTLS⑶SHSRLIAGYGSNETAGNHSDLIGSGGHDCT LMA⑶QSRLAAGKNSVLTAGARSKLIGSEGSTLSAGEDSTLIFRLWDGKRYRQLVARTGENGVEADIPYYVNEDD DIVDKPDEDDDffIEVK
实施例2 :细胞表面展示自动释放质粒pINP-1ntein的构建
细胞表面展示自动释放质粒pINP-1ntein载体图谱见图4,重组质粒pINP-1ntein 的构建流程图见图5。
INP基因的获得方法与实例I相同。
1.1ntein基因的合成
依据大肠杆菌密码子的偏嗜性，将古菌Synechocystis Sp. Pcc6803的Intein氨基酸序列(在GenBank中的登录号为ABD24064.1)中的部分片段所对应的密码子进行了重新编码为
5' -cgtccgaataatggtaataatggcctggaactgcgtgaaagcggtgcaattagcggtgatagcctg attagcctggccagcaccggtaaacgtgttagcattaaagatctgctggatgaaaaagattttgaaatttgggccat taatgaacagaccatgaaactggaaagcgcaaaagttagccgtgttttttgcaccggtaaaaaactggtgtatattc tgaaaacccgtctgggtcgtacca ttaaagcaaccgccaatcatcgttttctgaccattgatggttggaaacgtct ggatgaactgagcctgaaagaacatattgcactgccgcgtaaactggaatctagcagcctgcagctgtctccggaaa ttgaaaaactgagccagagcgatatttattgggatagcattgtgagcattaccgaaaccggtgttgaagaagttttt gatctgaccgttccgggtccgcacaatttcgtggccaatgatattattgtgcataatggtcgtcgtgcaatgggtgg tcgcgaatttctggaaggtagcag c-3’ (SEQ ID NO. 4)。
重新编码的Intein基因由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
上述设计的Intein基因所对应的Intein氨基酸序列为
RPNNGNNGLELRESGAIS⑶SLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKK LVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGV EEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNGRRAMGGREFLEGSS (SEQ ID NO. 5)
2.1NP基因与Intein基因的连接
2.1PCR引物的设计合成
根据INP基因与Inte in基因序列，设计PCR引物，上游弓丨物采用实施例1中PI (SEQ ID NO.1);下游引物 P3 序列为 5，-ACCATTATTCGGACGCTTTACCTCTATCCA (SEQ ID NO. 6);上游引物 P4 序列为 5’ -TGGATAGAGGTAAAGCGTCCGAATAATGGTAATA (SEQ ID NO. 7);下游引物 P5 序列为 5’ -GTTAAGCTCGAGGAATTCTCTAGACCATGGGCTGCTACCTTC (SEQ ID NO. 8)，含有 Xho I1EcoR I，Xba I，Nco I四个酶切位点。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
2. 2PCR的方法扩增INP基因
PCR反应含50ng的质粒pGFlOl为模板，20 umol的引物Pl和P3，以及20ul的5XPS 缓冲液，IOul 的 dNTP (各 2. 5 mM), Iul 的 DNA 聚合酶(Prime STAR，Tacara 公司)，去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30秒，55°C退火30 秒，72°C延伸60秒的程序进行30个循环反应，最后在72 °C延长反应10分钟的程序进行PCR 反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与冰核蛋白(INP)基因长度一致的基因片段(约950bp)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
2. 3overlap-PCR 的方法连接 INP 和 Intein 基因
Overlap-PCR 反应体系组成为INP 基因 IOOng, Intein 基因 50ng, Iul 的 DNA 聚合酶(Prime STAR, Tacara 公司)，5XPS 缓冲液 20 μ 1，dNTPlOy I (各 2. 5 mmol/L)，引物 Pl 和P5各20nM，引物P3和P4各2nM，去离子水补充至100μ I。在PCR仪上98°C保温2分钟， 然后按照94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸90秒的程序进行30个循环反应，最后在72 °C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验得到了与INP-1ntein基因长度一致的基因片段(1482bp)。用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收基因片段为1482bp的条带，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
3.基因与质粒pET_20b连接
3.1INP和Intein基因连接产物的双酶切
纯化后的PCR产物用限制性内切酶处理，在酶切反应体系中，加入回收的PCR产物 lug,限制性内切酶Nde I和Xho I各Iul，10 X K缓冲溶液2ul，去离子水补充至20ul，37°C 下保温2小时。反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收基因片段长度为1482bp左右的条带，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
3. 2质粒pET_20b的提取及双酶切
质粒pET_20b的提取及限制性内切酶NdeI和XhoI处理与纯化方法与实施例1所述方法相同。
3. 3INP-1ntein基因与质粒pET_20b的连接及测序验证
INP-1ntein基因与经上述处理的质粒pET_20b的连接、转化和验证方法与实例I 所述方法相同。INP-1ntein基因的测序验证由上海生工生物工程技术服务有限公司完成， 测序图谱见图6 (a)和图6 (b)，序列拼接由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。结果表明重组质粒(pINP-1ntein)中包含冰核蛋白(INP)基因和Intein基因，基因序列与设计相符(SEQ ID NO. 9)，所对应的氨基酸序列与设计相符(SEQ ID NO. 10)。
实施例3.含红色突光蛋白(Red fluorescent protein, RFP)基因的重组载体 pET20b-1NP-RFP 及 pINP-1ntein-RFP 的构建。
为了验证本发明构建的质粒pINP-1ntein的功能，以RFP为报告蛋白，采用克隆重组试剂盒将RFP基因分别连入质粒pET20b-1NP及pINP -1ntein中，构建重组质粒 pET20b-1NP-RFP和重组质粒pINP-1ntein-RFP。在宿主菌种通过诱导表达，重组质粒 pET20b-1NP-RFP能将RFP展示在细胞表面，而重组质粒pINP-1ntein-RFP除了能够将RFP 展示在细胞表面，并且在融合表达Intein的作用下，RFP能够自动从细胞表面释放出。
1.重组质粒 pET20b-1NP_RFP 的构建
1.1引物设计与合成
根据质粒pDsRed-Monomer中RFP的基因序列以及pET20b_INP多克隆位点附近序列，设计如下引物
P6 :5，-GAGGTAAAGCCATGGGTCGCCACCATGGAC(SEQIDNO.11)
P7 :5，-GTGGTGGTGCTCGAGGTCGCGGCCGCTGTA(SEQIDNO.12)
P8 :5，-CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGAT(SEQIDNO.13)
P9:5’ -CCATGGCTTTACCTCTATCCAGTCATCGTCCT (SEQ ID NO. 14)
弓I物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1. 2PCR方法获得的RFP的基因片段
在PCR反应体系中，加入50ng的质粒pDsRed-Monomer为模板，同时加入20umol 的引物 P6 和 P7,以及 20ul 的 5XPS buffer, IOul 的 dNTP (各 2. 5mM), Iul 的 Prime STAR DNA聚合酶，去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30 秒，55°C退火30秒，72°C延伸60秒的程序进行30个循环反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与红色荧光蛋白 (RFP)基因长度一致的基因片段(约720bp)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
1. 3PCR方法对质粒pET20b_INP进行线性化与消化
在PCR反应体系中，加入50ng的质粒pET20b_INP为模板，同时加入20umol的引物 P8 和 P9，以及 20ul 的 5XPS buffer, IOul 的 dNTP (各 2. 5mM), Iul 的 Prime STAR DNA 聚合酶，去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30秒， 55°C退火30秒，72°C延伸5min的程序进行25个循环反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与pET20b-1NP基因长度一致的基因片段(约4600bp)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
线性化的载体用内切酶dpnl进行消化。在消化体系中，加入2ug线性化的载体 pET20b-1NP, IOUdpnI，2ul buffer,用去离子水补充至20ul，37°C下消化过夜，反应完成后， 用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收基因片段长度为4600bp左右的条带，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
1. 4用重组克隆试剂盒将RFP基因连入线性化的质粒pET20b_INP
在连接体系中含线性化质粒pET20b-1NP (100_200ng/μ I) 6 μ 1，纯化的RFP基因(100_200ng/ μ I) 4 μ I, IOxCloneEZ Buffer 2μ1, CloneEZ Enzyme 2 μ丨，去离子水补足 20 μ I。然后将其混合物在25°C保持30分钟，之后在冰上静置5min。反应完成后，连接产物按照常规方法转入大肠杆菌E. coli XL化学感受态细胞。PCR验证和双酶切验证方法与实施例I相同。结果表明RFP基因成功连接到了质粒pET20b-1NP中，得到重组质粒pINP-RFP。
2. RFP 基因连入质粒 pINP-1ntein 中
2.1引物设计与合成
根据质粒pINP-1 ntein多克隆位点附近序列以及RFP的基因序列，设计如下引物
PlO :5’ -GGTAGCAGCCCATGGGTCGCCACCATGGAC (SEQ ID NO. 15)
Pll :5’ -CCATGGGCTGCTACCTTCCAGAAA (SEQ ID NO. 16)
引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
2. 2PCR方法获得的RFP的基因片段
在PCR反应体系中，加入50ng的质粒pDsRed-Monomer为模板，同时加入20umol 的引物 PlO 和 P7,以及 20ul 的 5XPS buffer, IOul 的 dNTP(各 2. 5mM), Iul 的 Prime STAR DNA聚合酶，去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30 秒，55°C退火30秒，72°C延伸60秒的程序进行30个循环反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与红色荧光蛋白 (RFP)基因长度一致的基因片段(约720bp)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
2. 3PCR方法对质粒pINP-1ntein进行线性化与消化
在PCR反应体系中，加入50ng的质粒pINP-1ntein为模板，同时加入20umol的引物 P8 和 P11，以及 20ul 的 5XPS buffer, IOul 的 dNTP(各 2. 5mM), Iul 的 Prime STAR DNA 聚合酶，去离子水补充至IOOul。在PCR仪上98°C保温2分钟，然后按照94°C变性30秒， 55°C退火30秒，72°C延伸5min的程序进行25个循环反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应。反应完成后，产物用琼脂糖凝胶电泳检验得到了与pET20b-1NP基因长度一致的基因片段(约5200bp)。用PCR clean试剂盒纯化PCR产物，实验操作按试剂盒说明书进行。
线性化的载体用内切酶dpnl进行消化。在消化体系中，加入2ug线性化的载体 pINP-1ntein, IOUdpnI, 2ul buffer,用去离子水补充至20ul, 37°C下消化过夜，反应完成后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，在紫外光下切胶回收基因片段长度为5200bp左右的条带，然后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段，实验操作按试剂盒说明书进行。
2. 4用重组克隆试剂盒将RFP基因连入线性化的质粒pINP-1ntein
在连接体系中含线性化质粒pINP-1ntein (100_200ng/μ I) 6 μ 1，纯化的RFP基因(100-200ng/ μ I) 4 μ 1,10><CloneEZ Buffer 2μ1, CloneEZ β Enzyme 2 μ!，去离子水补足 20 μ I。然后将其混合物在25°C保持30分钟，之后在冰上静置5min。反应完成后，连接产物按照常规方法转入大肠杆菌E. coli XL化学感受态细胞。PCR验证和双酶切验证方法与实施例1相同。结果表明RFP基因成功连接到了质粒pINP-1ntein中。
实施例4 =RPF在细胞表面的展示与释放检测
1.1重组质粒转化到大肠杆菌
将重组质粒pET20b-1NP、pINP-1ntein、pINP-RFP, pINP-1ntein-RFP、以及质粒 pET20b、pDsRed-Monomer转入大肠杆菌巨Ε· oli BL21化学感受态细胞中。E. coli BL21 化学感受态细胞的制备以及转化方法方法参见《分子克隆实验指南(第三版)》。转化后的 E.coli BL21 (IOOul)涂布于含0. lmg/mlAmp的LB固体平板，在37°C下培养过夜，挑单克隆接种于5ml LB培养基中(含0. lmg/mlAmp), 37°C振荡培养过夜。菌液加入15% (v/v)的甘油保存与_80°C。
1. 2含重组质粒的大肠杆菌诱导表达 状况分析
上述保存的菌种按1% (v/v)的接种量转入200ml新鲜的LB (含0. lmg/mlAmp) 培养基中，37°C，200rpm继续振荡培养至菌液0D_为0. 6^0. 8时，加入终浓度为0. 5mM的诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20°C振荡培养过夜。离心收集菌体(Iml )，去掉上清液，加入IOOul的SDS-PAGE样缓冲液，于沸水浴中加热10分钟，室温冷却后离心 (13000rpm) 5分钟，取上清液做SDS-PAGE电泳检验。采用12% (g/v)分离胶，SDS-PAGE电泳方法参见《分子克隆实验指南(第三版)》。SDS-PAGE电泳检验结果见图7。根据理论计算，INP、Intein和RFP的理论分子量分别约为33. 7、20、和27KDa。从图5的结果可知，以含空质粒pET20b的工程菌为空白对照，以第二泳道的标准分子量蛋白为参照，第六泳道含质粒pDsRed-Monomer的基因工程菌特异性表达条带的分子量约为27KDa，与RFP的理论分子量相同；第五泳道含质粒pET20b-1NP的基因工程菌特异性表达条带的分子量约为34KDa， 与INP的理论分子量相似；第四泳道含质粒pINP-RFP的基因工程菌特异性表达条带的分子量约为61KDa，与INP+RFP融合蛋白的理论分子量相似；第一泳道含质粒pINP-1ntein的基因工程菌特异性表达条带的分子量大约为54KDa，与INP+Intein融合蛋白的理论分子量相近；第三泳道含质粒pINP-1ntein-RFP的基因工程菌特异性表达条带的分子量大约为 81KDa，与INP+Intein+RFP融合蛋白的分子量相近。上述研究结果证明本发明构建的重组质粒能够在大肠杆菌中正常表达。
1. 3不同条件对基因工程菌释放RFP的影响及检测
将含质粒pINP-1ntein-RFP的大肠杆菌E. coli BL21接种于200mlLB培养基(含 O. lmg/ml Amp)，37°C培养(200rpm)至菌液OD600到达O. 6左右，加入IPTG使终浓度达到 O. 5mM, 20°C继续培养20h。离心(6000rpm) 10分钟收集菌体。使用该菌体研究不同条件对展示在细胞表面RFP的释放影响。
1. 3.1温度对展示在细胞表面的RFP释放的影响
收集的菌体用释放缓冲液重悬(1: 10，g/v)，释放缓冲液的组成为20mMTris-HCl、 NaClO. 9% (g/v), pH值为7. 9。将重悬液分别在20°C，25°C，37°C条件下孵育48h，离心 (6000rpm) 10分钟，结果见图8。图8结果表明基因工程菌表达的RFP能够正确折叠而显色为红色8，释放到上清液中的RFP为可溶状态，在37°C条件下的释放效果明显好于其它温度。
1. 3. 2pH值对展示在细胞表面的RFP释放的影响
分别用pH6.0，6. 5，7.0，7. 5，7.9的释放缓冲液重悬收集的菌体(1:10，g/v)，在 37°C条件下孵育48h，离心(6000rpm) 10分钟。结果见图9。图9表明不同pH值对释放效果无明显差别。
1. 3. 3 β -巯基乙醇对展示在细胞表面的RFP释放的影响
在释放缓冲液(20mM Tris-HCl.O. 9%NaCl (g/v),pH值7. 9)中分别加入终浓度为 0% ；0. 01% ；0. 05% ；0. 1% ；0. 5% ；1%和2% (g/v)的β -巯基乙醇，将收集的菌体重悬于上述释放缓冲液中(1: 10，g/v)，在37°C条件下孵育48h，离心(6000rpm) 10分钟，结果见图10。 图10表明当β-巯基乙醇浓度为O. 01% (g/v)时可以促进RFP的释放，而高浓度的β-巯 基乙醇可能导致蛋白质的空间结构被破坏，使RFP失去应有的红色。
1. 3. 4SDS-PAGE 检测 RFP 释放状况
通过优化以上的影响因素，细胞表面展示-释放载体表达RFP的最佳释放条件是 释放缓冲液的组成为 20mM Tris-HCl+0. 9%NaCl (g/v)，pH6. 0-7. 9，β -巯基乙醇 O. 01% (g/ V)，释放温度为37°C。将收集的菌体重悬于上述释放缓冲液中(1: 10，g/v)，在37°C条件下孵育48h,离心(6000rpm) 10分钟。将沉淀重新悬浮于上述释放缓冲液中至起始体积。将沉淀悬浮液和离心上清液按1:1 (v/v)的比例与SDS-PAGE上样缓冲液(Sample loading buffer)混合，于沸水浴中加热10分钟,室温冷却后离心(13000rpm) 5分钟,取上清液做 SDS-PAGE电泳检验。采用12% (g/v)分离胶，SDS-PAGE电泳方法参见《分子克隆实验指南 (第三版)》。SDS-PAGE电泳检验结果见图11。图11结果表明在第4泳道中出现了分子量大约为27KDa的RFP特异性条带，而第2泳道出现了分子量大约为34KDa的INP特异性条带，证明本发明构建 的质粒pINP-1ntein表达的RFP在上述释放条件下被可溶性的释放到了上清液中，而携带蛋白INP仍然绑定在细胞表面，在离心过程中随细胞留在沉淀中。
综上所述,本发明构建的质粒pINP-1ntein不但能够将目标蛋白展示在细胞表面，而且目标蛋白还能够自动从细胞表面释放出来。本发明所提出的方法以及所设计构建的表达质粒在蛋白质及多肽文库的筛选、酶和抗体的制备以及全细胞生物催化等方面具有潜在的应用价值。
权利要求
1.一种蛋白质表达质粒pINP-1ntein,其特征在于是在质粒pET20b的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段，其结构如下所示，
2.权利要求1所述的一种蛋白质表达质粒pINP-1ntein在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用。
3.如权利要求2所述的一种蛋白质表达质粒pINP-1ntein在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用，其特征在于将外源蛋白基因插入到质粒PlNP-1ntein多克隆位点后，获得重组表达载体；再将重组表达载体转入大肠杆菌表达宿主，经诱导表达后，插入到质粒多克隆位点的外源蛋白基因不但能够展示在细胞表面，而且能够在Intein的剪切作用下从细胞表面释放出来。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及到一种蛋白质表达质粒，该质粒能够将表达的外源蛋白展示在细胞表面，并且能够将表达的外源蛋白从细胞表面自动释放出来。该质粒在商品质粒pET20b的多克隆位点插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端构建了多克隆位点(MCS，包括Nco I，Xba I，EcoR I和Xho I)。将外源蛋白基因插入到质粒pINP-Intein多克隆位点后，获得重组表达载体；再转入大肠杆菌表达宿主，经诱导表达后，插入到质粒多克隆位点的外源蛋白基因不但能够展示在细胞表面，而且能够在Intein的剪切作用下从细胞表面释放出来。该表达质粒在蛋白质及多肽文库的筛选、酶和抗体的制备以及全细胞生物催化等方面具有潜在的应用价值。
文档编号C12N15/63GK103045632SQ201310000298
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月3日 优先权日2013年1月3日
发明者张作明, 高文英, 张红, 周余来, 陈彦彦 申请人:吉林大学