专利名称：丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种丹波黑大豆(简称RB)的14-3-3a基因(5GF7办)的植物表达载体及其在提高植物耐铝能力中的应用，属于植物分子基因工程领域。
背景技术：
14-3-3蛋白最早是在动物脑组织中发现的，根据其在DEAE中的迁移率将其命名为14-3-3蛋白，起初被认识是脑组织中特异性蛋白。最近几十年的研究发现，14-3-3蛋白存在于所有真核生物中，包括动物、植物和微生物。植物14-3-3蛋白是一个大的基因家族，存在很多不同的亚型。拟南芥中存在12种不同亚型的14-3-3基因，烟草中有12种，水稻中有6种，大豆中存在18种14-3-3基因，其中有16种能够发生转录，并且不同亚型的14_3_3基因表达还存在明显的组织特异性。植物14-3-3蛋白通常以同源或异源二聚体的形式存在，并且能够与磷酸化靶蛋白相互作用，调节一系列生物过程，如代谢、生长、发育和信号传导途径等。植物14-3-3蛋白能够参与多种生物过程的调节。14-3-3蛋白能够参与GA、ΑΒΑ、BR和乙烯等植物激素信号通路来调控植物生长发育过程。植物14-3-3蛋白在调控植物体内营养物质代谢过程中也发挥着重要作用，14-3-3蛋白能够通过调节NR、SPS和GS等代谢酶的活性来调控植物体内碳氮代谢过程。并且14-3-3蛋白也能够调节质膜中的K+泵和H+-ATPase酶的活性来维持细胞内外电化学梯度，来调控植·物体内的物质运输过程。同时，植物14-3-3蛋白通过调节叶片中质膜H+-ATPase的活性，来调控气孔的开闭，从而对渗透胁迫作出响应。植物14-3-3蛋白也能够参与多种胁迫的应答。在逆境胁迫的条件下，植物14-3-3蛋白也能对多种生物和非生物胁迫作出应答，包括盐胁迫、磷缺乏、干旱胁迫、冷胁迫和重金属胁迫等非生物胁迫，以及损伤和病原菌侵染等生物胁迫。用盐和冷处理的水稻愈伤组织和幼苗中整个14-3-3基因家族的表达上调。此外，其他的胁迫包括热、氧化和重金属对水稻OsGFM基因的表达也有不同程度的影响，必和OsGFMg几乎可以被所有的胁迫诱导，水稻经损伤处理48h后能够降低0sGF14e基因的表达。磷饥饿使拟南芥中14-3-3y、m的转录水平下降。长期的钾缺乏导致拟南芥中14_3_3c、j的蛋白表达水平下降，14-3-3 的蛋白表达水平增加。另外，14-3-3蛋白在植物免疫响应中具有重要作用。在Cf9/Avr9介导的宿主免疫应答中10个番茄14_3_3基因中有3个能够被特异性诱导表达。最近研究表明，拟南芥14-3-3蛋白能够与RPW8. 2蛋白相互作用，在R蛋白介导的宿主免疫应答中发挥着重要作用。最近，许多研究者通过基因工程的手段增强或抑制植物14-3-3蛋白的表达来研究其功能。在马铃薯中过量表达14-3-3蛋白能够改变脂类、氨基酸和矿物质的组成，并且提高抗氧化能力提高，而抑制14-3-3蛋白的表达则出现相反的结果。在水稻中过量表达玉米的基因后能够增强水稻的抗旱能力，并且在棉花中过量表达拟南芥的
基因后能够使棉花保持“常青”及增强了棉花对干旱胁迫的耐受。通过反义技术抑制拟南芥14-3-3蛋白的表达，促进了叶片中淀粉的积累及增加了植物的生长。
全世界大约有50%的可耕地属于酸性土壤，而铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。铝毒早期最明显的症状是抑制根尖细胞生长和细胞分裂，从而抑制根生长，导致根系损伤，影响水分和养分的吸收，限制了植物的生长。近年来许多研究者都致力于植物耐铝机制的研究，目前的研究的结果表明能适应酸性土壤生长的植物有两种耐铝机制外部排斥机制和内部耐受机制。外部排斥机制是根尖对铝的排斥，将铝阻止在细胞外；主要包括铝诱导有机酸分泌、根际PH的升高和细胞壁对铝离子的固定等。内部耐受机制主要是利用有机酸在共质体中螯合铝离子从而赋予植物对铝的耐受能力，减小铝的毒害。因此无论是外部排斥机制还是内部耐受机制都涉及到有机酸的参与，可见有机酸在缓解铝毒方面具有重要的作用。在铝胁迫下，许多铝耐受型的植物能够分泌不同的有机酸，从而抵御铝的毒害。例如，在铝胁迫后，大豆和玉米能够分泌柠檬酸、荞麦能够分泌草酸、铝耐受型小麦能够分泌苹果酸。植物质膜H+-ATPase是细胞膜上含量最丰富的蛋白，是植物生长所必须的，能够参与多种胁迫响应的调节，包括对铝毒和磷缺乏的调节等。并且，质膜H+-ATPase主要是通过调节有机酸的分泌来调控植物对铝胁迫的应答。Shen等(2005)研究表明大豆能够通过增加质膜H+-ATPase基因表达、促进质膜H+-ATPase翻译后磷酸化，最终增强了大豆根尖柠檬酸的分泌，从而赋予了大豆对铝的高度耐受。而多年来的研究结果表明14-3-3蛋白在调节质膜H+-ATPase的活性中发挥着重要作用。质膜H+-ATPase是14_3_3蛋白在质膜上的主要结合祀点，14-3-3蛋白能够通过与质膜H+-ATPase的C末端结合而维持其磷酸化的稳定性并增加其活性。然而目前有关14-3-3蛋白能否参与铝胁迫应答的研究报道非常少，还缺少具体可信的实验数据来确信14-3-3蛋白在铝胁迫应答中的作用。并且关于铝胁迫下14-3-3蛋白能否参与调节质膜H+-ATPase活性的研究还未见报道。本发明技术是通过Gateway技术构建植物表达载体PK-35S-515F7办，为研究大豆SGFMa基因在植物耐铝机制中的作用提供了有效的分子基因工程技术工具，方便了利用分子生物学的手段研究大豆办基因的功能。以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转办基因的烟草在提高烟草耐铝能力中的应用，为通过基因工程的方法提高植物耐铝能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工`程手段提高植物耐铝能力提高了更多的基因资源。
发明内容
本发明的目的在于通过Gateway技术构建丹波黑大豆(RB)的#Ha基因{SGF14a)的植物表达载体pK-35S-515F7办，该载体中SGF14a基因在35S组成型启动子的控制下表达，通过农杆菌介导的叶盘转化法将该植物表达载体转入野生型烟草中后，外源SGFMa基因在35S组成型启动子控制下能够准确高效表达，同时获得的转基因烟草的耐铝能力及耐受酸性土壤的能力也明显提高。为了实现本发明的目的，本发明提供如下的技术方法1、外源515F7办基因的获得
根据GenBank上发表的大豆办)基因全长序列，设计如下特异性引物 SGF14a 上游5’ -AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3> (含 HindIII 酶切位点) SGF14a 下游5，-CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3，(含有 XhoI 酶切位点)2、植物表达载体ρΚ-355-5Κ^Μ3的构建
Gateway (通路克隆)技术的LR反应构建目的基因的表达载体时，通过重组过程将外源基因连入植物表达载体PK2GW7. O中，不需要经过复杂的限制性内切酶的酶切和连接酶的连接过程,只需要把入门克隆载体和目的载体的质粒DNA混合并加入DNA整合或切离所需要的酶就能够完成目的基因表达载体的构建，因此用Gateway技术构建目的基因的表达载体不仅成功几率高，而且可以节省很多时间。因此，本文利用该技术来构建目的基因办的植物表达载体。构建策略如图3所示，以大豆cDNA为模板，用51^7办基因的特异性引物，通过RT-PCR的方法扩增获得SGFMa基因的全长。然后通过T/A克隆获得pMD18T_515F7办载体，对获得的阳性克隆进行测序检测外源基因办是否发生突变，再经过HindIII和XhoI双酶切pMD18T-5iF7^3和pENTR载体，将SGFMa基因片段亚克隆到pENTR载体上，形成入门克隆载体PENTR-515F7办。最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入门克隆载体PENTR-515F7办和植物载体pK2GW7. O进行LR反应，形成植物表达载体简称pK-35S-515F7办。、植物表达载体PK-35S-515F7办转化农杆菌及转基因烟草筛选
通过电转化法将植物表达载体PK-35S-515F7办转入农杆菌pMP105菌中，经壮观霉素(Spe)筛选得到阳性克隆，经菌液PCR检测阳性克隆中是否含有外源植物表达载体^hS-SGFMa质粒。然后通过农杆菌介导的叶盘转化法转染野生型烟草，将转染后的叶片在含有筛选因子Km (卡那抗生素WPCef (头孢噻肟钠抗生素)的芽诱导培养基MS4固体上诱导外植体发芽，约15天继代一次。待有芽生成后，将芽从外植体上切下转入含Km和Cef的生根培养基MS上，进行根诱导生长，得到的能够抗Km的烟草幼苗还需进一步在基因和蛋白水平上检测外源基因是否正确表达。、转基因烟草的检测
经Km筛选得到的能够抗Km的烟草植株，用CTAB法提取其基因组，分别以野生型烟草和转基因型烟草基因组为模板，用外源基因办的特异性引物，经过PCR分析检测，外源基因是否插入到野生型烟草 基因组中。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取野生型烟草和转基因烟草的RNA，在反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SGFMa基因的特异性引物，经过RT-PCR法检测外源基因515F7办能够正确转录。最后通过Western-blotting法从蛋白水平上分析外源基因在烟草中的表达情况。、转基因烟草耐铝能力分析
由于我们的研究结果发现铝胁迫能够诱导RB根中SGF14a基因的表达，因此我们在野生型烟草中过量表达来自RB饱SGFMa基因后，考察转基因烟草对铝胁迫的响应情况。将生长一致的野生型和转基因烟草在水培条件下培养2周后，再用50μΜ的AlCl3 (ρΗ4. 3)处理24h后，检测烟草根相对生长量的变化，以及铝胁迫后野生型烟草和转基因烟草的可溶性总蛋白、MDA和H2O2含量的变化。最后，由于铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一，因此为了模拟在实际生产中本发明的应用，我们将野生型烟草和转基因烟草在酸性土壤中培养，观察其在酸性土壤中的生长情况，考察本发明在实际生长条件下是否具有潜在的利用价值。本发明相对于现有技术的优点和技术效果如下
本发明提供的植物表达载体为进一步研究办对铝胁迫的应答提供了更好的基因工程操作手段和工具，以及通过该载体转染野生型烟草所获得的转办基因的烟草扩大了在增强作物对酸性土壤耐受性及在提高烟草耐铝能力中的应用，为通过基因工程的方法提高植物耐铝能力奠定了理论基础。同时，本发明中所获得的结果能够为我们通过基因工程手段提高植物耐铝能力奠定理论基础以及提供更多的基因资源。
图1为本发明中铝胁迫下SGF14a基因转录水平变化电泳示意 图2为本发明中外源515F7办基因的获得电泳示意图；其中A ..SGFMa基因PCR产物；B ..SGFMa 基因 PCR 胶回收，图中 M Maker III ；
图3为本发明中植物表达载体ρΚ-355-5Κ^Μ3的构建策略示意 图4为本发明中TA克隆载体ρΜ0-18Τ-5Κ^7办的检测电泳示意图；其中A :pMD18T-515F743酶切检测，图中1_4表示不同质粒的编号，对照是没有经过酶切；B :ΡΜ 18 -SGFl4a质粒和菌液PCR检测，图中M为Maker III ；
图5为本发明中入门克隆载体pENTR-515F7办的检测电泳示意图，其中A是2B(pENTR)和pMD18T-5^F7^3的HindIII和XhoI双酶切后胶回收产物；B是入门克隆载体PENTR-515F7办双酶切检测，图中1_4表示不同质粒的编号，对照是没有经过酶切；C是入门克隆载体pENTR-5iF7^3菌液和质粒PCR检测，图中M为Maker III ；
图6为本发明中植物表达载体pK-35S-515F7办的检测电泳示意图，其中A是植物表达载体的HindIII和XhoI双酶切以及HindIII单酶切检测，图中A-D表示不同编号质粒经过HindIII和XhoI双酶切，a-d表示不同编号质粒经HindIII单酶切；B是植物表达载体pK-35S-5^F7办的质粒和菌液PCR检测，图中M =Maker III ；
图7为本发明中植物表达载体pK-35S-5K^M3电转农杆菌pMP105后的菌液PCR检测电泳示意图；其中1-6是获得的不 同农杆菌单菌落编号，图中对照为没有加农杆菌单菌落;M为 Maker III ；
图8是本发明转基因烟草的筛选流程示意 图9是本发明转基因烟草的鉴定电泳示意图，其中A是基因组PCR检测示意图，图中负对照是没有加基因组；CK是以ρΚ-355-5Κ^7办的质粒为模板，作为正对照；WT :野生型烟草；4、9、11、12、13、19和23是获得的不同的转基因柱系；M :Maker III ;B是转基因植物的RT-PCR检测示意图，图中WT :野生型烟草；4、9、11、12、13、19和23是获得的不同的转基因柱系；M :Maker III ;C是转基因烟草Western-blotting检测示意图，图中WT :野生型烟草；S1US19和S23是最终获得的转SGFMa基因烟草植株；
图10是本发明铝胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草相对根生长量和根中可溶性总蛋白含量的变化示意图，其中A是野生型烟草(WT)和转基因烟草(S11、S19和S23)经50μΜ的A1C13溶液处理24h后根相对生长量(RRG)的变化示意图；B是野生型烟草(WT)和转基因烟草(S11、S19和S23)经50μΜ的A1C13溶液处理24h后可溶性总蛋白含量变化示意图；图11是本发明铝胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草根中丙二醛和H2O2含量的变化，其中A是野生型烟草(WT)和转基因烟草(Sll、S19和S23)经50μΜ的AlCl3溶液处理24h后MDA变化示意图；B是野生型烟草(WT)和转基因烟草(Sll、S19和S23)经50μΜ的AlCl3溶液处理24h后H2O2的变化示意 图12是本发明酸性土壤中转基因烟草和野生型烟草的生长30天的状况示意图，图中WT是是野生型烟草；S11、S19和S23是获得的不同转基因柱系；
图13是本发明酸性土壤中转基因烟草和野生型烟草的生长90天的状况示意图，图中WT是是野生型烟草；S11、S19和S23是获得的不同转基因柱系。
具体实施例方式本实施中采用的试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司。其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 :外源SGF14a基因的获得
(I)铝胁迫下SGF14a基因的表达水平检测
选取水培2周的生长一致的丹波黑大豆(RB)幼苗，先用pH4. 3的O. 5mM CaCl2预处理过夜后，然后置 于50μΜ的AlCl3溶液(含有O. 5mM CaCl2, pH 4. 3)分别处理O (CK)、2、4、8、12和24 h后，收集的O. 3g的1-2 cm根尖样品，速用液氮冻存，使用Trolz试剂盒提取根尖总RNA，用DNase消化RNA中可能残留的DNA，经苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提纯化。从各 RNA 样品中取 5Kg,用 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega 公司)反转录合成cDNA，以反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，以28s rRNA为内参进行RT-PCR分析。根据SGF14a基因序列设计引物为5-AGGTTGAGGAGTTGACGGTGGA-3，下游5-GCGGATGGGATGAGGTTGGAC-3 ；28S rRNA 的引物序列上游5-CCCGTCTCAGATTGGTGTCATT_3，下游5-ATAGCGAGCAAGTCGGTGGATT-3。结果如图1所示，从图中可以看出，随着铝处理时间的延长，SGF14a呈现出逐渐上升的表达的趋势，这说明在铝胁迫下，能够显著诱导SGF14a基因的表达。(2)外源SGF14a基因的克隆
提取RB根中总RNA，反转录为cDNA后，以反转录的cDNA为模板，用带有合适酶切位点的SGF14a基因引物扩增获得的基因片段。引物序列上游为5_AAGCTTATGTCGGATTCTTCTCGGGAGGAG-3 (含 HindIII 酶切位点)，下游为5_CTCGAGCTATTCACCTGGTTGTTGCTTAGAT-3 C^XhoI酶切位点)。实验结果如图2显示，从图中可以看出PCR产物大小大约在O. 8Kb(图2A)，与目的基因SGF14a的大小(774)类似。然后将PCR产物切胶，用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物(图2B)，以便后续的T/A克隆。实施例2 :植物表达载体pK-35S-515F7办的构建 (1)T/A克隆载体的构建
植物表达载体的构建策略如图3所示，将经胶回收得到的PCR产物(两端带有HindIII和XhoI酶切位点)，在T4-DNA连接酶的作用下与pMD-18T载体进行连接，得到重组载体ΡΜ 18 -SGFMa0然后通过酶切和PCR来检测重组载体pMD18T_515F7办是否连接正确。由于SGFMa基因两端含有HindIII和XhoI酶切位点，用这两个酶酶切重组载体的质粒，如果连接正确能够酶切出与目的基因大小类似的片段O. 8Kb (图4A)。同时，经过菌液和质粒PCR检测发现都能够扩增出与目的基因大小类似的片段O. 8Kb (图4B)，而负对照并不能扩增出目的基因大小的片段。
(2)入门克隆载体pENTR_SGF14a载体的构建
用HindIII和XhoI双酶切pMD18T-5^F7办载体和原始入门克隆载体pENTR_2B，经过胶回收试剂盒分别回收酶切后的SGFMa和2B片段，结果如图5A所示。然后在T4-DNA连接酶的作用下将这两个回收的片段连接，得到入门克隆载体pENTR-5^F7办，最后在经过HindIII和XhoI双酶切和PCR检测该入门克隆载体pENTR_515F7办连接是否正确。双酶切结果显示入门克隆载体酶切后能够切出与目的基因大小类似的片段O. 8Kb (图5B)，并且质粒和菌液PCR检测都能够扩增出目的基因大小的片段(图5C)，这与预期结果是一致的。
(3)最终植物表达载体ρΚ-355-5Κ^7办的构建
在LR mix enzyme的作用下，将入门克隆载体pENTR-515F7办与植物表达载体pK2WG7. O进行LR重组反应。然后对获得的重组反应后的最终植物表达载体进行酶切和PCR检测。LR反应步骤为在Gateway的LR反应体系中加入pENTR-515F743和Gateway的目的载体pK2GW7. O 各 150 ng, I μ L LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen),混均勻于 25°C反应过夜，通过整合酶的作用把515F7办基因整合到PK2GW7中，获得515F7办的植物表达载体卩1(-355-5斯7办。由于在？1(2167.0载体上含有把11(1111酶切位点，如果外源目的基因51^7办(两端带有HindIII和XhoI酶切位点)正确重组进入pK2WG7. O中，则经过HindIII和XhoI双酶切后能够得到O. 8Kb和O. 4Kb (片段太短酶切后不易观察到)片段，以及经过HindIII单酶切后能够得到1. 2Kb的片段，酶切后的结果与预期都一致(图6A)。菌液和质粒PCR后也扩增到了与目的基因大小一致的O. 8Kb片段(图6B)。实施例3 :植物表达载体pK-35S_SGF14a的转化农杆菌及转基因烟草筛选
取少量检测正确的植物表达载体PK-35S-515F7办质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液至杯底；将电转化杯置于电转化仪滑槽中，电击后，立即取出电转化杯迅速加入O. 5mL SOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28°C 200rpm摇床培养3_5h ;室温下,7500rpm离心Imin,弃其上清至100 μ I将细胞悬浮；将细菌涂布带有抗生素的LB固体培养基上，28°C培养2天；挑选阳性克隆，进行菌液PCR检测，菌液PCR扩增结果中可以看到能够得到O. 8Kb的大小片段(见图7,表 I)。
权利要求
1.一种丹波黑大豆基因的植物表达载体pK-35S-515F743，其特征在于该载体通过Gateway技术构建，该载体中含有35S组成型启动子和SGFMa基因。
2.根据权利要求1所述丹波黑大豆SGFMa基因的植物表达载体pK-35S_515F7办，其特征在于'SGFMa基因来源于丹波黑大豆，其GenBank登录号为HM004359。
3.权利要求1所述的丹波黑大豆515F7办基因的植物表达载体pK-35S-515F7办在增强作物对酸性土壤耐受性及提高作物耐铝能力中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丹波黑大豆SGF14a基因的植物表达载体及其应用，本发明首先发现在铝胁迫下RB根中SGF14a基因被显著诱导表达，然后从RB根中克隆得到SGF14a基因的全长序列，并通过Gateway技术构建了植物表达载体pK-35S-SGF14a，经农杆菌介导的叶盘转化法转化野生型烟草，筛选得到能够正确表达SGF14a基因的转基因烟草，最后对获得的转基因烟草进行了耐铝能力分析。实验结果表明在烟草中过量表达外源SGF14a基因能够显著提高烟草的耐铝及耐受酸性土壤能力。本发明中首次报道SGF14a基因能够参与铝胁迫应答，并且通过Gateway技术构建的植物表达载体pK-35S-SGF14a和获得的转基因烟草能够为进一步研究SGF14a基因的在铝胁迫应答中的功能奠定基础，以及为研究铝胁迫应答机制提供了新的基因资源和基因工程操作手段。
文档编号C12N15/82GK103045640SQ20131000046
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者陈丽梅, 郭传龙, 李松, 周磊, 王琳 申请人:昆明理工大学