专利名称：黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用，属于基因工程领域。
背景技术：
14-3-3最先在人脑中发现，其蛋白家族广泛存在于真核生物中，序列高度保守，单体分子量27-32kD，通过与靶蛋白上的ser/thr残基结合来发挥调控功能。在植物中的14-3-3蛋白主要分为e组和非e组两组。不同的同エ型在核心区域显示出高度保守的氨基酸序列。14-3-3蛋白能够以多种机制与靶蛋白相互作用，对各种不同细胞功能和生理过程起调控作用。Testerink C等在大麦胚芽中发现14-3-3蛋白的各种同エ型在大麦萌发过程中表达调控机制不同，其功能也明显不同。在之后的研究中，许多研究表明，14-3-3蛋白还与信号转导、碳氮代谢的调控、叶绿体前前体蛋白的调节、SPS以及PM H+-ATPase活性调节有夫。14-3-3蛋白还參与植物病害和胁迫反应应答，Finnie等发现大麦抵御灰霉病的过程中积累14-3-3蛋白；RobertS M R和Bowles D J发现番茄中14-3-3蛋白在对受伤和病原菌侵染的应答中起作用；拟南芥14-3-3蛋白的GF14X同エ型可与APX3和AKR2等相互作用，在植株抗氧化和抗干旱中起重要作用。
许多研究表明，在植物中其对代谢活动的主要酶类如NR、SPS、PM H+-ATPase活性有调控作用。最新研究表明，由14-3-3蛋白调控的植物细胞功能涉及生物合成代谢酶、囊泡穿梭、细胞周期、细胞凋亡以及细胞信号转导等多个方面。大豆有17种14-3-3蛋白，14-3-3 j在叶片中累积量多，且与叶片的气孔开闭、H+-ATPase磷酸化及活性等相关性強。综述，14-3_3j与GST标签的融合蛋白的报道较少，且这个融合蛋白表达鉴定简单的特性给研究14-3-3j的功能能促进植物抗性研究，进ー步深入研究植物环境胁迫应答提供可行性基础。
发明内容
本发明的目的在于提供黑大豆14-3_3j的原核表达载体，一种能产生14-3_3j蛋白的含黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，14-3-3j蛋白基因来源于黑大豆，其GenBank登录号为AK285891，14-3-3j基因的上游是诱导型Iac启动子。本发明的另一目的是提供14-3_3j蛋白基因原核表达载体的构建表达方法，具体步骤如下
(I)根据GenBank上发表的大豆14_3_3j基因EST全长基因序列，设计如下特异性引
物
I4-3-3j 5， GAATTCATGGCAGGAGCAGAGGGGCTAAACI4-3-3j 3’ CTCGAGTCAGGGCTCATCTAGCTGGTC引物14-3-3j5’含有限制性内切酶EcoRI识别位点，14_3_3j3’含有限制性内切酶XhoI识别位点；
(2)从黑大豆叶片中提取RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以黑大豆叶片cDNA为模板，采用步骤(I)中设计的特异引物，在PCR扩增体系中对14-3-3j基因的cDNA进行扩增，回收纯化14-3-3j基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD18-14-3-3j ；
(3)使用EcoRI和XhoI对质粒pMD18-14-3-3j进行双酶切获得14_3_3j基因，将14-3-3j基因与同样经过双酶切的原核表达载体相连接，转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核重组表达载体；
(4)将重组表达载体转入大肠杆菌BL21中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，IPTG诱导表达14-3-3j蛋白。本发明方法中所述的起始原核表达载体为PGEX-4t-l。本发明方法中所述的14-3-3j基因插入位点在起始原核表达载体的MCS位点。本发明方法中所述的重组工程菌在28°C、lmM IPTG条件下诱导表达14_3_3j蛋
白。·本发明所述原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用，制作的多克隆抗体可以用于检测14-3-3j蛋白表达量和蛋白相互作用的体外验证。本发明利用IPTG诱导型启动子Iac构建14_3_3j基因的原核表达载体，有利于14-3-3J基因在大肠杆菌细胞中过量表达。本发明提供的上述基因序列是ー种能结合多种蛋白调节代谢、适应抗性的基因，用该基因构建的原核表达载体，将上述载体通过热刺激方法导入细菌细胞中，得到表达14-3-3j蛋白的细菌。该融合蛋白用于研究14-3-3j蛋白的结构和功能、制作14-3-3j多克隆抗体和检测转基因植物，为进一歩研究14-3-3j的功能和研究豆科植物相关实验奠定可行性基础。在蛋白实验中，Western blotting、Far-Western、Pull-down和免疫共沉淀等技术应用广泛，本发明表达的14-3-3j融合蛋白带有GST标签，在Far-Western实验中检测GST简单便捷,能更好提高实验效率和准确度；Pull_down技术中利用GST融合蛋白作为探针蛋白是目前该技术的点睛技木。免疫共沉淀能检测蛋白的相互作用，也是体外验证蛋白互作的重要手段之一。GST标签能在上述蛋白分析常用技术中提供简便，快速的定量定性分析。故通过表达的14-3-3融合蛋白，能够用于研究14-3-3j蛋白的结构和功能、制作14-3-3j多克隆抗体和检测转基因植物，为进一歩研究14-3-3j的功能和研究植物相关实验奠定可行性基础。
图1是本发明中原核表达载体pGEX-4t-l-14-3_3j的构建流程示意 图2是本发明中黒大豆总RNA电泳检测图，泳道均为2ul上样量的电泳 图3是本发明中14-3-3j基因扩增后电泳检测图，其中I为Markerlll，泳道2、3和4均为14-3-3j基因扩增产物；
图4是本发明中14-3-3j基因扩增产物胶回收电泳图，其中I为Markerlll，泳道2、3、
4、5和6均为14-3-3j基因扩增产物；
图5是本发明中菌落PCR电泳检测图，其中Mark3为DNA Markerlll，泳道1_6为菌落PCR产物；
图6是本发明中质粒pMD18T-14-3-3j的EcoRI和XhoI双酶切电泳检测图，其中I对照为质粒对照，2、3和4泳道是14-3-3j基因经过EcoR I和Xho I双酶切的酶切产物；
图7是本发明中4t-l质粒酶切电泳检测，其中Mar3为DNA Markerlll ;4t_l为质粒酶切产物；对照是为4t-l质粒。图8是本发明中连接PMD18T后的片段内切酶单切检测电泳示意图，其中Mar3为DNA Markerlll ；Sac I泳道指经Sac I单酶切的酶切产物泳道；Xho I泳道指经Xho I单酶切的酶切产物泳道；
图9是本发明中连接pGEX-4t-l后的PCR产物电泳检测示意图，其中泳道2、4、9和10分别为PCR产物。图10是本发明中蛋白表达位置确定电泳示意图，箭头所指为目的蛋白，约为55kD，IMark是蛋白Mark ；2泳道上清和3泳道沉淀是指经超声破碎后蛋白；
图11是本发明中原核表达载体Pgex-4t-l-14-3-3j诱导表达后SDS-PAGE电泳检测图，其中Mark是蛋白marker-0431 ;0为IPTG未诱导的总蛋白；其后为ImM IPTG分别诱导2h、4h、6h、8h和IOh后的总蛋白；箭头所指为目的蛋白14-3-3j ；
图12是本发明中抗体制备后检测的SDS图，箭头所指为抗体条带；
图13是本发明中以14-3-3j蛋白做抗体免疫共沉淀后检测14-3-3与H+_ATPase互作SDS-PAGE示意图，上面箭头所指为H+-ATPase蛋白条带；中间箭头所指为抗体带；线面箭头所指为14-3-3j蛋白带；
图14是本发明中SDS-PAGE后转膜Western blotting示意图，上面箭头所指为H+-ATPase条带；中间箭头所指为抗体带；下面箭头所指为14_3_3j蛋白带；
图15是本发明中检测植物体14-3-3蛋白表达图，图中箭头所指是14-3-3蛋白。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进ー步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 :原核表达载体pGEX-4t-l-7￥-J-Jj'的构建
原核表达载体pGEX-4t-l-14-3-3j的构建流程如图1所示，首先根据GenBank中大豆叶片14-3-3j的EST的全长基因序列 ，设计ー对引物，并以黑大豆叶片第一链cDNA为模板扩增，得到14-3-3j的全长cDNA序列，回收并纯化14-3-3j全长基因片段后，将其连接至Ij PMD18-T 载体上获得 pMD18-14-3-3j ;用 EcoRI 和 XhoI 双酶切 pMD18_14-3_3j、pGEX-4t-l，回收纯化14-3-3j基因片段以及载体大片段pGEX-4t-l，然后连接、获得重组质粒pGEX-4t-l-14-3-3j，它含有启动子lac，其后紧接14_3_3j基因。具体构建过程如下一、黑大豆叶片14-3-3 j的cDNA扩增及TA克隆1、RNA粗提
根据14-3-3j (登录号AK285891)全长序列，设计如下一对引物
14_3_3j5’ GAATTCatggcaggagcagaggggctaaac 大写处为酶切位点 EcoRl14-3-3 j3’ CTCGAGtcagggctcatctagctggtc,大写处为酶切位点 ZAoI并以黑大豆叶片为材料，使用异TRNrol法提取叶片总RNA，具体操作如下用液氮将0.1g黑大豆叶片研磨成粉末以后，加入Iml RNA的TRNzol提取液，再研磨后；将匀浆样品在室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。转入2ml离心管中，再加入0. 2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s,室温放置3min ； 4 °C、12000rpm离心15 min ;样品分为3层,取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动2min，冰上静置5 min后，4 °CU2000rpm离心15 min ;取上清于新的EP管，加入等体积异丙醇在_20°C沉淀RNA 30min, 4 V、12000rpm离心15 min,让RNA沉淀在管底；DEPC水配制的75%こ醇清洗RNA沉淀两次；4で、13000rpm离心5 min ;用移液枪尽量吸去75%こ醇；真空干燥2min后，加入30 u I DEPC处理水使RNA完全溶解；使用1. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA (如图2)。2、除去粗提液中DNA基因组及RNA的纯化
在 1.5 ml 离心管中依次加入总 RNA 20 ii g，I(M)NaseI 缓冲液 5 ill，DNase I(5U/u I)
2iil，RNase 抑制剂(40U/ill )0. 5 iil，使用 DEPC 水处理补足 50 ill ；37 °C 反应 30 min ;カロA 250ul DEPC水处理后，加入等量苯酚、氯仿和异戊醇混合液(苯酚氯仿异戊醇=25 24:1),充分混勻；4°C、 13000 rpm离心10 min ;取上清于新的离心管,加入等体积氯仿和异戍醇混合液(氯仿异戍醇=24 :1),充分混勻；4°C、13000 rpm离心10 min ;取上清于新的离心管，加入1/10体积的3 M醋酸钠(pH 5. 2)，混匀，再加入等量的异丙醇，-20°C沉淀30min ；4°C> 13000 rpm离心15 min回收沉淀,用70%こ醇清洗两次；真空干燥；用适量DEPC水处理充分溶解后，取2 Ul进行琼脂糖凝胶电泳检测是否除去基因组，其余的_20°C保存。3、cDNA 的合成
以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA，具体步骤为取1. 5ml洁净离心管，分别加入总 RNA 5 ill (约 5 u g)、Oligo (dT) 181 u IUOmM dNTP 1耵、DEPC 处理水补足总体积IOu I ；65°C处理5min后，转至冰上lOmin;向EP管中加入5*RT缓冲液4iil、25mM MgCl24iil、0.1M DTT 2111、尺似86抑制剂1111，25で处理21^11;然后向￡ 中加入1111反转录酶(BioDev) ;25°C处理 20min，42°C反应 70min 后；70°C 5min 使反转录酶失活，得到 cDNA。4、扩增 14-3-3j 的 cDNA 序列
以cDNA为模板、使用弓I物14-3-3 j5'和14_3_3 j3'进行PCR扩增14-3-3j。PCR的25 ii I 体系为Ex-Taq 缓冲液(10*) 2. 5 ii1、Ex-Taq 0. 3 ii1、cDNA 模板 2 ii1、IOmM dNTP0.4 ill、IOMM 14-3-3 j5'引物 Iy1、10 剛 14-3-3 j3'引物 I y1、使用 ddH20 补足 25 y I。反应条件为94°C 2!^11，30个循环，94で变性458，55で退火458，72で有延伸lmin, 72°C反应5min。将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测(如图3)。电泳后，若发现目的条带很微弱而非目的条带亮度却很强，使用液氮法重新处理回收14-3-3 j基因片段，具体步骤为切下包含目的基因的凝胶，并放入2 ml离心管中；向离心管中加入Iml脱色液(0. 3M醋酸钠和ImM EDTA)，放在脱色摇床上进行20min脱色；取出凝胶于保鲜膜上，用滤纸吸干胶周围的水分，并用手术刀将其切成小块，移入用注射器针头穿孔、底部放少许石英棉的0. 5ml离心管中；用镊子夹着离心管浸入液氮中，直至小管中无气泡产生，然后将其放入1. 5ml离心管中；室温IOOOrpm离心IOmin ;回收1. 5ml离心管底部的溶胶液，扔掉0.5ml EP ;向离心管中加入1/50体积的混合液(0.5M MgCl2 + 5%乙酸)，然后加入等体积的异丙醇；-20°C沉淀30min后，4°C、12000 rpm离心25min ;真空干燥2 min ;加入适量8 ill的1*TE (pH8. 0)溶解DNA ;取I yl用于琼脂糖凝胶电泳检测(如图4)。5,14-3-3j 基因的 TA 克隆
采用PMD18-T vector kit (TaKaRa)将回收片段连接到pMD18_T载体上，其具体步骤为向1. 5 ml离心管中分别加入14-3-3 j的cDNA 2. 5 U 1(约250ng)、pMD18T载体0. 5 y I(50 ng/y l)、Ligation Solution I (连接液1)3 ii I,用封ロ膜封好；置于金属浴中16°C过夜连接。使用热刺激转化方法转化大肠杆菌，具体步骤为将感受态大肠杆菌E. coliDH5 a 100 u I加入6iil质粒体系中，混合，混合液冰浴20min，42 °C热刺激45s，再冰浴2min，加入900ii I LB液体培养基，37 °C、200rpm摇床培养60min ;然后10000 rpm离心Imin ;在超净台上吸去上清,剩余约IOOii I时,用枪吸打混勻，转入带有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37°C过夜培养。挑取白色菌落，接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，采用碱裂解法提取质粒，其具体步骤为收集3ml菌液于1. 5ml离心管中，常温12000 rpm离心lmin,加入100 Ul溶液I，振荡至彻底悬浮菌体；加入150 u I溶液II，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，随后将离心管置于冰上l_2min ;加入150 Ul溶液III，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min ； 12000 rpm离心12min ;向吸附柱中加入420 的结合缓冲液，将上步的上清加入吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀；常温12000 rpm离心15 s ;倒掉收集管中的废液，向吸附柱中 加入750 ill的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s ;倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入750 ill的漂洗液，常温12000 rpm离心30 s ;倒掉收集管中的废液，常温12000 rpm离心2 min ;将吸附柱转入新的1. 5ml离心管中，向吸附柱中央加入50 y I的洗脱缓冲液，常温静置5min;常温12000rpm离心I min后收集到纯化的质粒，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测(图5)。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-14-3-3j，具体方法为向0. 5 ml的离心管中分别加入质粒 DNA (50ngM)2u l.EcoRI (Takara)O. 5 u UXhoI 0. 5 u IUOXbuffer(H) 2 yl，使用ddH20补足15 u I ;37°C反应8h ;使用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(图6)。对菌液进行14-3_3j的测序和在NCBI中进行核苷酸比对。ニ、构建原核表达载体
测序和比对验证所扩增基因的正确性后，使用EcoRI和XhoI对质粒pMD18-14-3-3j和pGEX-4t-l进行双酶切分别获得14-3-3j基因和pGEX-4t-l载体，电泳回收纯化后，分别在16で连接16h，即获得原核表达载体pGEX-4t-l-14-3-3j。具体操作如下:向0. 5 ml的离心管中分别加入质粒DNA (50ngM) 2 ii1、EcoRI(Takara )0. 5 u l.XhoI 0. 5 u IUOXbuffer (H)2 u 1，使用 ddH20 补足 15u I ;37°C 反应 8h ；使用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收14-3-3 j和pGEX-4t-l载体，将回收片段进行连接，其具体步骤为向1. 5 ml离心管中分别加入14-3-3 j DNA 3 yl (约300ng)、pGEX-4t_l载体 I ill (lOOng/ u I )> Ligation Solution I 3 ii I,用封ロ膜封好；置于金属浴中 16°C 过夜连接。使用热刺激法将pGEX-4t-l-14-3_3j转入大肠杆菌BL21中，具体步骤为将感受态大肠杆菌万.coh BL21 100 ill加入6 ill质粒体系中；混合液冰浴20 min，42°C热刺激45S，冰浴2 min;加入900 ill LB液体培养基，37で、200 rpm摇床培养60 min ;然后10000rpm离心Imin ;在超净台上吸去上清,剩余约IOOii I时,用枪吸打混勻,转入带有Amp抗性、IPTG、X-Gal的LB平板上，用无菌三角玻璃棒涂布均匀；37で过夜培养；挑取白斑于加有Amp抗性液体LB培养基中37で、180 rpm摇床培养12 h ;提取质粒，进行电泳检测。通过酶切检测获得重组质粒pGEX-4t-l-14-3-3j，具体方法为向0. 5 ml的离心管中分别加入质粒 DNA (50ngM)2 u l.EcoRI (Takara)O. 5 u UXhoI 0. 5 u IUOXbuffer (H)2yl，使用ddH20补足15u I ;37°C反应8h ;使用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测(如图7-9)。实施例2 :原核表达载体pGEX-4t-l-7￥-J-Jj'的原核表达
取500iU融合表达工程菌菌液加入50ml LB液体培养基中，37°C、180 rpm摇床培养2 h;培养结束后，取出I ml，测定菌液0D600值，0D600达到0. 6-0. 8即可，取出2管(2ml/管)菌液，作为未诱导的样品，在锥形瓶中剰余的菌液加入0.1M的IPTG (终浓度为ImM)进行诱导，28°C、IlOrpm摇床培养2h,取出2管(2ml/管)菌液,为诱导2h的样品；同样在诱导4h、6h、8h时分别取2管样品。取样完成后，诱导0、2、4、6、8h和IOh的样品各取一管，用于总蛋白分析。具体步骤为:4°C、12000 rpm离心2 min ;弃上清，加入100 细菌蛋白抽提缓冲液，再加入25 yl5*蛋白上样缓冲液(Loading Buffer);然后煮沸5 min, -20で保存。对样品进行SDS-PAGE电泳检测分析。具体步骤为制备分离胶、浓缩胶，每种样品上样IOii I,电泳后,取出分离胶,置于固定液中，摇床固定30min ;弃固定液,加入染色液染色30 min ;弃染色液,加入脱色液，脱色60 min ;弃脱色液,加入ddH20,摇床45 rpm过夜；取出胶体，置于胶板上进行拍照(图10和11)。取诱导0、2、4、6、8h和IOh的样品中的另一管，用于蛋白分析。具体步骤为4°C、12000 rpm离心2 min ;弃上清,加入100 u I ddH20,悬菌,进行超声破碎(工作3s,暂停5s,反复处理，直到菌液变为澄清)。使用Bradford法測定蛋白浓度，具体方法为
使用 Bradford Solution(BIO-RAD)测定蛋白含量,使用标样0.1 u g/ u I BSA(Takara)配制反应体系
Protein content (Ug)O246810
BSA (ill)020 40 60 80 100
ddH20 ( u I)800 778 756 734 712 690
每管中加入200 u I Bradford Solution，室温放置2min ;使用分光光度计测定OD595, 获得标准曲线Y=32. 549X-0. 224。样品的反应体系为798liI ddH20 + 200 U I Bradford Solution + 2 U I 蛋白样品；对照为800 yl ddH20 + 200 ill Bradford Solution，测定OD595，代入标准曲线计算样品的蛋白浓度。
此案例能够得到经转化的细菌表达的蛋白，经过蛋白纯化，能高产量表达14-3_3j蛋白。实施例3 :14-3_3j蛋白兔抗的制备1、抗原制备将纯化好的14-3-3j蛋白Iml (约含有蛋白5mg)与弗氏佐剂Iml乳化。先在研钵里加入Iml弗氏佐剂，在缓慢加入蛋白液，迅速研磨。反复乳化3-4次。将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。2、兔免疫1)、家兔捉拿方法一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背；2)、初次免疫在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择6-10处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG抗原
O.2mL ;3)、二次免疫第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫；4)、三次免疫第二次免疫后间隔I周再以Img/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。5)、终末免疫第三次免疫后间隔I周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。3、试血末次免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1:16以上(稀释抗体)，即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强1-2次后，再行检测。4、心脏采血将兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；剪去左胸部兔毛，消毒皮肤； 用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位(一般在第三和第四肋骨之间);用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血；将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。5、分离血清将三角烧瓶的血置37°C温箱I小时，再置4°C冰箱内3 4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(O. 01 硫柳萊或O. 02 %置氣纳，最终浓度)，分装后直4 C冰箱中保存备用。6、抗血清检测如图12, Western blotting分析检测制备的抗体
此案例是制备兔抗的基本过程，能够得到粗14-3-3j抗体，经过离心，加入抗凝剂能够长时间保存制备的兔抗。实施例4 :利用上述14-3-3 j兔抗免疫共沉淀检测互作
样品处理1)采用PEG(聚乙二醇)模拟干旱处理黑大豆25°C下黑暗催芽。选取幼芽大小相一致的黑大豆豆苗用霍氏营养液水培2周，用5%(w/v)PEG处理黑豆，时间分别是0h、2h、5h和12h。取0.5g PEG(聚乙二醇)模拟干旱处理的黑大豆叶片样品，在研钵中用液氮速冻，快速研磨。用1.5ml IM的Tris-HCl (pH7. 4)提取总蛋白，12000rpm，4°C下离心lOmin，取上清液备用，沉淀弃去，按照蛋白原核表达实施案例中的蛋白测量方法测定Tris-HCl (pH7. 4)研磨提取后提取液中蛋白含量。免疫共沉淀需要总蛋白量为200 μ g，液体总体系为500 μ I。测定蛋白含量后，按照提取液中蛋白含量，补足免疫共沉淀的蛋白需求量200 μ g，若液体体系不够500 μ I的加入PBS补足500 μ 1，补足500 μ I后，加入10 μ I 一抗(即14-3-3 j制备的抗体)，4°C、40rpm转速下孵育2h,接着加入蛋白protein A-Agarose柱20 μ 1,4OdOrpm转速孵育过夜。过夜后，4°C、3500rpm离心5min,弃上清,接着用PBS清洗3次,每次条件为4°C, 2500rpm, 5min。最后加入32 μ I PBS和8 μ I 5 X loading。沸水浴5min后立即冰浴。取20 μ I煮好的样品进行SDS-PAGE检测，结果如图13所示；经过SDS-PAGE检测后，可通过Western- blotting检测，结果如图14所示。重复上述步骤，然后用半干式转膜，具体操作为1)剪8张大小一致的滤纸和I张PVDF膜，接着将转膜仪用纯酒精擦洗干净；2)取4张滤纸，先用转膜缓冲液浸润滤纸，其过程中应避免产生气泡，然后平整的铺在转膜仪上；3) PVDF膜先在甲醇中侵润5s后，再转入转膜缓冲液中浸润lmin，将其垫在滤纸上方；4)把SDS-PAGE后的凝胶转移到PVDF膜上方；5)将剩下的4张滤纸重复步骤2)，浸润后，将滤纸平铺在DS-PAGE凝胶上方；擦干周围的溶液，赶滤纸、膜和凝胶之间的气泡；6)转膜，条件为40V，100mA。转膜完毕后，以5%脱脂奶粉封闭lh，接着用PBS洗3次，每次Imin ；7)加入一抗(上述14_3_3j兔抗)(1:2000, 20ml PBT(IOmM PBS 中加入吐温-100，终浓度 O. 1%) )，4°C孵育过夜。用 PBS清洗3次，每次IOmin ;8)加入二抗(商业羊抗兔二抗)(1:2000，20ml PBT(IOmM PBS中加入吐温-100，终浓度O. 1%))常温孵育Ih后用PBS清洗3次，每次IOmin ;9)显影(O. 5ml增强剂+0. 5ml稳定剂+0.1ml背景抑制剂,上述试剂均为康为世纪公司生产商业试剂)。实验结果显示提取液总蛋白中，经过14-3-3j抗体的共沉淀，能够分离出H+-ATPase和14-3-3j蛋白，图上有三条条带，箭头所指为目的蛋白，能够证明黑大豆植物体内14-3-3j与H+_ATPase的互作。 实施例5 :采用上述制备的14-3_3j兔抗检测黑大豆中14_3_3蛋白的表达量植物蛋白样品的提取称取黑大豆植物叶片O. 5g，在研钵中液氮冷冻后，迅速研磨成粉末状。用1. 5ml pH7. 4 IM 的 Tris-HCl 提取，4°C下，12000rpm/min 离心 20min。取上清待用，用上述测定蛋白含量的方法测定提取液中的总蛋白含量。测定蛋白表达量需要含有总蛋白60ug,根据测定0D595下的蛋白含量,折算需要的蛋白提取液体积补足60ug ;加入IOul蛋白5Xloading(蛋白上样缓冲液)，沸水浴5min。煮好后的蛋白样品经过SDS-PAGE后，用上述半干式转膜方法，把SDS-PAGE上蛋白转到PVDF膜上。具体操作为1)剪8张大小一致的滤纸和I张PVDF膜，接着将转膜仪用 纯酒精擦洗干净；2)取4张滤纸，先用转膜缓冲液浸润滤纸，其过程中应避免产生气泡，然后平整的铺在转膜仪上；3) PVDF膜先在甲醇中侵润5s后，再转入转膜缓冲液中浸润lmin，将其垫在滤纸上方；4)把SDS-PAGE后的凝胶转移到PVDF膜上方；5)将 剩下的4张滤纸重复步骤2)，浸润后，将滤纸平铺在DS-PAGE凝胶上方；擦干周围的溶液，赶滤纸、膜和凝胶之间的气泡；6)转膜，条件为40V，100mA。转膜完毕后，以5%脱脂奶粉封闭lh，接着用PBS洗3次，每次Imin ;7)加入一抗(上述14_3_3j兔抗)(1:2000, 20ml PBT(IOmM PBS 中加入吐温-100，终浓度 O. 1%) )，4°C孵育过夜。用 PBS清洗3次，每次IOmin ;8)加入二抗(商业羊抗兔抗体)(l:2000，20ml PBT(IOmM PBS中加入吐温-100，终浓度O. 1%))常温孵育Ih后用PBS清洗3次，每次IOmin ;9)显影(O. 5ml增强剂+0. 5ml稳定剂+0.1ml背景抑制剂,上述试剂均为康为世纪生产商业试剂)。经过Western blotting分析黑大豆植物14-3-3蛋白表达量的变化。如图15所示,在Westernblotting之后，pvdf膜上能有清晰的蛋白带显示出来,能够证明植物体内某些蛋白(比如上述H+-ATPase和硝酸还原酶(NR)等代谢酶类)与14_3_3互作，此条带是蛋白互作的体外验证。可根据14-3-3蛋白表达的变化量，从相关代谢途径入手，例如H+-ATPase能调节气孔开度，而气孔开度能直接影响植物抗旱性，可根据14-3-3蛋白表达量变化，分析H+-ATPase表达变化，继而分析植物抗旱能力。即根据植物体内的14-3-3蛋白的靶蛋白与14-3-3相互作用后，分析植物环境适应性的变化 。序列表
<110>昆明理工大学
〈120〉黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体及其应用
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.5
〈210〉I
〈211〉30
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 I
gaattcatgg caggagcaga ggggctaaac30
〈210〉2
〈211〉27
〈212〉DNA〈213〉人工序列 〈400〉 2
ctcgagtcag ggctcatcta gctggtc2权利要求
1.黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，其特征在于其含有14-3-3j蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，其特征在于14-3-3j蛋白基因来源于黑大豆，其GenBank登录号为AK285891。
3.权利要求1所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用。
4.根据权利要求3所述的黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体在制备多克隆抗体中的应用，其特征在于多克隆抗体可用于蛋白表达检测和14-3-3j与体内代谢酶类相互作用的体外验证实验中。
全文摘要
本发明公开一种黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体pGEX-4T-1-14-3-3j，该载体是含有黑大豆14-3-3j蛋白基因的原核表达载体，是从黑大豆中克隆出14-3-3j基因，用T7启动子、lac(乳糖操纵子)在IPTG诱导下控制它在EcoliBL21中过量表达，合成14-3-3j蛋白并分泌到细胞质，通过SDS-PAGE检测其表达水平，实验结果表明在28℃、1mMIPTG诱导4h时14-3-3j蛋白表达量达到最大；本发明提供的原核表达载体能应用在制备多克隆抗体中，制作的多克隆抗体可以用于检测14-3-3j蛋白表达量和蛋白相互作用的体外验证，为研究14-3-3j蛋白的结构和功能提供可行性基础。
文档编号C12N15/70GK103060360SQ201310000498
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者陈丽梅, 周磊, 郭传龙, 李松, 王琳 申请人:昆明理工大学