专利名称：小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液。
背景技术：
卵母细胞又称为卵子，是一个新的生命个体发生发育的前提和基础。随着现代生命科学的发展，卵母细胞是新品种培育、转基因育种和品种改良等方面的重要的材料。对于人类生殖健康而言，卵母细胞的体外成熟培养是试管婴儿诞生的基础。因此，卵母细胞的体外培养技术是现代生殖发育的核心技术。卵母细胞在体内存在于卵巢上，出生后的动物卵巢上存在的卵母细胞停滞于生发泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且数量有限，伴随着年龄的增长，数量不断减少，并最终枯竭。因此，卵母细胞不像雄性生殖细胞精子具有数量庞大和源源不断发生的特点，卵母细胞的体内发生发育特点也就决定了卵子的稀有珍贵。在正常生长发育的情况下，卵母细胞外周包裹有大量的卵丘细胞，自然排卵时，卵母细胞连同外围的卵丘细胞一起排入输卵管内等待同精子结合。在进行胚胎工程操作或辅助生殖技术应用时，由于从卵巢上直接抽取的卵母细胞还未达到完全成熟状态，其中一半以上的卵母细胞周围未完全由卵丘细胞包裹，临床应用中把未完全被卵丘细胞包裹的卵母细胞称为裸卵。目前，由于包裹卵丘细胞的卵母细胞在体外进行成熟培养时能够获得较高的发育质量和成熟率，则裸卵不能被发育成熟，常被废弃，因此造成了卵母细胞资源的浪费。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠裸卵体外成熟方法。本发明要解决的 另外一个技术问题是提供一种用于小鼠的裸卵体外成熟培养液。
对于小鼠裸卵体外成熟方法，本发明采用的技术方案是:包括以下步骤:
(1)小鼠裸卵的分离培养
实验动物为性成熟后小鼠，采用颈部脱臼处死小鼠，取出卵巢组织，清洗血迹，分离除去多余的脂肪组织，将卵巢放置在裸卵洗涤培养液中，体视显微镜下，用分离针轻轻划破卵巢表面有腔卵泡，处于不同发育状态的裸卵进入到裸卵洗涤培养液中，收集裸卵洗涤后随机分组，用裸卵体外成熟培养液进行37°c培养；
(2)小鼠裸卵的成熟检测
小鼠裸卵体外成熟培养24小时后，在显微镜下观察记录培养成熟裸卵排出第一极体情况，并且要求裸卵形态正常，裸卵胞质颜色光泽均一；
成熟培养后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，经磷酸盐缓冲液洗涤，TrionX-1OO细胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭，通过免疫细胞组织化学方法，用抗微管蛋白的单克隆抗体监测成熟裸卵纺锤体的微管蛋白发育状态，裸卵内细胞核遗传物质DNA分裂分离形成第一极体的状况，用细胞核遗传物质DNA特异性染料DAPI染色显示；
(3)小鼠裸卵成熟后发育能力检测
将成熟后的裸卵用裸卵体外成熟培养液洗涤后，用在含乙醇的裸卵体外成熟培养液中孵育，经胚胎培养液KSOM洗涤后，转移到胚胎培养液KSOM微滴中进行培养。作为优选，裸卵洗涤培养液为a-MEM + 10% FBS。作为优选，裸卵体外成熟培养液为α-ΜΕΜ + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/mlhCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin。对于小鼠裸卵体外成熟培养液，本发明采用的技术方案是:由以下组分组成:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin。Forskolin又称毛喉素，作为一种天然化合物和常用的腺苷酸环化酶激活剂，其具有使神经细胞分化的功能，用于许多细胞分化过程，能刺激腺苷酸环化酶的活性并增加cAMP, cAMP是一个信号分子，是细胞发生过程中关键酶的调节因子。本发明的有益效果是:
为了充分挖掘卵母细胞资源，本发明通过在小鼠卵母细胞培养体系中添加同卵母细胞体外成熟相关的化学试剂，建立了小鼠裸卵体外高效成熟发育体系，该体系不仅能够有效人工调控小鼠裸卵的体外成熟，而且成熟后的裸卵能够具有正常卵母细胞形成胚胎的发育能力，从而为小鼠作为实验动物模型在新品种培育、转基因育种和品种改良等方面的重要的材料，也为人类辅助生殖技术的纵深发展提供基础。
具体实施例方式一、实验方法1、小鼠裸卵的分离培养 裸卵洗涤培养液:a -MEM + 10% FBS
裸卵体外成熟培养液:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/mlGlu + 0.23 mM/ml 丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin
实验动物为性成熟后小鼠，为了能够取得较多可用卵母细胞数量，对每只小鼠腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素以促进卵巢上更多卵母细胞发育，激素注射48小时后，采用颈部脱臼处死小鼠，取出卵巢组织，清洗血迹，分离除去多余的脂肪组织，将卵巢放置在裸卵洗涤培养液中，体视显微镜下，用分离针轻轻划破卵巢表面有腔卵泡，处于不同发育状态的裸卵进入到裸卵洗涤培养液中，收集裸卵洗涤后，随机分组，裸卵于37°C在裸卵体外成熟培养液中培养。2、小鼠裸卵的成熟检测
排出第一极体是卵母细胞成熟的最显著的形态学特征，小鼠裸卵经过体外成熟培养24小时后，在显微镜下观察记录培养成熟卵母细胞排出第一极体情况，且以卵母细胞形态正常，卵母细胞胞质颜色光泽均一为基本标准。成熟培养后小鼠卵母细胞用多 聚甲醛固定液固定，经磷酸缓冲盐液洗涤，TrionX-1OO通透，含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐液封闭，用抗微观蛋白的单克隆抗体a-tubulin监测成熟卵母细胞纺锤体的微管蛋白发育状态，用红色荧光罗丹明标记的二抗结合一抗Ct -tubulin抗体，同时，卵母细胞内细胞核遗传物质DNA分裂分离形成第一极体的状况，用细胞核遗传物质DNA特异性染料DAPI染色显示。3、小鼠裸卵成熟后发育能力检测
卵母细胞成熟后经过孤雌激活能够发育形成胚胎，因此，卵母细胞的孤雌激活是检测卵母细胞成熟后发育能力的重要指标。将成熟后的裸卵用培养液洗涤后，用在含7%的乙醇的卵母细胞培养液中孵育6分钟，经胚胎培养液KSOM洗涤后，转移到胚胎培养液KSOM微滴中于37 °C进行培养。二、结果
裸卵在该体外成熟培养液中能够克服外围没有卵丘细胞的成熟协助，在培养液其它组成成分不变的情况下，不含10 uM Forskolin的成熟培养液中裸卵体外培养成熟率为15.5%，采用添加10 uM Forskolin的成熟培养液能够使裸卵的成熟率达到27.5%，具有显著进一步提高裸卵的体外成熟发育效率(P < 0.05)，在成熟培养液中发育成熟的裸卵，排出第一极体，细胞直径达到成熟卵母细胞的大小，卵母细胞形态正常，胞质颜色光泽均一。通过免疫荧光检测分析证实，裸卵在体外成熟过程中随着细胞核和细胞质成熟，裸卵逐渐发生生发泡破裂，减数分裂启动和发生，裸卵细胞核中纺锤体微丝、微管组装形成，染色体排列在纺锤体中央，并由两端的微丝牵引移动。随着微丝的牵引，染色体被分裂到两端，裸卵发生非对称分裂，并将一半染色体遗传物质以第一极体的形式排出。裸卵体外成熟培养过程中染色体遗传物质的迁移排列，纺锤体的微丝、微管形成过程与体内卵母细胞成熟的发生过程一致。通过使用含7%乙醇的卵母细胞激活液，来源于裸卵体外成熟发育的卵母细胞能够正常激活、分裂和发育。孤雌激活的卵母细胞分裂后形成胚胎，胚胎组成中的卵裂球分裂均等，胞质均匀，形态、色泽均一正常。以上所述 的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.小鼠裸卵体外成熟方法，包括以下步骤: (1)小鼠裸卵的分离培养 实验动物为性成熟后小鼠，采用颈部脱臼处死小鼠，取出卵巢组织，清洗血迹，分离除去多余的脂肪组织，将卵巢放置在裸卵洗涤培养液中，体视显微镜下，用分离针轻轻划破卵巢表面有腔卵泡，处于不同发育状态的裸卵进入到裸卵洗涤培养液中，收集裸卵洗涤后随机分组，用裸卵体外成熟培养液进行37°c培养； (2)小鼠裸卵的成熟检测 小鼠裸卵体外成熟培养24小时后，在显微镜下观察记录培养成熟裸卵排出第一极体情况，并且要求裸卵形态正常，裸卵胞质颜色光泽均一； 成熟培养后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，经磷酸盐缓冲液洗涤，TrionX-1OO细胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭，通过免疫细胞组织化学方法，用抗微管蛋白的单克隆抗体监测成 熟裸卵纺锤体的微管蛋白发育状态，裸卵内细胞核遗传物质DNA分裂分离形成第一极体的状况，用细胞核遗传物质DNA特异性染料DAPI染色显示； (3)小鼠裸卵成熟后发育能力检测 将成熟后的裸卵用裸卵体外成熟培养液洗涤后，用在含乙醇的裸卵体外成熟培养液中孵育，经胚胎培养液KSOM洗涤后，转移到胚胎培养液KSOM微滴中进行培养。
2.根据权利要求1所述的小鼠裸卵体外成熟方法，其特征在于，所述裸卵洗涤培养液为 a -MEM + 10% FBS。
3.根据权利要求1所述的小鼠裸卵体外成熟方法，其特征在于，所述裸卵体外成熟培养液为 a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin。
4.一种小鼠裸卵体外成熟培养液，其特征在于，由以下组分组成:a-MEM + 10% FBS +10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸钠 + 10 uM Forskolin。
全文摘要
本发明公开了小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液。其中，小鼠裸卵体外成熟方法的步骤包括(1)小鼠裸卵的分离培养；(2)小鼠裸卵的成熟检测；(3)小鼠裸卵成熟后发育能力检测。小鼠裸卵体外成熟培养液由α-MEM+10%FBS+10ng/mlEGF+1.5U/mlhCG+1mM/mlGlu+0.23mM/ml丙酮酸钠+10uMForskolin组成。本发明通过在小鼠卵母细胞培养体系中添加同卵母细胞体外成熟相关的化学试剂，建立了小鼠裸卵体外高效成熟发育体系，该体系不仅能够有效人工调控小鼠裸卵的体外成熟，而且成熟后的裸卵能够具有正常卵母细胞形成胚胎的发育能力，从而为小鼠作为实验动物模型在新品种培育、转基因育种和品种改良等方面的重要的材料，也为人类辅助生殖技术的纵深发展提供基础。
文档编号C12N5/075GK103074296SQ20131002066
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者杨盼, 曹鸿国, 章孝荣, 张飞, 张运海, 刘亚, 李运生, 陶勇, 方富贵 申请人:安徽农业大学