专利名称：水稻叶色控制基因ho2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻H02(heme oxygenase2)基因，以及转基因互补功能实验鉴定该基因；还涉及利用该基因物调控水稻叶绿体发育，从而调节水稻叶片叶绿素含量，提高光合作用效率，增加农作物的产量。
背景技术：
高等植物叶绿体基因组一般编码大约100个蛋白质，而叶绿体中含有的蛋白质至少超过2000个。因此，绝大多数的叶绿体蛋白是由核基因编码的，在细胞质中翻译后运输到叶绿体中(Abdallah et al.，2000)。质体基因的转录是由两类RNA聚合酶来完成的，即质体编码的RNA聚合酶(PEP)和核基因编码的RNA聚合酶(NEP ；Maliga, 1988;Hajdukiewicz et al., 1997; Hedtke et al., 1997)。这两种 RNA 聚合酶各自负责不同类别的叶绿体基因的转录(Allison et al., 1996; Hajdukiewicz et al., 1997),如与光合作用密切相关的基因是由PEP转录，而持家基因则由NEP转录。但是，少数叶绿体基因如atpB可以被PEP和NEP同 时转录。核基因和质体基因的协同表达是叶绿体发育所必需的。水稻是世界上重要的粮食作物，叶片光合作用效率是决定水稻产量的重要因子。光合作用的高效进行依赖于叶绿素的合成和叶绿体的正常发育，叶绿体不但是植物进行光合作用而且也是许多重要化合物代谢的场所，因此对叶绿体的发生发育过程的研究意义重大。叶色逐渐转绿(virescent)突变体是指叶片发育早期叶绿素含量降低，到成熟时期叶片叶绿素含量几乎恢复正常的一类突变体(Archer and Bonnett, 1987)。与其它叶色突变体不同，这类突变是非致死的，纯合突变个体能够存活和结实，是研究叶绿体发育的良好材料。目前只有少数的水稻virescent突变体的基因被鉴定,它们的功能尚未完全阐明。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种能使水稻具有适宜叶色的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞和利用所述基因对水稻叶色进行改造的方法。本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的:提供一种水稻叶色控制基因H02编码的蛋白质，其具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。作为本发明的一种改进:上述氨基酸序列还包括在Seq ID N0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。本发明还提供一种编码上述两种蛋白质或其功能类似物的基因，其具有Seq IDN0.1所示的核苷酸序列。
作为本发明的一种改进:上述核苷酸序列还包括在Seq ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本发明还提供一种包含上述两种核酸的转基因植物细胞。本发明还提供一种对水稻叶色进行改造的方法，包括用具有Seq ID N0.1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。进一步具体的说:本发明的目的是提供一种从水稻突变体ho2中克隆的新基因H02 JBSeq ID N0.1所示的DNA序列，也包括与Seq ID N0.1所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本发明中的Seq ID N0.2和Heme oxygenase蛋白家族成员蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在Seq ID N0.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明的另一个目的是提供一种用H02基因进行高效的植物转化的方法。具体地说，本发明提供了具有Seq ID N0.1所示的序列的基因或基因部分片段的载体，本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶绿体发生能力的方法。本发明的有益效果:本发明通过图位克隆技术获得控制水稻叶色性状的基因H02，并通过转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。因而，本发明能使水稻具有适宜的叶色，从而提高光合作用效率，最终能提高水稻产量。
图1是水稻叶色突变体ho2的表型；
图2是H02基因在水稻第3染色体上的定位 图3是功能互补实验TO代转基因水稻的表型。1:ho2 ；2:ho2-H02 图4是PC35SH02载体图谱。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。实施例1:H02基因的定位
一、水稻叶色突变体的ho2的分离和遗传分析:
通过对辐射诱变的水稻(日本晴)突变体库的筛选，发明人分离获得了一个水稻黄叶突变体ho2如图1所示。1、材料与方法
水稻(Oryza sativa ssp.japonica Nipponbare)突变体ho2 (heme oxygenase2),来自辐射诱变的水稻(日本晴)突变体库。培养过程及条件:
水稻种子用蒸馏水洗净，放于培养皿中，28°C黑暗条件下浸种2天至露白，然后转移尼龙纱网上，光照生长7天。将生长7天的幼苗小心的从纱网上取下，移栽到PVC板的海绵球上继续在水稻营养液中培养。其中具体条件如下:
在光温可控水稻培养室中，
温度控制:白天28°C， 夜晚22°C ；光照时间:8:00-20:00 ；
光照强度:250-300umol.m_2.s_l ；
水稻培养液PH4.5-5.5，培养液每4天更换一次；
水稻培养液母液配方(国际水稻所):
储备液 I:NH4NO3:914g ；CaCl2:886g 溶于 IOL 水储备液 II =NaH2PO4- 2H20:403g ；K2SO4:714g 溶于 IOL 水储备液 HI =MgSO4 7H20:3240g 溶于 IOL 水储备液IV:(微量元素储备液)
MnCl2- 4H20:15.0g(NH4)6Mo7O2/ 4H20:0.74g
H3BO3:9.34gZnSO4 7H20:0.35gCuSO4-5H20:0.31gFeCl3- 6H20:77.0g
柠檬酸(一水合物):119g
以上试剂分别溶解，然后和500ml浓H2SO4在一起。加蒸馏水至10升使用时，每4L培养液中加储备液1-1V各5ml。2、遗传分析和定位群体:
Ho2突变体和野生型品种日本晴进行正交和反交，F1自交，F2植株水稻溶液培养10天后，统计野生型和叶色突变表型个体的数目，并用统计学方法计算分离比例。通过正反交实验发现，F1植株具有正常的叶色表型，F2中的野生型和叶色突变体的分离比例符合孟德尔单基因隐性突变的分离比，说明H02为单隐性基因。F2定位群体是由ho2突变体(粳稻)和籼稻品种(kasalath)杂交获得，总共鉴定出2945个叶色突变表型的F2个体，单株取叶片，用来提取基因组DNA。3、通过 SSR (Simple Sequence Repeat,简单重复序列)和 STS (sequence-taggedsite,序列标记位点)标记定位H02基因:
采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻幼嫩叶片，经组织研磨机破碎，提取总DNA，获得的DNA溶解于300 μ I无菌水中。每个SSR和STS反应用I μ I DNA样品。在Η02基因的初步定位试验中，对94个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在3.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性，进而进行初步定位分析。定位结果表明，Η02基因初步定位在第3染色体长臂介于STSl(AC099323 -1)和RM16两个标记之间。精细定位Η02基因时，对由2945F2突变个体组成的群体进行STS分析。根据分子标记STSl和RM16之间的BAC序列和公布的kasalath BAC末端序列，我们设计了 9个STS分子标记(STS1-9)，引物序列见表I。利用这些分子标记，将H02基因精确定位于STS3与STS5标记之间72kb的区段(图2)。表1.H02精细定位引物序列信息
权利要求
1.一种水稻叶色控制基因H02编码的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质的氨基酸序列与Seq ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，具有水稻叶色控制的功能。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质的氨基酸序列为SeqIDN0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
3.一种编码根据权利要求1或2所述的蛋白质的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SeqID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在Seq.1DN0.1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
6.一种含有权利要求3-5所述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的植物表达载体为PC35SH02。
8.根据权利要求6所述的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、植物细胞。
9.一种利用如权利要求6所述的植物表达载体对水稻叶色进行改造的方法，其特征在于，所述的表达载体转化植物细胞，将转化的植物细胞培育成植株。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的转化包括农杆菌介导法或基因枪法。
全文摘要
本发明公开了一种水稻叶色控制基因HO2及其应用。从水稻叶色突变体ho2中克隆并鉴定了控制水稻叶色的基因并将其命名为HO2。转基因功能互补实验证明HO2是控制水稻叶色的基因。氨基酸序列比较分析表明HO2蛋白属于Hemeoxygenase蛋白家族。表型观察和生理分析证明本发明克隆的基因具有调控叶绿体发育，进而控制叶色的功能。本发明还在利用基因工程有目的的把黄绿叶特性作为标记性状在良种繁育和杂交育种中应用。本发明通过图位克隆技术获得控制水稻叶色性状的基因HO2，并通过转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。因而，本发明能使水稻具有适宜的叶色，从而提高光合作用效率，最终能提高水稻产量。
文档编号C12N15/82GK103114076SQ20131003349
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者刘洪家, 李青竹, 卢思聪, 刘合芹, 翟国伟, 邵健丰, 陶跃之 申请人:浙江省农业科学院