专利名称：一种维生素b12的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵法制备维生素B12的方法，具体地说，涉及一种维生素B12的提取方法。
背景技术：
维生素B12 (Vitamin B12)又称氰钴胺素(Cyanocobalamin)，也称为动物蛋白因子，是一类含有类似氰钴胺素维生素活性物质的总称。它是唯一含有金属离子的水溶性维生素，又是人体必需的维生素之一。维生素B12的分子式为C63H88CoN14O14P,其熔点很高(320°C时不熔)，无臭无味，极易吸潮，晶体吸水后在空气中稳定。维生素B12溶于水，难溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿和乙醚，遇强光可分解，在210 220°C高温下会变色，在强酸性或强碱性环境中可分解。维生素B12是比较特殊的一种维生素，大多数植物性食品中不含维生素B12，主要存在于动物组织中。维生素B12是人体组织代谢过程中必需的维生素，是人和其它哺乳动物维持生长和促进红细胞生长的重要因子，具有广泛的生理作用，如参与体内甲基转换及叶酸代谢，促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的功能完整。临床上用于治疗恶性贫血和恢复造血功能，也用于神经系统疾病如多发性神经炎、末梢神经麻痹等。总之，维生素B12是一种人体必需的维生素，其生理功能及营养作用正日渐引起全社会的普遍关注。目前我国维生素B12的应用面较窄，主要是医药用。在国外，维生素B12除用于医药方面(约占全部消费量40%左右)以外，还大量应用于营养补充剂和食品加工方面(约占全部消费量的24%左右)，如维生素口服液、维生素强化面粉、婴儿食品等。因此我国的维生素B12应用于食品行业相关产品的市场发展空间很大，可以借鉴发达国家的经验，开发添加维生素B12等多种维生素的营养食品、保健食品等，这样既能改善人们的营养状况和提高人们的身体素质，又能促进维生素B12相关食品行业的发展与进步。虽然Woodward已于1973年以非常出色的工作完成了 Vitamin B12的全化学合成，但目前工业上仍然主要是利用细菌培养液发酵生产维生素B12。以谢氏丙酸杆菌的厌氧发酵工艺为例，其基本提取流程如下:
发酵液—_ — I板框过滤I — I滤饼调浆I — I加热水解I — I板框过滤1->大孔树脂吸附1-> I乙醇解吸1-1氰化钠转化1-1大孔树脂吸附kl丙酮解吸I—氧化铝层析1-m-1真空干燥I一成 品
目前，发酵法生产维生素B12的研究重点主要集中在菌株的选育、优化以及发酵工艺、设备的改进等方面。如专利W02003018826 “制备维生素B12的方法”公开了一种用巨大芽孢杆菌制备维生素B12的方法，主要涉及厌氧条件下巨大芽孢杆菌的发酵工艺。专利CN200510119016.5 “酶催化生产腺苷辅酶维生素B12的方法”公开了一种酶催化生产腺苷辅酶维生素B12的方法:利用三磷酸腺苷一维生素B12腺苷转移酶生产腺苷辅酶维生素B12，其中的羟钴型维生素B12使用的终浓度为0.001-0.05mol/l。该方法具有工艺简洁、生产周期短、生产成本低的特点。利用本发明中的生产工艺获得的终产物腺苷辅酶维生素B12纯度高、稳定性强，可加工成多种剂型，为药用腺苷辅酶维生素B12的大规模生产提供了一条新途径。Nakano 等人(Nakano K, Kataoka H, M at sum ura M.High density culture ofPropionibacterium freudenreichii coupled with propionic acid removal systemwith activated charcoal [J].Ferment Bioeng, 1996,81 (I):37-41.)建立了由旋转陶瓷膜滤器、活性炭填装柱和发酵罐组成的发酵体系。膜滤器和活性炭填装柱可用于去除丙酸和回收重复使用的发酵细胞和培养基，菲氏丙酸杆菌在发酵罐内的发酵液先经旋转陶瓷膜过滤，滤液再进入装填柱，最终的透过液里已不再含有丙酸，可以循环回到发酵罐中重复使用，丙酸和乙酸也可回收成为副产品。与传统的发酵法相比，菲氏丙酸杆菌和糖类等营养物质的利用率都大大提高了，减少了基质的浪费，可进一步降低成本，有利于实际生产的应用和推广。用发酵法生产维生素B12，大多指生产氰基型维生素B12 (又称氰钴胺素)。在发酵液和生产维生素B12菌体细胞内，B12的存在形式主要是腺苷辅酶型B12及少量其它型B12，为了把腺苷辅酶等B12转化成氰基B12，必须使用氰化物，目前普遍使用的氰化物为NaCN，它是剧毒品，在生产过程中存在着职工中毒的安全隐患；产生的废液中有大量的游离氰根，为了环保达标，须加入大量的NaClO进行废水处理；产生的废渣也属危险化学品，须焚烧处理,这样不仅污染环 境,并且增加了生产成本。对于上述问题，虽然专利CN200810008004.9 “一种菌体提取物及其制备方法”实现了维生素B12发酵生产废水的零排放:以维生素B12发酵生产废水为原料，经过乳酸菌、酵母菌和芽胞杆菌的发酵过程后将其制备成微生态制剂产品，并将该产品用于无公害农业领域，开辟出了维生素B12废水的一种新用途，变废为宝。但是，上述方法仍然无法避免制备过程中NaCN的使用。
发明内容
本发明提供了一种发酵法制备维生素B12的新方法，具体地说，是一种维生素B12的提取方法。该方法是指在发酵液的氰化物转化过程中，用化学性质稳定的铁氰络合物代替现有技术中普遍使用的氰化钠，在整个使用过程和生产过程中，不产生对人体、环境有害的物质，废水废渣不用进行氰离子的回收处理，简化了生产工艺，降低了生产成本，并且氰基维生素B12的转化率高于NaCN方法。铁氰络合物转化的具体操作过程为:向维生素B12的发酵液中加入铁氰络合物水溶液，使其反应浓度为200-4000ug/ml。用稀H2S04水溶液调节反应体系的PH值为3.0-8.0，然后将其全部转移至反应瓶中，再滴入2滴消沫剂，控制反应温度为50-120°C，在磁力搅拌反应器中反应0.5-6小时。上述转化过程中的发酵液也可以是发酵滤液或其浓缩液。本发明所述铁氰络合物最好是六氰合铁(II)酸四钾。众所周知，NaCN法转化工艺是把腺苷辅酶B12及其它型B12先转为双氰B12或亚硝基B12、磺酸基B12，最后再全部转成氰基B12，因多次转化，其转化率会降低。而本发明氰基B12的转化工艺简单，生产过程安全，生产条件温和，对环境无污染，使用的原材料价格低廉，具有较高的社会效益和经济效益。本发明实验过程中维生素B12的含量用高压液相色谱仪进行测定。
具体实施例方式原材料及试剂:
I发酵液本实验中所用的发酵液是指将用于生产维生素B12的脱氮假单孢菌(Pseudomonas denitrificans),经常规工艺发酵、水解、过滤后,所得的滤液,其所含维生素B12的主要类型是腺苷辅酶型维生素B12。2铁氰络合物水溶液、NaCN水溶液、亚硝酸钠水溶液。仪器与设备I高压液相色谱(Lc-1OA型)色谱柱:C18L= 30cm d = 3.9mm流动相:甲醇和水的比例为30 %压力:p= 2500psi温度:40°C流速:F= lml/min进样体积:20ul波长:36Inm2磁力搅拌器(85_2型)3全自动机械搅拌不锈钢发酵系统(⑶JT-10-100AUT0B102000型)实施例1在IOOml小烧杯中加入30ml发酵液，在搅拌下加入Iml浓度为20000ug/ml的铁氰络合物水溶液，使铁氰络合物的反应浓度为667ug/ml，用质量百分含量为10%的H2S04水溶液调节反应体系的PH值为3.5±0.5，然后将其全部转移至IOOml的容量瓶中，再滴入2滴消沫剂，在磁力搅拌反应器中反应6小时，控制温度55±5°C，反应完毕，用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液用高压液相色谱测定氰基型维生素B12的含量为52.97ug/ml。对比实施例1在IOOml容量瓶中加入30ml与实施例1相同的发酵液，在搅拌下依次加入3ml冰醋酸，3ml质量百分含量为8%的亚硝酸钠水溶液，2.0ml质量百分含量为2%的NaCN水溶液，2滴消沫剂，在磁力搅拌反应器上反应6小时，控制温度55±5°C，反应完毕，用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液用高压液相色谱测定氰基型维生素B12的含量为52.50ug/ml。
实施例2向容积为IOL的反应罐中加入7L发酵滤液(用NaCN法转化后其氰基维生素B12的含量为115.2ug/ml)，然后边搅拌边加入70ml浓度为20000ug/ml的铁氰络合物水溶液，使铁氰络合物的反应浓度为200ug/ml，用质量百分含量为10%的H2S04水溶液调节反应体系的PH值为7.5±0.5，控制反应温度115±5°C，搅拌转速250转/分，在反应罐中反应0.5小时，反应完毕，取纯净滤液用高压液相色谱测定氰基型维生素B12的含量，结果为117.59ug/ml。实施例3向IOL反应罐中加入7L树脂解吸液的浓缩液(用NaCN法转化后其氰基维生素B12的含量为3300.32ug/ml)，开启搅拌，加入280ml浓度为100000ug/ml的六氰合铁(II)酸四钾水溶液，使六氰合铁(II)酸四钾的反应浓度为4000ug/ml，用质量百分含量为10%的H2S04水溶液调节反应体系的PH值为6.5±0.5，控制反应温度80±5°C，反应罐中反应1.5小时。反应完毕，取滤液用高 压液相色谱测定氰基维生素B12的含量为3368.72ug/ml。。
权利要求
1.一种发酵法制备维生素B12的方法，包括发酵、水解、过滤、氰化物转化、结晶、干燥等过程，其特征在于，氰化物转化过程所用的氰基化合物为铁氰络合物，其反应浓度为200-4000ug/ml，且转化过程中反应体系的PH值为3.0-8.0，反应温度为50_120°C，反应时间为0.5-6小时。
2.如权利 要求1所述的发酵法制备维生素B12的方法，其特征在于，所述铁氰络合物为六氰合铁(II)酸四钾。
全文摘要
本发明涉及一种发酵法制备维生素B12的方法，包括发酵、水解、过滤、氰化物转化、结晶、干燥等过程，尤其是氰化物转化过程所用的氰基化合物为铁氰络合物，其反应浓度为200-4000ug/ml，且反应体系的PH值为3.0-8.0，反应温度为50-120℃，反应时间为0.5-6小时。本发明制备方法克服了目前普遍使用NaCN转化维生素B12所存在的环境污染、工艺复杂、生产成本高、转化收率低等一系列的缺点。
文档编号C12P19/42GK103103235SQ201310046879
公开日2013年5月15日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者冯胜利, 牛瑞昕 申请人:冯胜利