专利名称：副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法，可应用于各级食品药品监督管理机构、出入境检验检疫机构、疾病预防控制机构等对水产食品中的副溶血性弧菌的检测及由副溶血性弧菌弓I发食物中毒事件的快速检测。
背景技术：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种嗜盐性革兰氏阴性非芽孢菌，主要分布于近海海水、海底沉积物、海河交界处、海产品及盐溃食品中，江河水和鱼虾蟹等淡水产品中也可以检出大量副溶血性弧菌。副溶血性弧菌主要引起以急性腹泻、呕吐和发烧为主要症状的急性肠胃炎和败血症，是夏秋季食物中毒的主要致病菌。我国食源性疾病监测网数据显示，副溶血性弧菌食物中毒高居沿海沿江省份微生物食源性疾病首位。江苏省水产品和食品中副溶血性弧菌的平均检出率为47.2%，部分地区最高曾达78.0%，污染较为严重。食品中副溶血性弧菌污染已成为严重影响食品安全的主要危险因素。尽管国内外对副溶血性弧菌的诊断技术研究已较为广泛和深入，但仍缺乏快速、简便、经济的诊断技术。目前，判断副溶血性弧菌食物中毒主要是根据是否能从临床病人的粪便和食物中检测到该致病菌。然而，根据2010年我国颁布的副溶血性弧菌的定量检测方法标准(GB/T 4789.7-2010)，需要对可疑菌落进行生化验证试验，检测工作量相对较大且检测结果一般4-5天才能得出，无法满足及时查明病人中毒原因和进行快速诊断的要求，从而延长病人治疗时间，影响治疗效果。快速检测 病原微生物是及时有效地控制与预防病原的传播、预防食源性疾病的重要前提。传统的细菌培养法、血清学鉴定等实验过程，操作复杂、耗时费力，而且无法对人工难以培养的病原进行检测。随着分子生物学理论和技术的不断发展，核酸探针技术和PCR技术已经得到广泛应用，其具备特异性强、敏感性高、检测快速等优点，但这些方法都需要昂贵的仪器设备和复杂实验条件支持，极大地限制了其自身的推广和普及。目前市场上出现了多种副溶血性弧菌的荧光定量PCR检测试剂盒和快速生化反应检测试剂盒，分离病原体后，鉴定的检测时间缩短为6-10h，与常规方法相比，虽已较大的缩短检测时间，但费用较高，且对操作人员的工作素质有较高要求，因此急需一种经济、快速、简便的检测方法。环介导等温扩增技术是近几年新出现的一种新型恒温核酸扩增方法，该技术的反应原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物(FIP、BIP、F3、B3)，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(60-65 °C左右)保温60分钟，即可完成核酸扩增反应，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生，通过对浊度的观察或加入荧光染料，肉眼直接颜色变化来判定反应结果。若反应时间较长，在此4种引物基础上还可以设计2种环状引物(LF、LB)加速反应，一般可缩短三分之一的反应时间。该技术广泛应用于病毒的检测，在细菌检测上应用较少。据相关文献报道，有研究者将该技术应用于副溶血性的检测，但反应时间较长，45-60分钟才能完成检测，且引物特异性较差，存在假阳性和假阴性结
果O专利号为CN 102586452 A的发明中，前处理用免疫磁珠进行细菌的富集，反应体系中加入环状引物加快反应速度，虽极大地避免的假阴性和假阳性结果，但免疫磁珠价格昂贵，整个检测工作耗时近2小时，很难在日常工作中普及。因此环介导等温扩增技术中特异性强的引物和较短的反应时间尤为重要。
发明内容
发明目的:提供一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法，使其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等优势，为各级食品安全检测机构实现对副溶血性弧菌的快速、准确检测和监测提供技术支持。本发明需要解决的技术问题在于:提供一套副溶血性弧菌的检测方法，该方法能快速的在各类样本中检出副溶 血性弧菌。本发明需要解决的技术问题还在于:提供一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物，为副溶血性弧菌检测试剂盒的高灵敏度和高特异性提供保障。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，包括:
(I)环介导等温核酸扩增体系组分:
反应缓冲液组成:40mM 的 Tris-HCl(pH8.8)、2(M^9KCl、16m]\^9MgS04、20mM 的(NH4)2SO4:0.2% 的 Tween20、l.8M 的 Betaine,2.6 mM 的 dNTPs ;所述反应缓冲液经 0.22u 滤膜过滤，4°C保存；所述反应缓冲液中除dNTPs，其他溶液均经121 °C 15分钟高压，终溶液用无菌水定容。(2) 一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物:两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP。所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其序列分别如下:
F3: 5’ -CGCTGACAATCGCTTCTCAT -3’
B3: 5’ -GTTCTTCGCTTTGGCAATGT -3’
FIP: 5’ -CTGTCACCGAGTGCAACCACTTAACCACACGATCTGGAGCA -3’
BIP: 5’ -CGCATCACAATGGCGCTTCCACCGTTGGAGAAGTGACCTA -3’。所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒其检测方法为:
(1)挑取可疑菌落溶于蒸馏水中，沸水浴10分钟，离心，取上清液作为检测样本核酸，取50 μ I增菌液或菌苔溶于50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA，5000rpm/min,离心Imin,取上清液,置于4°C冰箱备用；
(2)按12.5μ I 反应缓冲液，I μ I 的 5μΜ F3 和Β3，1μ I 的 40 μ M FIP 和 ΒΙΡ，3 μ I的8000U/ml Bst DNA聚合酶，2 μ I的DNA模板，3.5 μ I的去离子水配置反应体系实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64.5°C，时间为25min，85°C灭活5min ;最后用肉眼观察反应后颜色变化或用实时浊度仪监测结果。有白色沉淀生成的为阳性，无白色沉淀生成的为阴性。反应结束后也可加入SYBR Green，变绿色为阳性，变橙色为阴性。根据以上技术方案提出的这副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增快速检测方法同现有技术相比，从样品液制备到判定结果耗时50min，检测灵敏度可达到100fg/25g。具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高、成本低等特点。该方法能有效的分析样品带菌状态，能实现高通量处理样品，大大节省劳动力，降低检测成本，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、粪便等样品中副溶血性弧菌的检测。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。配置模板
将样品放入BPW增菌液中充分冲洗,取Iml增菌液,5000rpm/min,离心Imin,弃上清，取剩下的增菌液50 μ 1，加入50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA，5000rpm/min,离心Imin,取上清液,置于4°C冰箱备用。配置反应体系
12.5 μ I 反应缓冲液，I μ I 的 5 μ M F3 和 Β3，I μ I 的 40 μ M FIP 和 BIP, 3 μ I 的8000U/ml Bst DNA聚合酶，2 μ I的DNA模板，3.5 μ I去离子水。设置反应条件
反应温度为64.5°C，时间为25min，85°C灭活5min。
观察结果
用实时浊度仪LA-320C监测结果，最后用肉眼观察反应后白色沉淀，加入SYBR Green观察颜色变化。5.电泳检测结果 配置1.5 %琼脂糖凝胶,取LAMP反应液加入Loading buffer进行上样,90V电压，电泳50min，EB染色lOmin，照胶。电泳结果呈现梯状条带即为副溶血性弧菌阳性，无条带则为副溶血性弧菌阴性。灵敏度检测:
取副溶血性弧菌RMD2210633的单个菌落溶于50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA，5000rpm/min，离心lmin，取上清液，测定核酸浓度为2.4X 107fg/ml，并依次做倍比稀释。加入配置好的反应体系，64.5°C进行反应，用实时浊度仪LA-320C监测结果。有白色沉淀生成的为阳性，无白色沉淀生成的为阴性。反应结束后也可加入SYBR Green，变绿色为阳性，变橙色为阴性。从样品液制备到判定结果耗时50min，检测灵敏度可达到100fg/25g。具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高、成本低等特点。该方法能有效的分析样品带菌状态，能实现高通量处理样品，大大节省劳动力，降低检测成本，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、粪便等样品中副溶血性弧菌的检测。
权利要求
1.一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于: (1)环介导等温核酸扩增体系组分: 反应缓冲液组成:40mM 的 Tris-HCl(pH8.8)、2(M^9KCl、16m]\^9MgS04、20mM 的(NH4)2S04:0.2% 的 Tween20、l.8M 的 Betaine、2.6 mM 的 dNTPs ； (2)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物:两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP。
2.如权利要求1所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于:所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其序列分别如下:F3: 5’ -CGCTGACAATCGCTTCTCAT -3’B3: 5’ -GTTCTTCGCTTTGGCAATGT -3’FIP: 5’ -CTGTCACCGAGTGCAACCACTTAACCACACGATCTGGAGCA -3’BIP: 5’ -CGCATCACAATGGCGCTTCCACCGTTGGAGAAGTGACCTA -3’。
3.如权利要求1或2所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于:所述反应缓冲液经0.22u滤膜过滤，4°C保存；所述反应缓冲液中除dNTPs，其他溶液均经121°C 15分钟高压，终溶液用无菌水定容。
4.如权利要求1所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒其检测方法为: (O挑取可疑菌落溶于蒸馏水中，沸水浴10分钟，离心，取上清液作为检测样本核酸，取50 μ I增菌液或菌苔溶于50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA，5000rpm/min,离心Imin,取上清液,置于4°C冰箱备用； (2)按 12.5μ I 反应缓冲液，1μ I 的 5μΜ F3/B3，lyl 的 40 μ M FIP/BIP，3μ1 的8000U/ml Bst DNA聚合酶，2 μ I的DNA模板，3.5 μ I的去离子水配置反应体系实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64 .5°C，时间为25min，85°C灭活5min ;最后用肉眼观察反应后颜色变化或用实时浊度仪监测结果。
全文摘要
一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法，从样品液制备到判定结果耗时50min，检测灵敏度可达到100fg/25g。具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高、成本低等特点。该方法能有效的分析样品带菌状态，能实现高通量处理样品，大大节省劳动力，降低检测成本，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、粪便等样品中副溶血性弧菌的检测。
文档编号C12Q1/04GK103194540SQ20131012121
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者刘丽萍, 徐岚 申请人:镇江市疾病预防控制中心