一种α转移葡萄糖苷酶及表达α转移葡萄糖苷酶的菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型的α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。用于重组表达该α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus?niger）Ac4，其保藏编号为CGMCC?No.7417。本发明所得到的重组菌种能够表达α转移葡萄糖苷酶，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。同时，所得重组α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了α转移葡萄糖苷酶的应用领域。
【专利说明】一种Ct转移葡萄糖苷酶及表达α转移葡萄糖苷酶的菌株
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶筛选和重组表达【技术领域】，具体涉及一种种来源于棒曲霉 (Aspergillus clavatus)的α转移葡萄糖苷酶，以及该α转移葡萄糖苷酶在丝状真菌宿 主细胞中的异源表达。
【背景技术】
[0002] α转移葡萄糖苷酶（a -transglucosidase Ε. C. 2. 4. 1. 24)能够从低聚糖类底物 的非还原性末端切开α-1、4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α_1、6糖 苷键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称頂〇,主要包括异 麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等）、糖脂或糖肽等。该酶既具有水解能力，又可以专一地进行葡 萄糖苷键的转移反应，是生产低聚异麦芽糖的必需酶制剂之一。
[0003] α转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生 物体内，在人类的糖原降解及动物、植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α 转移葡萄糖苷酶主要应用于生产頂〇,而頂〇是人类肠道有益菌群双歧杆菌的增殖因子，摄 入后不被人体消化吸收，也不易被大肠中的多数腐败细菌所利用，却能作为双歧杆菌的碳 源而被利用。因此作为一种功能性食品原料，頂〇已被广泛用在各种食品的制造，居各种功 能性低聚糖之首。
[0004] 目前工业上已经有以淀粉或麦芽糖为原料，通过酶法生产低聚异麦芽糖的工艺， 但是已有的生产工艺转化率并不高。此外，虽然我国异麦芽糖产量很高，α转移葡萄糖苷 酶的用量很大，但是没有工业化生产，该酶仍然依赖进口。因此，本领域亟需获得高纯度的 转化活性较高的低聚异麦芽糖，提高生产工艺的转化效率；也亟需获得相应的高活性的α 转移葡萄糖苷酶及其相应的生产菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种α转移葡萄糖苷酶及表达α转移葡萄糖苷酶的菌株， 从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明一个方面提供一种α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID Ν0:1。
[0007] 本发明的另一个方面提供用于编码上述α转移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序 列为 SEQ ID Ν0:2。
[0008] 本发明的α转移葡萄糖苷酶，是从棒曲霉（Aspergillus clavatus)中扩增出的。
[0009] 本发明还提供用于表达上述α转移葡萄糖苷酶的曲霉菌株；
[0010] 一种表达α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,已于2013年4月 7日保存于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 7417。
[0011] 本发明的α转移葡萄糖苷酶和重组黑曲霉菌株用于生产低聚异麦芽糖。
[0012] 本发明所得到的重组菌种能够高效的表达α转移葡萄糖苷酶，且其酶活力大大 高于其在野生菌中的酶活，也高于宿主菌黑曲霉自身表达的α转移葡萄糖苷酶的酶活力。 同时，所得重组的α转移葡萄糖苷酶是由食品安全菌（GRAS)黑曲霉分泌所得，扩大了 α转 移葡萄糖苷酶的应用领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1 :本发明所构建的pGm-Ac4的质粒图谱；
[0014] 图2 :本发明重组菌株的代谢产物的蛋白SDS-PAGE凝胶图，显示了黑曲霉转化子 Ac4的表达情况，以及野生菌和宿主菌黑曲霉G1的蛋白表达情况，其中泳道1所示为蛋白标 准分子量标记，由上至下为116. 0kD，66. 2kD，45. 0kD，35. 0kD，25. OkD和18. 4kD ;泳道2所 示为黑曲霉宿主G1在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所示为Ac4的α转移葡萄糖苷酶 表达情况，在109kDa处可以看到清晰蛋白条带；泳道4所示为野生菌的蛋白表达情况，其无 可检测到的蛋白表达。
【具体实施方式】
[0015] 本发明用到了在遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法。例 如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)等参考书中所记载的技术。但是，这并 不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人员 可以选用已公开的技术来实施本发明实施例中记载的方案。
[0016] 本发明中，核酸是按Y至:V方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向 从左至右书写。
[0017] 对于本发明中所涉及到各个名词，其具体的定义如下：
[0018] 如本文所用，术语"麦芽糖"指一种碳水化合物，是淀粉、糖原、糊精等大分子多糖 类物质在β淀粉酶催化下的主要水解产物。该术语是由两个D-葡萄糖分子以α-1，4-糖 苷键连接构成的二糖，分子式为C 12H220n · Η20。
[0019] 如本文所用，术语"低聚异麦芽糖"和"异麦芽低聚糖"可互换使用，都指选自下组 的一种或多种糖：异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、或潘糖。
[0020] 如本文所用，术语"α转移葡萄糖苷酶"又称为α-D-葡萄糖苷水解酶，能切开麦 芽糖和麦芽低聚糖分子结构中α -1，4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到 另一个葡萄糖分子或麦芽糖或麦芽三糖等分子中的α -1，6位上，其转糖苷作用可将低聚 糖中的α-1，4糖苷键转化成α-1，6糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚 异麦芽糖或糖酯、糖肽等。
[0021] 如本文所用，术语"基因"指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的 区域，以及各编码片段（外显子）之间的插入序列（内含子）。
[0022] 如本文所用，术语"核酸"包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
[0023] 如本文所用，术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互换使用。
[0024] 如本文所用，术语"宿主菌株"或"宿主细胞"是指表达载体或DNA构建物的合适 宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码α转移葡萄糖苷酶的多核苷酸。具体 而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者 经遗传修饰的宿主细胞。术语"宿主菌株"或"宿主细胞"指由丝状真菌菌株细胞所产生的 细胞核原生质体。
[0025] 如本文所用，术语"丝状真菌"指所有丝状形式的真菌亚门生物（参见 INTRODUCTORY MYCOLOGY, 4th Ed. (Alexopoulos，2007)和 AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, 10th Ed. (Kirk et al.，2008))。这些真菌的特征是带有由 几丁质、纤维素和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明所述的丝状真菌在 形态学、生理学和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延伸来完成 的，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以使，但不限于，曲霉属某 种（Aspergillus sp.)(例如棒曲霉（A. clavatus)、烟曲霉（A. fumigatus)、泡盛曲霉 (A. awamori)、黄曲霉（A. flavus)，土曲霉（A. terreus)和米曲霉（A. oryzae))、青霉属某 种（Penicillium sp.)(例如产黄青霉（P.chrysogenum))、新萨托菌属某种（Neosartorya sp.)(例如费希新萨托菌（N.fischeri))、粘帚霉菌属某种（Gliocladium sp.)(例如粉 红粘帚霉（G.roseum))、木霉属某种（Trichoderma sp.)(例如里氏木霉（T.reesei)、绿 色木霉（T. viride)、康宁木霉（T. koningii)、哈茨木霉（T. harzianum))、腐质霉属某种 (Humicola sp.)(例如特异腐质霉（H. insolens)和灰腐质霉（H. grisea))、金孢霉属某种 (Chrysosporium sp·)、镰刀菌属某种（Fusarium sp·)、脉孢霉属某种（Neurospora sp·)、 肉座菌属某种（Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种（Emericella sp.)的细胞。
[0026] 如本文所用，术语"曲霉"或"曲霉属某种"指以前或目前被分类为曲霉属的任何 真菌属。
[0027] 用于将编码α转移葡萄糖苷酶的多核苷酸插入表达载体的方法是本领域熟知 的。一般是通过在方便的限制性位点进行酶切和连接反应来完成的。在一些实施方式中， 所用的限制性酶切位点是SnaBI和Xbal。在其他实施方式中，所用的限制性酶切位点是 SnaBI〇
[0028] 酶表达的分析和酶活力的测定：
[0029] 为了评价α转移葡萄糖苷酶的表达，可以在蛋白水平或核酸水平进行分析。可以 应用的分析方法包括Northern印迹、斑点印迹（DNA或RNA分析）、Southern印迹、放射自 显影、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应）和含有适当标记的探针（基于核酸编码序列）进 行的原位杂交。此外，基因表达可以通过免疫学方法，诸如细胞、组织切片的免疫组织化学 染色或者组织培养基的免疫试验。例如通过Western印迹或ELISA来评估。这样的免疫试 验可以用于定性地和定量地评价α转移葡萄糖苷酶的表达。此类方法的细节是本领域技 术人员已知的，并且用于实施此类方法的许多试剂是可商业获得的。在一些实施方式中，α 转移葡萄糖苷酶的表达通过SDS-PAGE进行分析。
[0030] α转移葡萄糖苷酶的活性测定采用HPLC方法，既可以使用淀粉为原料，也可以使 用麦芽糖为原料，根据生成的异麦芽糖、潘塘等低聚糖的量来判定酶活高低。一种优选的测 定方法包括：以淀粉为原料（浓度10%?40%)，经高温α淀粉酶（〇. 05%?0. 5%)在90°C? 115°C液化到DE10?20,煮沸5分钟?15分钟灭酶，冷却到60°C，调pH到4?7,加普鲁兰 酶（0· 05% ?0· 5%)、α 真菌淀粉酶（〇· 05% ?0· 5%)和 Maltogenase (0· 05% ?0· 5%)，然后 加入α转移葡萄糖苷酶（〇. 05%?0. 5%)进行保温转化（温度30°C?60°C ;时间24?72 小时），从而获得高含量的低聚异麦芽糖浆，对所得糖浆进行HPLC分析。另一种优选的测定 方法包括：以麦芽糖（浓度10%?40%)为底物，加入α转移葡萄糖苷酶（ο. 05%?0. 5%)， 然后进行保温转化（温度30°C?60°C ;时间24?72小时），获得高含量的低聚异麦芽糖 浆，对所得糖浆进行HPLC分析。在一些实施方式中，α转移葡萄糖苷酶的活性选用麦芽糖 作为底物进行测定。
[0031] 本文所述的具体实施例，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本 发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在本发明中，百分比为重量百分比，除非特别说 明。
[0032] 实施例1 : α转移葡萄糖苷酶基因 Ac4的分离
[0033] 按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Omega)从棒曲霉 (Aspergillus clavatus)过夜培养物中提取基因组DNA。然后
[0034] 根据NCBI上的编号为XM_001271890的序列设计PCR引物，用于克隆棒曲霉中的 Ac4基因的正向引物Ac4-F序列如下：
[0035] 5' -CCATTACGTAATGGCCAGTCTCGTAGGCCTTCTTGCCAGT(下划线所示序列为 SnaBI 酶 切位点），
[0036] 反向引物Ac4_R序列如下：
[0037] 5' -CCATTACGTATTACCACTTCAGAATCCAATCCTCAG(下划线所示序列为 SnaBI 酶切位 点）。
[0038] 将该基因用Phusion DNA聚合酶（Thermo scientific)从棒曲霉基因组DNA中扩 增出来。
[0039] 扩增条件：
[0040] 第一步：98°C 保持 3min。
[0041] 第二步：98°C保持10s，然后72°C保持75s，此步骤重复30次。
[0042] 第三步：72°C 保持 10min。
[0043] 使用凝胶纯化试剂盒（Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶 SnaBI (Fermentas)对纯化了的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶SnaBI对质粒pGm 进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶（Fermentas)将上述 两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5a大肠杆菌（Transgen)，用氨节青霉素进行 选择，最终筛选出了目的质粒。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen)。
[0044] 按照制造商的说明书，使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大 肠杆菌克隆中纯化质粒。所得质粒为pGm-Ac4 (图1)，测得的核苷酸序列为SEQ ID N0:2， 其翻译的氨基酸(蛋白）序列为SEQ ID NO :1。序列比对结果表明其是一个新的等位基因， 去掉内含子的直接编码的核苷酸序列为SEQ ID N0 :3。
[0045] 实施例2 :PEG介导的原生质体融合转化黑曲霉
[0046] 吸取黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板中心（9cm培养皿），待菌落长满整个培养 皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30°C、200rpm的条件培养14?16h。
[0047] 用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过 的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，在30°C、200rpm的条件下温浴1?2h，用显微镜观 察检测原生质体化进展。
[0048] 用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生 质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL， 在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。 将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心 并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在 lX10 7f/mL。
[0049] 在冰上，将100 μ L上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反 应用1管。加入10 μ g DNA。加入12. 5 μ L溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。
[0050] 将丽SA顶层琼脂试管熔化并保持在55°C。从冰中移出上述15mL离心管，并向管 中加入lmL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个 顶层琼脂试管中的每一个中加入lmL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并 将平板在30°C下培养7?10d。
[0051] 溶液 A :2. 5mLlM Κ2ΗΡ04,2· 5mLlM ΚΗ2Ρ04,48· 156g MgS04,加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0052] 溶液 B :5mLlM Tris (pH7. 5)，2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0053] 溶液 C :250g PEG4000,2. 77g CaCl2,5mLlM Tris(pH7. 5)，加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0054] 原生质体化溶液：将0· 6g裂解酶（Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0055] MMSA 平板：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KC1，1. 52gKH2P04， 218. 5g山梨醇，lml痕量元素（见下），20g琼脂，加入dlH20至终体积972. 5mL，高压蒸汽灭 菌后加入用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2. 5mL20%MgS04。
[0056] MMSA 顶层琼脂试管：0· 59g 乙酰胺（Sigma)，3. 4g CsCl (Sigma)，0· 52g KC1，1. 52g KH2P04, 218. 5g山梨醇，lml痕量元素，lOg低熔点琼脂糖，加入dlH20至终体积972. 5mL，高 压蒸汽灭菌后，在培养基未凝固时，加入用〇. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖 和2. 5mL20%MgS04，之后立即分装于无菌试管中，每管10mL。
[0057] 痕量元素：在 250mL dlH20 中加入 lg FeS04 · 7Η20,8· 8g ZnS04 · 7Η20,0· 4g CuS04 · 5H20,0· 15g MnS04 · 4H20,0· lg Na2B407 · 10H20, 50mg (NH4) 6M〇7024 · 4H20,0· 2mL 浓 HC1， 完全溶解后用dlH20定容至1L，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0058] CMA平板：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，lg蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终体积 lOOOmL，高压蒸气灭菌。
[0059] CMA液体培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，lg蛋白胨，加入dlH20至终体积 lOOOmL，高压蒸气灭菌。
[0060] 待平板上长出菌落后，挑选25个菌落，按照制造商的说明书，使用真菌基因组DNA 提取试剂盒（Omega)从其过夜培养物中提取基因组DNA。按实施例1所述实验步骤对Ac4 的黑曲霉转化子进行PCR验证，对所得PCR产物进行测序。所得阳性克隆的孢子悬浮液接 种于30mL TSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d，所得发酵液用8层纱布过 滤，滤液在14000Xg条件下离心lOmin，收集上清液。所得上清液即为酶液。将酶液在浓 度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳，对在预期位置处有明显条带的阳性克隆进行HPLC分 析。根据HPLC分析图谱，选取酶活力最高者作为Ac4转移葡萄糖苷酶的重组菌进行进一步 研究。黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,已于2013年4月7日保存于位于北京市朝阳区北 辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心（CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 7417。
[0061] 实施例3 : α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉重组菌株的发酵和酶的表达
[0062] 将表达Ac4 α转移葡萄糖苷酶的黑曲霉转化子的孢子悬浮液接种于30mLTSB发酵 培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d。所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000 X g 条件下离心l〇min，收集上清液。所得上清液即为Ac4a转移葡萄糖苷酶酶液。将酶液在浓 度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳（图2)。
[0063] 电泳结果显示在109kDa处可以看到明显条带，而野生菌没有可见的蛋白条带，宿 主菌G1有极微弱的蛋白条带，但表达量明显远小于重组菌的表达量。
[0064] 配制pH4. 6的醋酸-醋酸钠缓冲液，Ac4酶液用上述缓冲液稀释至合适的浓度。以 10%麦芽糖为底物，加入适量的Ac4酶液，然后在50°C保温转化24小时以上，得到转化产物 低聚异麦芽糖浆。将产物糖浆稀释10倍，取lml稀释糖浆经0. 22 μ m的一次性微孔滤膜过 滤后，进行HPLC分析，结果表明本发明的黑曲霉（Asperillus niger) Ac4可高效的代谢生 产低聚异麦芽糖。
[0065] 实施例4 : α转移葡萄糖苷酶及重组菌株的应用
[0066] 工业生产低聚异麦芽糖浆。以淀粉为原料，加水制成30%粉浆，在pH值为6. 0、温 度为90?120°C条件下，经耐热性α -淀粉酶液化后，在pH值为5. 0、温度为60°C的条件 下，用β_淀粉酶、普鲁兰酶和真菌α-淀粉酶同时作用，转化成麦芽糖后，加入重组表达的 α-转移葡萄糖苷酶(氨基酸序列为SEQ ID NO: 1)进行转苷反应生成异麦芽糖、异麦芽三 糖、四糖及五糖等含α-1，6键的分支低聚糖与潘糖。加入α-转移葡萄糖苷酶使其转化率 明显提高可达40%?50%以上，再经活性炭脱色、离子交换树脂脱盐，浓缩到固形物为75%， 得到普通异麦芽糖浆，其中含异麦芽低聚糖为40%?50%，葡萄糖为40%，再将葡萄糖用酵母 发酵或膜过滤除去，便可得到含异麦芽低聚糖为90%的产品。
【权利要求】
1. 一种α转移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. 用于编码权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
3. 权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶在生产低聚异麦芽糖中的应用。
4. 用于重组表达权利要求1所述的α转移葡萄糖苷酶的曲霉菌株。
5. 如权利要求3所述的曲霉菌株，为黑曲霉（Asperillus niger)Ac4,其保藏编号为 CGMCC No. 7417。
6. 权利要求3所述的曲霉菌株在生产低聚异麦芽糖中的应用。
【文档编号】C12N1/15GK104152422SQ201310174073
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2013年5月13日
【发明者】王华明, 訾祯祯 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所