猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用的制作方法

猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种猪源附红细胞体检测试剂盒，该试剂盒包括：针对猪源附红细胞体G1基因设计的TaqMan探针和引物对，该探针与猪源附红细胞体G1基因第658～793位核苷酸序列特异性结合，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658～793位的核苷酸序列。本发明基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。
【专利说明】猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于动物血液中支原体感染检测【技术领域】，具体涉及一种猪源附红细胞体 检测试剂盒及方法和应用。

【背景技术】
[0002] 猪源附红细胞体属于不能体外培养的嗜血支原体家族中的成员，一般寄生在猪红 细胞的表面和内部。猪源附红细胞体感染在全世界广泛分布，给养猪业带来严重的经济损 失。其急性感染可导致严重的菌血症、急性红细胞溶血，有时可导致年轻仔猪死亡、怀孕母 猪流产等。对于慢性感染的猪只，血液中细菌含量低，临床症状多变，比如可能出现温和的 黄疸、亚健康、生长速度缓慢、生产能力低下或对其他的感染性疾病易感。在强烈的免疫作 用和抗生素治疗之下，猪源附红细胞体依旧可以在宿主体内建立慢性和持续性的感染。猪 感染附红细胞体后，极有可能在症状消失后转化为慢性感染。目前发现感染猪的附红细胞 体（即猪源附红细胞体）有两种，包括猪附红细胞体（Mycoplasma suis)和小附红细胞体 (M. parvum)。由于依靠16S rRNA基因及Rnase P RNA序列的分子鉴定方法才出现不久，对 小附红细胞体的研究尚不充分。
[0003] 尽管早在1932年，附红细胞体病原即已在美国被确认，但其感染的流行病学数据 仍不甚明确，需要一种准确可靠的方法对猪源附红细胞体感染进行诊断和鉴定，进而推动 对该病的防控和净化。猪的附红细胞体病的传统诊断方法包括镜检、血清学检测、普通PCR 扩增等。而临床上该病的诊断主要以镜检为主，其中包括鲜血压片和涂片染色。由于附红 细胞体主要寄生在红细胞表面和血浆中，常导致红细胞变形，但红细胞的变形可以由多种 因素引起，如涂片技术、渗透压的改变等，因此容易将变形红细胞错误判断为附红细胞体， 从而导致误诊。附红细胞体在吉姆萨染色时呈蓝紫色，瑞氏染色呈淡蓝色，吖啶橙染色呈淡 绿色荧光，但是吉姆萨染色和瑞氏染色需要避免变性红细胞（嗜碱性红细胞、多染性红细 胞和豪-周氏小体红细胞）、血小板、抗凝剂和染料颗粒的干扰；载玻片上的污染异物和白 细胞碎片均可能引起非特异性发光，导致检测结果出现假阳性。猪源附红细胞体的血清学 检测方法包括补体结合试验（complement fixation test, CFT)、间接血凝试验（indirect hemagglutination assay, IHA)和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等。由于附红细胞体尚无成熟的体外培养方法，难以获得大量原始抗原而阻 碍了血清学方法的应用。近几年普通PCR诊断方法主要集中在扩增16S rRNA基因上，该基 因序列也是目前最常用的细菌种属分类和鉴定的序列片段。比对多个原核生物、支原体的 16S rRNA基因发现猪源附红细胞体与其他原核生物的相似性很高。在临床采集的猪血样 本可能被多种细菌污染，采用PCR扩增16SrRNA基因极易出现假阳性。因此迫切需要建立 一种准确、特异的猪源附红细胞体检测方法。猪源附红细胞体甘油醛-3-磷酸脱氢酶样蛋 白 1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-likeproteinl,简称 G1 蛋白）基因主 要编码一种黏附蛋白，具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶的功能，为猪源附红细胞体特异性基因。 对小附红细胞体的G1基因（MPG1)进行PCR扩增分析发现其DNA序列与猪附红细胞体G1 基因（MSG1)的核苷酸序列相似性在96. 6%?98. 2%之间，而氨基酸的相似性为98. 2%? 100%之间，两者无显著差异，其中小附红细胞体G1基因在450?550位、600?900位核苷 酸序列与猪附红细胞体G1基因对应序列高度同源。
[0004] 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定时分析的方法。与已有的诊 断方法相比，荧光定量PCR -次可同时对多个样品进行检测和诊断；检测速度更加迅速，结 果判断不需要借助电泳分析，从而大大节省时间并降低了对环境的污染；对检测样品可以 实时定量分析。


【发明内容】

[0005] 本发明要解决目前猪源附红细胞体的检测方法假阳性率高的技术问题，提供一种 基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒特异性 强、灵敏性高，可快速、准确地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0007] 在本发明的一个方面，提供了一种猪源附红细胞体检测试剂盒，所述试剂盒包 括：
[0008] 针对猪源附红细胞体G1基因设计的TaqMan探针，该探针与所述猪源附红细胞体 G1基因第658?793位核苷酸序列特异性结合；
[0009] 针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0010] 优选的，所述探针的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物对的序列如SEQ ID N0 : 2 和 SEQID NO :3 所示。
[0011] 所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品。
[0012] 所述试剂盒还包括：突光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。
[0013] 所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种检测猪源附红细胞体浓度的方法，包括以下 步骤：
[0015] 针对猪源附红细胞体G1基因设计TaqMan探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1 基因第658?793位核苷酸序列特异性结合；
[0016] 针对猪源附红细胞体G1基因设计一对引物，该对引物用于扩增猪源附红细胞体 G1基因第658?793位的核苷酸序列；
[0017] 用所述TaqMan探针及引物，对含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品 进行实时荧光定量PCR检测，根据检测结果绘制出标准曲线；
[0018] 用所述TaqMan探针及引物，对待测猪血样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，根 据所述标准曲线分析待测猪血样品中猪源附红细胞体的浓度。
[0019] 所述探针的序列如SEQ ID N0 :4所示；所述引物的序列如SEQ ID N0 :2和SEQ ID NO :3所示。
[0020] 所述阳性重组质粒是将猪附红细胞体G1全长编码基因插入PMD18-T载体而制得。
[0021] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪源附红细胞体检测试剂盒在制备诊断猪的 附红细胞体病的产品中的应用。
[0022] 本发明基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，具 有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存 在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪 场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024] 图1是本发明实施例1的猪源附红细胞体G1基因 PCR扩增电泳图；
[0025] 图2是本发明实施例1的猪源附红细胞体G1基因阳性质粒酶切鉴定电泳图；
[0026] 图3是本发明实施例3敏感性试验扩增曲线图；
[0027] 图4是本发明实施例3实时荧光定量PCR标准曲线图；
[0028] 图5是本发明实施例4特异性试验扩增曲线图；
[0029] 图6是本发明实施例6猪田间血液样品附红细胞体感染检测结果图。

【具体实施方式】
[0030] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南， 第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0031] 本发明根据GenBank公布的猪附红细胞体G1基因序列（GenBank登录号： AM407404. 1)，设计了 1对引物和TaqMan探针，研制了基于TaqMan探针检测猪源附红细胞 体的实时荧光定量PCR检测试剂盒，并对现场采集的猪血液样品进行了检测。结果显示，设 计的探针对检测猪源附红细胞体具有很高的特异性；质粒DNA的检测阈值达100个拷贝； 检测了 319份临床猪血液样品，猪源附红细胞体的感染样品数为45份（含34份猪附红细 胞体和11份小附红细胞体），两种附红细胞体总的感染阳性率为14. 11%，提示猪源附红细 胞体TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒操作简便、快速，在荧光PCR仪中反应一小时内 即可获得准确结果，特异性强，敏感度高，重复性好，可用于猪的附红细胞体病的临床诊断、 分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等的快速定量检测。
[0032] 本发明的猪源附红细胞体检测试剂盒，包括：
[0033] 针对猪源附红细胞体G1基因设计的TaqMan探针，该探针与猪源附红细胞体G1基 因第658?793位核苷酸序列特异性结合；
[0034] 针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体 G1基因第658?793位的核苷酸序列。
[0035] 在下述优选实施例中，探针的序列如SEQ ID N0 :4所示；引物对的序列如SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所示。
[0036] 实施例1猪源附红细胞体G1基因的克隆和序列分析
[0037] ⑴引物设计：
[0038] 根据GenBank公布的猪附红细胞体G1蛋白编码基因序列（GenBank登录号： AM407404. 1)，应用Primer Premier5. 0软件设计了扩增猪源附红细胞体G1蛋白全长编码 基因的特异性引物，引物序列如下：
[0039] 上游引物 MF1 :5, -GCGGGATCCATGACAATCCACAAAGTAGC-3，（SEQ ID NO :5);
[0040] 下游引物 MR1 :5, -CGCCTGCAGTTAAAGAGAAATGTAGTA-3'（SEQ ID NO :6)。
[0041] (2)猪血液样品基因组DNA提取：
[0042] 用全血基因组DNA提取试剂盒（树脂型，购自赛百盛公司，产品目录号：⑶C-100)， 按照该试剂盒的说明书提取猪血液样品基因组DNA :取500 μ L无菌抗凝全血到lmL纯化树 脂中，颠倒混勻5-6次。室温下温育3min，其间颠倒混勻一次，5000r/min离心3s，收集沉 淀。用lmL GN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混勻，5000r/min离心3s，收集沉淀。用0. 5mL 漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000r/min离心3s，收集沉淀。用0. 8mL无水乙醇悬 浮，装入离心纯化柱，12000r/min离心lmin，倒掉废液收集管中的乙醇，再离心lmin，尽量 除尽乙醇。将离心纯化柱套入一个洁净的1. 5mL离心管中，加入100 μ L TE缓冲液于纯化 树脂上，室温放置3min，12000r/min离心2min，离心管中收集的液体即为洗脱下来的猪血 全基因组DNA。
[0043] (3)猪源附红细胞体G1基因全长序列的扩增：
[0044] 1)猪源附红细胞体G1基因全长序列扩增反应体系如下：2. 5 μ L10倍浓度的Ex TaqBuffer，2y LdNTP，0. 2μ L ExTaq，上、下游引物各 0. 15μ L，2y LDNA 模板，用灭菌双蒸水 补齐至25 μ L。设灭菌双蒸水为阴性对照。
[0045] 2)PCR 扩增反应条件：95°C 5min ;94°C 60s，55°C 45s，72°C 60s，共 35 个循环后， 72°C 延伸 8min。
[0046] 3)扩增产物分析：取5 μ LPCR产物，加入至含有0. 5 μ g/mL溴化乙锭染料的2% 的琼脂糖凝胶中，于125V电压下电泳20min，在凝胶成像系统上观察扩增产物的图谱。并 与阴性对照对比，被检样品孔约在l〇〇〇bp左右出现电泳条带，即进行切胶纯化。结果，成 功地扩增出了猪源附红细胞体G1全长基因（图1)，扩增片段长度为lOllbp。图1中，Μ : DL2000DNAMarker ;1 :目的片段；Ν :阴性对照。
[0047] 4)将目的条带切胶纯化，将回收产物克隆至pMD18-T载体并转化DH5 α感受态 细胞，经酶切鉴定后进行序列测定。结果，成功地构建了含有猪源附红细胞体G1基因的 重组质粒，酶切结果显示外源片段大小正确（图2)，图2中，Ml :DLlkb DNAMarker ;Μ2 : DL2000DNAMarker ;1 :猪源附红细胞体G1基因阳性质粒酶切片段。猪附红细胞体G1基因全 长序列如下：
[0048] ATGACAATCCACAAAGTAGCAATCAATGGATTCGGAAGAATCGGAAGATTACTATTTAGA
[0049] AATCTTCTTTCTTCTCAAGGAGTTCAAGTTGTAGCTGTTAATGACGTAGTTGACATTAAA
[0050] GTTCTTACTCACCTTTTGGTTTATGACAGTGCTCAAGGAAAACTAAAAGATTGAGAAGT
[0051] AAGTTGTGATTCAGAATACATAAGACTAAAGAATGTAAATACTGGAGAAGTTAGAGAAG
[0052] TTAGAGTTTTCAACTTCAATACTGAAAAGATTTATCACTGAGGTGAATTAGAAATTGATT
[0053] GTGTTGTTGAATGTTCAGGAAGATTCTTAACTAAGGAAGCAGTTAAGTGTCACCTTGATG
[0054] CAGGAGCTCAAAAAGTTCTTATTTCAGCTCCTGCAAAGGATGACACTAAGACAGTTGTT
[0055] TACAACGTAAACCATACTCAAATTACCAGCTCAGACAATGTTATTTCAGGAGCTTCATGT
[0056] ACAACTAATGCACTAGCTCCTATCGTAAAAATTATTCACAGAAAATTTGGAATTAATTCTG
[0057] GATTCATGACAACAGTTCATGCTTTCACTTCTGACCAAAGACTTCAAGACTCTCCTCACG
[0058] CTGACCTA AGA AGAGCTAGAGCAGCTGCTGGATCA ATTATTCCTACA ACTACCGGAGCA
[0059]

【权利要求】
1. 一种猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 针对猪源附红细胞体G1基因设计的TaqMan探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基 因第658?793位核苷酸序列特异性结合； 针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基 因第658?793位的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列 如SEQ ID NO :4所示；所述引物对的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3. 根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包 括：含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品。
4. 根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包 括：荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。
5. 根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5'端 标记有突光报告基团，3'端标记有淬灭基团。
6. -种检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤： 针对猪源附红细胞体G1基因设计TaqMan探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基因 第658?793位核苷酸序列特异性结合； 针对猪源附红细胞体G1基因设计一对引物，该对引物用于扩增猪源附红细胞体G1基 因第658?793位的核苷酸序列； 用所述TaqMan探针及引物，对含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品进行 实时荧光定量PCR检测，根据检测结果绘制出标准曲线； 用所述TaqMan探针及引物，对待测猪血样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，根据所 述标准曲线分析待测猪血样品中猪源附红细胞体的浓度。
7. 根据权利要求6所述的检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，所述探针的 序列如SEQ ID NO :4所示；所述引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
8. 根据权利要求6所述的检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，所述阳性重 组质粒是将全长猪附红细胞体G1基因插入pMDIS-T载体而制得。
9. 权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒在制备诊断猪的附红细胞体病的产 品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104152537SQ201310176304
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2013年5月13日
【发明者】周鹏, 陈兆国, 曹薇, 米荣升, 黄燕 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所