专利名称：一种基于荧光标记定量pcr技术的地中海贫血基因检测方法
技术领域：
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法。
背景技术：
地中海贫血(Mediterranean Anemia),也称海洋性贫血(Thalassemia)、库勒(Cooley)贫血、珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β_地贫，分别由α-蛋白基因簇和β_珠蛋白基因簇异常表达引起。该病高发于地中海沿岸、非洲、拉丁美洲、东南亚、东亚、南亚，等热带、亚热带广大地区。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地贫的发病率是15.5%，广东α-地贫的患病率为8.53%。中国人群中，α-地贫的基因型常见的为缺失型一SEA、-α 3_7、- α 4 2和一 1，以及突变型有Constant Spring (Hb CS，基因型为acsa)、Hb Westmead (Hb WS，基因型为 a ws α )和 Hb Quong Sze (Hb QS，基因型为 a QS α )；中国人群中常见的β -地贫缺失型主要为HPFH-SEA和DBT。目前检测缺失型地中海贫血的主要方法有Gap-PCR、高分辨溶解曲线(HRM，High-Resolution Melting)、MLPA(Multiplex Ligation-Dependent Probe AmplificationAssay)、Southern blot分析法等。检测非缺失型地中海贫血的主要方法有PCR-RDB(Reverse Dot Blot)法、变性高效液相色谱(DHPLC, Denaturing High-PerformanceLiquid Chromatogr aphy)法、等位基因特异PCR法(Allele-specific PCR,AS-PCR)法、HRM法和测序法等。以上方法单独应用在地中海贫血基因型检测中各有优缺点。基于荧光标记定量PCR技术是一种广泛用于法医学检测的技术，其优势在于检测精度高，通量大，且操作快速、简单。目前还未见有将AS-PCR法和Gap-PCR法与荧光标记定量PCR技术结合，以实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的一SEA型(东南亚型)，-α3.7, -α4.2, —ΤΗΑΙ(泰国型)，acsa , aQSa和awsa，以及β地中海贫血的HPFH-SEA(异常血红蛋白合并遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症)，东南亚缺失型(HPFH-SEA)和DBT(中国型)地中海贫血基因型检测的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法。采用该方法可实现单管对α地中海贫血的一SEA型，-a3.7, -a4.2, -THAI,a cs a , a QS α和a ws a，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型的检测。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:—种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，包括以下步骤:(一)引物设计(I)设计一条通用引物，该引物与人类基因组没有同源性，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物；(2)针对检测位点，设计一系列基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对或可用于基因片段定量的扩增引物对，包括正向引物和反向引物；(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增弓I物对、位点特异性PCR扩增弓I物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；(二)PCR 检测取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动聚合酶体系组成25μ I或50μ I的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为:待检测DNAl 3ng/l.! 1，各加尾引物的浓度均为0.3 0.5 μ mol/L,通用荧光标记引物0.7 0.9 μ mol/L ;PCR反应条件为:预变性95°C 11分钟，循环程序为95°C 30秒，59 62°C 30秒，72°C 30秒，共25 35个循环，最后72°C 20分钟延伸；(三)结果检测取PCR产物0.3 0.75μ 1，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。上述方法通过引入通用荧光标记引物，再用通用荧光引物对设计的扩增引物对加尾，再进行PCR反应，即可实现对PCR产物的荧光标记，使得只需标记一条引物，即可实现对非荧光标记引物对所扩增产生的PCR产物进行荧光检测，继而实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的一SEA型，-α 3_7，- α 4_2，—THAI, aesa，a QS α和α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型的检测。上述检测方法中·，步骤(二)中的PCR反应条件优选为:95°C 11分钟预变性，循环程序为95 °C 30秒，59°C 30秒，72°C 30秒，28 35个循环，最后72 °C 20分钟延伸。上述检测方法中，步骤(一)中，可以用现有的常规方法对通用引物进行荧光标记，优选采用6-FAM荧光、VIC荧光、NED荧光或PET荧光对通用引物进行标记。更为具体的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，包括以下步骤:(一)引物设计(I)设计一条与人类DNA序列同源性较少的DNA片段作为通用引物，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物；所述通用引物长度为20bp，序列为:5’ -CTCGACACGCATCTGCTCAG-3’，用荧光标记于5 ’端；(2)针对 α 地中海贫血的一SEA 型，-α 3.7，- α 4.2，—ΤΗΑΙ, a cs α , α QS α 和 α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型序列，设计扩增引物对，引物序列和配对如下:2.1)针对a ws α、a es α和α QS α的位点特异性PCR扩增引物:WS-N-F: 5，-AGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3，；WS-M-F:5，-GAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3，；CS-N-F:5’-CGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3’ ；CS-M-F:5，-CGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3，；
QS-N-F:5’ -CTGCGGTGCAAGCCTCCCT-3’ ；QS-M-F:5，-CTGCGGTGCACGGCTCACC-3，；以上引物分别为扩增awsa、aesa和a QS a的正向引物，引物名称中，N=扩增正常基因的引物，M=扩增突变基因的引物；上述引物的反向引物均为:CQW-co-R:5，-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3，；2.2)针对一SEA型检测的位点特异性PCR扩增引物:SEA-a -F:5’ -AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’ ；SEA-a -R:5，-TGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3，；2.3)针对一THAI检测的位点特异性PCR扩增引物:THAIF-F:5’ -ATTCACATACCATACGGTTCAC-3’ ；
THAIF-R:5，-AATTCCCCTGGACTTGAGTG-3，；2.4)针对HPFH-SEA检测的跨越断点式PCR扩增引物:HPFH-F:5，-CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3，；HPFH-M-R:5’ -TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3’ ；HPFH-W-R:5，-GCAAGAAACGAAGAAACTTCAAGCA-3’ ；其中，HPFH-F为公用的正向引物，HPFH-M-R为检测HPFH-SEA突变型的反向引物，HPFH-W-R为检测HPFH-SEA非突变型的反向引物；2.5)针对DBT检测的跨越断点式PCR扩增引物为:DBT-M-F:5，-GCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3，；DBT-R:5’ -GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3’ ；由于DBT的缺失片段包含了 HPFH-SEA缺失片段，所以ΗΡ - RW可用于做DBT的非突变型对照；2.6)针对-α37和-α42的可用于基因片段定量的扩增引物:Yl-Y2-F:5， -CAGGGATGCACCCACTGGCA-3，；Yl-Y2-R:5， -GGGTGAGGAAGGAAGGGGTG-3，；(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增弓I物对、位点特异性PCR扩增弓I物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；并通过比对得到加尾引物的目的扩增片段长度，如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；该步骤中，如果用通用荧光标记引物进行加尾后的两条加尾引物具有相同的长度，那么需要再引入一段序列与通用荧光标记引用共同对扩增引物进行加尾，使加尾后的两条引物的片段长度不一致，从而达到通过判断扩增出来的片段长度即可判断出是不同的基因型的目的。而需要再引入的这段序列只要该段序列与人类基因组没有同源性，并且能使加尾后的两条引物长度不一样即可，它的选择可以有很多种，这些均属于本领域技术人员的公知常识，在此不再一一详细列出。(二)PCR 检测取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动DNA聚合酶体系组成25μ I或50μ I的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为:待检测DNAl 3ng/l.! 1，各加尾引物浓度均为0.3 0.5ymol/L，通用荧光标记引物0.7 0.9 μ mol/L ;PCR反应条件为:预变性95°C 11分钟，循环程序为95 °C 30秒，59 62 °C 30秒，72 °C 30秒，共25 35个循环，最后72°C 20分钟延伸；(三)结果检测取PCR产物0.3 0.75 μ 1，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。与现有技术相比，本发明的特点在于:1、通过引入通用荧光标记引物，再用通用荧光引物对设计的扩增引物对加尾，再进行PCR反应，即可实现对PCR产物的荧光标记，使得只需标记一条引物，即可实现对非荧光标记引物对所扩增产生的PCR产物进行荧光检测，继而实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的_」ΕΑ型，-α 3Λ -α 4_2，一 ΑΙ，a cs α , α QS α和α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地 中海贫血基因型的检测；2、通过通用荧光标记引物的引入，使PCR扩增所需的DNA浓度降低，可以通过采集口腔拭子等对受测者进行检测，操作更简便；3、具有高通量性，可同时进行96个样本的检测，减少人为操作失误；4、在选用一种荧光标记的同时，还至少有3个备用的通用荧光标记引物，可以增加检测位点，实现更多基因型的检测；5、由于可实现单管对多种基因型的检测，使得检测更为快速(从DNA提取到结果获取仅需5 6个小时)、准确,而且费用低廉,操作也更简便。
图1为采用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的“ α -地中海贫血基因检测试剂盒”对样本I 6进行DNA检测的结果图；图2为采用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的“ α -地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”对样本I 6进行DNA检测的结果图；图 3 为根据文献 Tan AS, Quah TC, Low PS, et al.A rapid and reliable7-deletion multiplex polymerase chain reaction assay for alpha—thalassemia.Blood.2001Jull;98(l):250-1.合成的引物，对样本I 6中样本I的一THAI基因进行检测的结果图；图 4 为根据文献 Xu XM, Li ZQ, Liu ZY, et al.Molecular Characterization andPCR Detection of a Deletional HPFH:Application to Rapid Prenatal Diagnosis forCompound Heterozygotes of This Defect With b-Thalassemia in a Chinese Family.Am J Hemato1.2000Nov; 65 (3):183-8.合成的引物，对样本 I 6 中样本 5 的 HPFH-SEA 基因进行检测的结果图；图5为按本发明所述的方法对样本I的检测结果图；图6为按本发明所述的方法对样本2的检测结果图；图7为按本发明所述的方法对样本3的检测结果图；图8为按本发明所述的方法对样本4的检测结果图；图9为按本发明所述的方法对样本5的检测结果图10为按本发明所述的方法对样本6的检测结果图。
具体实施例方式下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。样本说明:以下实施例所用的6个样本(其中阳性样本5个，阴性样本I个)均收集自钦州妇幼保健院，分别编号为样本1、样本2、样本3、样本4、样本5和样本6，且所述的6个样本按现有常规方法分别提取DNA，分别定量稀释成40 50ng/ μ I备用。下面先将上述6个样本用现有试剂盒进行检测，再用本发明所述方法进行检测，以验证本发明所述方法的可行性及准确性。上述6个样本采用现有试剂盒进行检测的具体结果如下:1、使用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的“ α -地中海贫血基因检测试剂盒”对6个样本进行DNA检测，检测的结果如图1所示。由图1可知，样本I 6的检测结果分另 Ij 为 α α/α α、一α3.7/α α、一α4.2/α α、α α/α α、一-SEA/ αα、αα/αα。2、使用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的“α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)”对6个样本进行DNA检测，检测的结果如图2所示。由图2可知，样本 I 6 的检测结果分别为 QSN/CSM/WSN、QSN/CSM/WSN、QSN/CSN/WSM、QSN/CSN/WSN、QSN/CSN/WSN、QSN/CSN/WSN。3、米用根据文献 Tan AS, Quah TC, Low PS, et al.A rapid and reliable7—deletion multiplex polymerase chain reaction assay for alpha—thalassemia.Blood.2001Jull;98(l):250-1.合成的引物，对一THAI基因进行检测，结果如图3所示。由图3可知，样本I存在一THAI基因。
4、根据文献 Xu XM, Li ZQ, Liu ZY, et al.Molecular Characterization and PCRDetection of a Deletional HPFH:Application to Rapid Prenatal Diagnosis forCompound Heterozygotes of This Defect With b-Thalassemia in a Chinese Family.Am J Hematol.2000Nov; 65 (3): 183-8.合成的引物，对HPFH-SEA基因进行检测，结果如图4所示。由图4可知，样本5存在HPFH-SEA基因。此外，样本4经测序验证后为含有DBT突变的样本。综合图1 4以及已经验证的样本4，可知样本I 6的基因型应是:样本I为—THAy α CS Q ；样本 2 为-α 3.7/ a cs α，样本 3 为 _ α 4.2/ α ws α，样本 4 为 α α/α α +DBT,样本5为- jxkI α α +HPFH-SEA,样本6为正常个体。实施例1:本发明所述的检测方法(一)引物设计(I)通过NCBI的Blast功能，设计一条长度为20bp，与人类DNA序列同源性较少的DNA片段作为通用引物，通用引物序列为:5’-CTCGACACGCATCTGCTCAG-3’ (SEQ ID NO:1)，采用6-FAM荧光标记于5’端，即得通用荧光标记引物；此外，采用VIC 荧光标记的 5’ -CTCGACACGCATCTGACGTT-3’ (SEQ ID NO:2)、采用NED 荧光标记的 5’ -CTCGACACGCATCTGGCGAA-3’ (SEQ ID NO:3)以及采用 PET 荧光标记的5’-CTCGACACGCATCTGCTACC-3’ (SEQ ID NO:4)也已经设计出，可以用于后续的多色荧光标记体系；
(2)针对 α 地中海贫血的一SEA 型，-α 3.7，- α 4.2，—ΤΗΑΙ, a cs α , α QS α 和 α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型序列，设计扩增引物对，引物序列和配对如下:2.1)针对a ws α、a es α和α QS α的位点特异性扩增引物:WS-N-F:5’ -AGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3’ (SEQ ID NO:5)；WS-M-F:5，-GAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3’ (SEQ ID NO:6)；CS-N-F:5’-CGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3’ (SEQ ID NO:7)；CS-M-F:5，-CGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3’ (SEQ ID NO:8)；QS-N-F:5，-CTGCGGTGCAAGCCTCCCT-3，(SEQ ID NO:9)；QS-M-F:5’-CTGCGGTGCACGGCTCACC-3’ (SEQ ID NO:10)；以上引物分别为扩增awsa、a cs a和a QS a的正向引物，引物名称中，N=扩增正常基因的引物，M=扩增突变基因的引物；如WS-N-F就是扩增a ws α正常基因的正向引物；上述引物的反向引物均为:CQW-co-R:5’-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’ (SEQ ID NO:11)；2.2)针对一SEA型检测的位点特异性扩增引物:SEA-a-F:5，-AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’ (SEQ ID NO:12)；SEA-a-R:5，-TGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3’ (SEQ ID NO:13)；2.3)针对一THAI检测的位点特异性扩增引物:THAIF-F:5，-ATTCACATACCATACGGTTCAC-3，(SEQ ID NO:14)；THAIF-R:5’ -AATTCCCCTGGACTTGAGTG-3’ (SEQ ID NO:15)；2.4)针对HPFH-SEA检测的跨越断点式扩增引物:HPFH-F:5’ -CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’ (SEQ ID NO:16)；HPFH-M-R:5，-TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3，(SEQ ID NO:17)；HPFH-W-R:5，-GCAAGAAACGAAGAAACTTCAAGCA-3’ (SEQ ID NO:18)；其中，HPFH-F为公用的正向扩增引物，HPFH-M-R为检测HPFH-SEA突变型的反向扩增引物，HPFH-W-R为检测HPFH-SEA非突变型的反向扩增引物；2.5)针对DBT检测的跨越断点式扩增引物为:DBT-M-F:5，-GCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3’ (SEQ ID NO:19)；DBT-R:5’ -GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:20)；由于DBT的缺失片段包含了 HPFH-SEA缺失片段，所以HPFH-W-R可用于做DBT的非突变型对照；2.6)针对- a 3 7和- a 4 2的可用于基因片段定量的扩增引物:Yl-Y2-F:5，-CAGGGATGCACCCACTGGCA-3’ (SEQ ID NO:21)；Yl-Y2-R:5，-GGGTGAGGAAGGAAGGGGTG-3J (SEQ ID NO:22)；(3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增弓I物对、位点特异性PCR扩增弓I物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组；并通过比对得到加尾引物的目的扩增片段长度；3.1)针对a ws a、a es α和a QS a的加尾引物组:用通用 荧光标记引物对扩增a ws a、a es α和a QS α的正向引物进行加尾，所得加尾引物如下:WS-N-F 加尾:5， -CTCGACACGCATCTGCTCAGTCCTTGTAAAGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3，(SEQ ID NO:23)；WS-M-F 加尾:5， -CTCGACACGCATCTGCTCAGGATAACTCCTTGTAGAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3’ (SEQ ID NO:24)；CS-N-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGCGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3，(SEQ IDNO:25)；CS-M-F 加尾:5， -CTCGACACGCATCTGCTCAGGATAACTCCTTGTACGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3’ (SEQ ID NO:26)；QS-N-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGCTGCGGTGCAAGCCTCCC[T+]-3，(S EQ IDNO:27)；QS-M-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGAATTGCATCTGCGGTGCACGGCTCACC -3，(SEQID NO:28)；引物名称中，N=扩增正常基因的引物，M=扩增突变基因的引物；带有“加尾”二字的序列代表是对引物进行加尾后所得的序列，如WS-N-F加尾表示对扩增Ciwsa正常基因的正向引物进行加尾后所得的加尾引物；在上述针对Ciwsa、Cicsa和a QSa的加尾引物中，当只用荧光标记引物对WS_N_F和WS-M-F加尾时所得的加尾引物的片段长度是一样，在后续的检测过程中则不能区分到底是awsa的正常基因还是突变型基因，为了达到能够区分是Ciwsa的正常基因还是突变型基因的目的，需要再分别引入不同的一段序列与通用荧光标记引物共同对它们进行加尾，在本实施例中，对于WS-N-F引物引入的序列为:5’-TCCTTGTAA-3’ (SEQ ID N0:29)，而对于WS-M-F引物引入的序列为:5’-GATAACTCCTTGTA-3’ (SEQ ID NO:30)。基于与上述同样的目的，在对CS-M-F弓I物和QS-M-F弓I物进行加尾时也分别又弓I入了不同的一段序列，其中对于 CS-M-F 引物引入的序列为:5’ -GATAACTCCTTGTA-3’ (SEQ ID NO:30)，对于 QS-M-F引物引入的序列为:5’-AATTGCAT-3’(SEQ ID NO:31)。为增加QS-N-F引物的特异性，我们在引物的3’末端的T碱基米用了 LNA (locked nucleic acid,锁基因)进行标记,米用该技术后，QS-N-F引物的特异性增强。上述引物的反向引物均为:CQW-co-R:5，-ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’ (SEQ ID NO:11)；将反向引物分别与上述正向加尾引物组合，所得目的扩增片段长度为:WS-N:270bp ；WS-M:276bp ；CS-N:206bp ；CS-M:21 4bp ；QS-N:252bp ；QS-M:260bp ；如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；3.2)针对一SEA型检测的加尾引物组:
用通用荧光标记引物对一SEA型的反向扩增引物进行加尾，所得加尾引物组如下:SEA-a-F:5，-AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’ (SEQ ID NO:12)；SEA- a -R 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGTGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3，(SEQID NO:32)；将上述正向引物与反向加尾引物组合，所得目的扩增片段长度为:SEA=150bp ；如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；3.3)针对一THAI检测的加尾弓I物组:用通用荧光标记引物对一THAI型的正向扩增引物进行加尾，所得加尾引物组如下:THAIF-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGATTCACATACCATACGGTTCAC-3，(SEQ IDNO:33)；THAIF-R:5’ -AATTCCCCTGGACTTGAGTG-3’ (SEQ ID NO:15)；将上述正向加尾引物与反向引物组合，所得目的扩增片段长度为:THAI=197bp ；如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；· 3.4)针对HPFH-SEA检测的加尾弓丨物组:用通用荧光标记引物对HPFH-SEA型的突变型和非突变型反向扩增引物进行加尾，所得加尾引物组如下:HPFH-F:5’ -CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’ (SEQ ID NO:16)；HPFH-M-R 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGTGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3，(SEQ IDNO:34)；HPFH - W-R 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGGCAAGAAACGAAGAAACTTCAAGCA-3，(SEQ ID NO:35)；其中，HPFH-F为公用的正向扩增引物，HPFH - M-R为检测HPFH-SEA突变型的反向扩增引物的加尾引物，HPFH - W-R为检测HPFH-SEA非突变型的反向扩增引物的加尾引物；将上述正向引物分别与上述突变型反向加尾引物和非突变型反向加尾引物组合，所得目的扩增片段长度为:HPFH-M=396bp ；HPFH-ff=419bp ；如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；3.5)针对DBT检测的加尾引物组:用通用荧光标记引物对DBT型的突变型正向扩增引物进行加尾，所得加尾引物组如下:DBT-M-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGGCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3’ (SEQ IDNO:36)；DBT-R:5，-GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3’ (SEQ ID NO:20)；
由于DBT的缺失片段包含了 HPFH-SEA缺失片段，所以HPFH-W-R可用于做DBT的非突变型对照；将上述正向加尾引物与反向引物组合，所得目的扩增片段长度为:DBT-M=231bp ；如果后续的结果检测中，在对应的片段大小中出现检测峰，则证明该基因存在于受测样本中；3.6)针对- α 3 7和- α 4 2的加尾引物组:-α37和-α42的基因型检测的加尾引物组均为:Y1-Y2-F 加尾:5，-CTCGACACGCATCTGCTCAGCAGGGATGCACCCACTGGCA-3，(SEQ ID NO:37)；Yl-Y2-R:5’ -GGGTGAGGAAGGAAGGGGTG-3J (SEQ ID NO:22)；将上述正向加尾引物与反向引物组合，所得目的扩增片段长度为:Yl=90bp ；Y2=93bp ； 在后续的结果检测中:如果93=90(峰值)，则正常；如果93为2倍的90，则为-α 37 ;如果90为2倍的93，则为-α 42 ;如果出现Yl=O (峰值)的情况，则为一 1或者一SEA+_ α 3_7，或者-α 3 7+_ α 3_7，具体属于哪种基因型需要根据峰图综合判断；如果出现Υ2=0 (峰值)的情况，则为一 1或者一SEA+_ α 4_2，或者-α 4_2+- α 4_2，具体属于哪种基因型需要根据峰图综合判断；(二)PCR 检测取样本1、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动DNA聚合酶体系组成25 μ I的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为:样本I的浓度均为2ng/y 1，各加尾引物组中的各引物的浓度均为0.4μ mol/L，通用荧光标记引物0.8 μ mol/L ;PCR反应条件为:预变性95°C 11分钟，循环程序为95°C 30秒，59°C 30秒，72°C 30秒，共32个循环，最后72°C 20分钟延伸；(三)结果检测取上述步骤(二)中的PCR产物0.5μ 1，混合测序系统的分子量内参，以及测序上样载体去离子甲酰胺(HiDi)IOy 1，混合后采用测序仪进行上样测序，采用Genemapper分析结果。结果如图5所示，图5中Υ1=Υ2，ΤΗΑΙ有峰，CSM、QSN、WSN有峰，HPFH-W有峰，其余无峰。结合现有检测结果图1 4，可以独立判断出样本I的基因型为--ΤΗΑΙ/α%基因型地贫；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本I的基因型为一基因型地贫。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。实施例2:重复实施例1的方法，不同的是，用样本2代替样本1，结果如图6所示。
图6 中，2Y1=Y2，CSM、QSN、WSN 有峰，HPFH-W 有峰，其余无峰。结合现有检测结果图1 4，可以独立判断出样本2的基因型为-α37/。、基因型地贫；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本2的基因型为_a3.7/acsa基因型地贫。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。实施例3重复实施例1的方法，不同的是，用样本3代替样本1，结果如图7所示。图7 中，Y1=2Y2，CSN、QSN、WSW 有峰，HPFH-W 有峰，其余无峰。结合现有检测结果图1 4，可以独立判断出样本3的基因型为-a42/awsa基因型地贫；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本3的基因型为_a4.2/awsa基因型地贫。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。实施例4:重复实施例1的方法，不同的是，用样本4代替样本1，结果如图8所示。图8 中，Y1=Y2，DBT 有峰，CSN、QSN、WSN 有峰，HPFH-W 有峰，其余无峰。结合现有 检测结果图1 4，可以独立判断出样本4的基因型为DBT基因型地贫；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本4的基因型为α α/α α+DBT基因型地贫。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。实施例5:重复实施例1的方法，不同的是，用样本5代替样本1，结果如图9所示。图9 中，Y1=Y2，SEA 有峰，CSN、QSN、WSN 有峰，HPFH-M 和 HPFH-W 有峰，其余无峰。结合现有检测结果图1 4，可以独立判断出样本5的基因型为一SEA/α a +HPFH-SEA基因型地贫；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本5的基因型为一SEA/ci a+HPFH-SEA基因型地贫。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。实施例6重复实施例1的方法，不同的是，用样本6代替样本1，结果如图10所示。图10 中，Y1=Y2，CSN、QSN、WSN 有峰，HPFH-W 有峰，其余无峰。结合现有检测结果图1 4，可以独立判断出样本6的正常个体的阴性样本；而独立地通过本发明体系做出的结果图也可以直接判断出样本6为正常个体的阴性样本。两者互相验证，证明了本发明的简便性和结果的一致性。
权利要求
1.一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于包括以下步骤: (一)引物设计 (1)设计一条通用引物，该引物与人类基因组没有同源性，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物； (2)针对检测位点，设计一系列基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对或可用于基因片段定量的扩增引物对，包括正向引物和反向引物； (3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增引物对、位点特异性PCR扩增引物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组； (二)PCR检测 取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动DNA聚合酶体系组成25 μ I或50μ I的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为:待检测DNAl 3ng/y 1，各加尾引物的浓度均为0.3 0.5 μ mol/L，通用荧光标记引物0.7 0.9 μ mo I/L ；PCR反应条件为:预变性95°C 11分钟，循环程序为95 °C 30秒，59 62 °C 30秒，72 °C 30秒，共25 35个循环，最后72 °C 20分钟延伸； (三)结果检测 取PCR产物0.3 0.75 μ 1，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。
2.根据权利要求1所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于:该方法可实现单管多重PCR技术对α地中海贫血的--^型，-(13_7，-(14_2，-- 1，a cs α , a QS α和α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型的检测。
3.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于:步骤(二)中PCR反应条件为:95°C 11分钟预变性，循环程序为95°C 30秒，59°C 30秒，72°C 30秒，28 35个循环，最后72 °C 20分钟延伸。
4.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于:步骤(一)中，用6-FAM荧光、VIC荧光、NED荧光或PET荧光对通用引物进行标记。
5.根据权利要求1或2所述的基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (一)引物设计 (1)设计一条与人类DNA序列同源性较少的DNA片段作为通用引物，对该通用引物进行荧光标记即得通用荧光标记引物； 所述通用引物长度为20bp，序列为:5’ -CTCGACACGCATCTGCTCAG-3’，用荧光标记于5’端; (2)针对α地中海贫血的」ΕΑ型，-α3.7，- α 4.2，— ΑΙ, a cs α , α QS α和α ws α，以及β地中海贫血的HPFH-SEA和DBT地中海贫血基因型序列，设计扩增引物对，引物序列和配对如下:. 2.1)针对a ws α、a es α和a QS α的位点特异性扩增引物: WS-N-F:5> -AGTTCACCTCTGCGGTGCAC-3’ ；WS-M-F:5’ -GAGTTCACCCCTGCGGTTCAG-3’ ；CS-N-F:5’ -CGTGCTGACCTCCAAATACTGTT-3’ ；CS-M-F:5’ -CGTGCTGACCTCCAAATACAGTC-3’ ；QS-N-F:5’ -CTGCGGTGCAAGCCTCCCT-3’ ；QS-M-F:5’ -CTGCGGTGCACGGCTCACC-3’ ； 以上引物分别为扩增awsa、,α和aQSa的正向引物，引物名称中，N=扩增正常基因的引物，M=扩增突变基因的引物； 上述引物的反向引物均为:CQW-co-R:5’ -ACCTCCATTGTTGGCACATTCC-3’ ； .2.2)针对一SEA型检测的位点特异性扩增引物:SEA-a -F:5’ -AGAAGCTGAGTGATGGGTCCG-3’ ；SEA-a-R:5’ -TGGACTTAAGTGATCCTCCTGCCC-3’ ； .2.3)针对一 1检测的位点特异性扩增引物:THAIF-F:5’ -ATTCACATACCATACGGTTCAC-3’ ；THAIF-R:5’ -AATTCCCCTGGACTTGAGTG-3’ ； .2.4)针对HPFH-SEA检测的跨越断点式扩增引物:HPFH-F:5，-CCAGCCTCATGGTAGCAGAATC-3，；HPFH-M-R:5’ -TGGTATCTGCAGCAGTTGCC-3’ ；HPFH-W-R:5，-GCAAGAAACGAAGAAACTTCAAGCA-3，； 其中，HPFH-F为公用的正向引物，HPFH-M-R为检测HPFH-SEA突变型的反向引物，HPFH-W-R为检测HPFH-SEA非突变型的反向引物； .2.5)针对DBT检测的跨越断点式扩增引物为:DBT-M-F:5’ -GCAGGTAGTTGTTCCCCTTCA-3’ ；DBT-R:5’ -GCTGGACACATATAAAATGCTGC-3’ ； 由于DBT的缺失片段包含了 HPFH-SEA缺失片段，所以ΗΡ - RW可用于做DBT的非突变型对照； .2.6)针对-a 3 7和-a 4 2的可用于基因片段定量的扩增引物:Y1-Y2-F:5，-CAGGGATGCACCCACTGGCA-3，；Yl-Y2-R:5， -GGGTGAGGAAGGAAGGGGTG-3，； (3)对上述设计的基于跨越断点式PCR扩增弓I物对、位点特异性PCR扩增弓I物对和可用于基因片段定量的扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，组成新的加尾引物组； (二)PCR检测 取待检测DNA、各加尾引物组、通用荧光标记引物，与热启动聚合酶体系组成25μ1或.50 μ I的反应体系，其中各成分在体系中的浓度为:待检测DNAl 3ng/y 1，各加尾引物浓度均为0.3 0.5 μ mol/L,通用荧光标记引物0.7 0.9 μ mol/L ；PCR反应条件为:预变性.95°C 11分钟，循环程序为95°C 30秒，59 62°C 30秒，72°C 30秒，共25 35个循环，最后.72 0C 20分钟延伸； (三)结果检测取 PCR产物O. 3 O. 75 μ 1，混合测序系统的HiDi，以及分子量标记，进行结果检测。
全文摘要
本发明公开了一种基于荧光标记定量PCR技术的地中海贫血基因检测方法，主要包括以下步骤先设计一条通用荧光标记引物，再针对检测位点设计扩增引用，在设计扩增引物时，将扩增引物对的其中一条引物进行加尾，加尾序列与通用荧光标记引物序列一致，在进行PCR反应时，将加尾的引物组与通用荧光标记引物进行混合，从而实现对扩增产物的荧光标记。PCR反应结束后，将PCR产物放入测序仪，利用测序仪的Genemapper功能，通过结果中已知分子量的一系列内参来确认不同PCR产物的长度，从而对检测样本的基因型进行判断。采用本发明所述方法可实现单管对α地中海贫血的不同基因型的检测。
文档编号C12Q1/68GK103255225SQ20131020138
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者龙驹, 叶学和, 翁勋锦, 庞婉容 申请人:钦州市妇幼保健院