哈维氏弧菌巨噬菌体vp4b及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体是巨噬菌体及其应用。本发明提供了一种罕见的巨噬菌体VP4B，本发明利用双层平板分离纯化、基因组提取和核酸序列测定等技术对从环境中得到巨噬菌体VP4B，对其进行了基因组核酸序列的测定和分析，得到了236，053bp核苷酸序列。巨噬菌体VP4B对致病性哈维氏弧菌有明显抑制其生长的作用，可用于海产养殖中弧菌病害的生物防治。
【专利说明】哈维氏弧菌巨噬菌体VP4B及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体是巨噬菌体及其应用。
【背景技术】:
[0002]细菌性感染是感染疾病中最常见的类型，过去几十年里抗生素被认为是治疗细菌感染的最好方法。但是随着近年来抗生素滥用现象日益严重，细菌的耐药性问题日益加剧，人们把选择其他抗菌剂的目光转移到噬菌体上。相较传统的抗生素，噬菌体的优势在于对宿主菌有高度专一性，能够持续自我繁殖，对抗药菌株具有再侵染能力，对环境没有污染，无刺激。
[0003]随着生物技术的发展，噬菌体的地位越来越重要。对噬菌体的基因进行研究，不仅为噬菌体的多样性和进化途径提供了资源，也为噬菌体的生物学特性和其与宿主之间的相互作用提供了证据，同时也为噬菌体治疗的安全性和可控性提供了保障。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的在于提供一种巨噬菌体VP4B及其应用。
[0005]为了实现本发明的目的，发明人利用双层平板分离纯化、基因组提取和核酸序列测定等技术对从环境中得到噬菌体VP4B，对其进行基因组核酸序列的测定和分析，发现其基因组序列全长246，964bp，GC含量为43.29%，含有210个预测的0RF。发明人于2013年5月9日将该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:湖北武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号CCT CC NO:M2013192，其分类命名为哈维氏弧菌噬菌体VP4B (Vibrioharveyi Phage VP4B)。
[0006]本发明的巨噬菌体VP4B可用于噬菌体功能基因组学、新型病毒载体构建、进行弧菌病害的预防和快速诊断，以及噬菌体吸附、侵染、裂解弧菌机制的研究。
[0007]根据后面的实施例，本发明中的巨噬菌体VP4B是裂解性噬菌体，能够侵染哈维氏弧菌，在弧菌体内复制增殖之后，能够裂解哈维氏弧菌的细胞壁，致使弧菌裂解死亡。可以有效的控制哈维氏弧菌的数量及增殖速度，可以用于水产养殖中哈维氏弧菌病害的防治。在【具体实施方式】中，本发明的巨噬菌体VP4B能够明显的抑制哈维氏弧菌生长速度和浓度。
[0008]本发明可以根据巨噬菌体的抑菌曲线来对于水产养殖中的弧菌，特别是哈维氏弧菌，进行病害防治以及病害防治酶材料的开发应用。
[0009]本发明还提供了包含本发明的巨噬菌体的细菌。优选地，所述细菌是哈维氏弧菌。
[0010]本发明还提供了一种产生巨噬菌体的方法，所述方法包括在细菌中培养本发明的巨噬菌体的步骤。在一个实施方案中，所述细菌是哈维氏弧菌，例如德国微生物菌种保藏中心以保藏号:DSM-6904保藏的细菌。
【专利附图】
【附图说明】:
[0011]图1为哈维氏巨噬菌体VP4B抑制哈维氏弧菌生长OD曲线图。【具体实施方式】:
[0012]1.噬菌体的收集和浓缩
[0013](I) 向 200mL液体2216E培养基(lg酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高铁，lL陈海水)的三角瓶中添加0.1mL哈维氏弧菌(购自DSMZ，保藏号:DSM_6904)溶液，并向所述三角瓶中添加0.1mL本发明的哈维氏巨噬菌体VP4B(保藏号:CCTCC NO:M2013192)溶液，置于37°C培养箱，摇瓶培养18小时。向培养后的液体中加入酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF使其终浓度为ImM，以15000 Xg进行20min的离心。
[0014](2)取上清加入NaCl，使其终浓度为IM ;加入聚乙二醇PEG6000 (Sigma,25322-68-3)，使其终浓度为10%，在4°C下放置l_3h。[0015](3)以 15000Xg 在 4°C下离心 lh。
[0016](4)去上清，用 2mL 的 SM 缓冲液(Amrecso, J614-500ML)重悬，以 3000Xg 进行15min离心，去沉淀。
[0017](5)将离心上清液在氯化铯溶液(1.5g/mL)中，以220000Xg在4°C下离心24h。
[0018](6)用一次性针筒收集噬菌体。
[0019]2.嗤囷体基因组的提取
[0020](I)在上述步骤I中制备的ImL噬菌体颗粒悬浮液中加入DNase/RNase混合物(Takara, 2210CA/R0675)(终浓度为2mL/L)，混合均匀，在37°C的水浴中孵浴45min。
[0021](2)加入 150 μ L TE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8.0)和 30 μ LlO %(w/v) SDS溶液，上下颠倒，在70°C的水浴中孵育lOmin。
[0022](3)加入125 μ L乙酸-乙酸钾缓冲液(ρΗ4.3)，在冰水浴中孵育30min_lh。
[0023](4)以 14，OOOXg 在 4°C下离心 15min。
[0024](5)在离心上清液中，添加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)，剧烈混合5min,以14，OOOXg在4°C下离心5min。重复此步骤直到无白色蛋白杂质。
[0025](6)将离心上清液分为两管，用等体积异丙醇在_20°C下静止lh。
[0026](7)以 14，OOOXg 在 4°C下离心 20min。
[0027](8)弃去离心上清液，用80%乙醇洗涤沉淀。
[0028](9)置于超净台中风干。
[0029]3.对步骤2提取的噬菌体基因组DNA进行核苷酸序列的测定、拼接和分析:
[0030]由深圳华大基因研发中心完成测序。采用Glimmer软件从组装结果中获得基因序列的ORF，并BLAST进行功能分析。序列分析表明，其基因组序列全长246，964bp，GC含量为43.29%，含有210个预测的ORF。其中34046位至34561位核苷酸序列编码噬菌体的二氢叶酸还原酶，第35408位至36316位核苷酸序列编码噬菌体的胸腺甘酸合成酶，其第86182位至第86889位核苷酸序列编码噬菌体的调节蛋白，第112547位至114532位核苷酸序列编码噬菌体的RNA聚合酶，第201168位至第203135位核苷酸序列编码噬菌体的DNA连接酶，第207525位至第208049位核苷酸序列编码噬菌体的核糖核酸酶。
[0031]还与已知的哈维氏弧菌噬菌体(GenBank:AY283928)进行序列比对。结果表明，VP4B与其能形成很好的比对，同时也有基因移位的现象，证明这是一种全新的哈维氏弧菌噬菌体。[0032]4.噬菌体抑制哈维氏弧菌增殖的OD曲线图
[0033](1) 向两个各装有 500mL液体2216E培养基(lg酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高铁，IL陈海水)的三角瓶A、B中添加0.1mL哈维氏弧菌(购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号:DSM-6904)溶液，向A瓶中添加0.1mL步骤I中制备的巨噬菌体VP4B溶液，置于37°C培养箱,摇瓶培养。
[0034](2)每隔一小时取A、B瓶中培养液lmL，以8000 X g在4°C下离心5min，用干净的2216E培养基洗涤沉淀3次，用干净的2216E培养基重悬浮。用分光光度计测定0D600的吸光度。
[0035](3)每组做三个平行样品，求得标准偏差。
[0036]如图1中所示的结果表明，本发明的巨噬菌体VP4B能够明显的抑制哈维氏弧菌生长速度和浓度。
【权利要求】
1.一种巨噬菌体，其以保藏号M2013192保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.权利要求1的巨噬菌体用于抑制哈维氏弧菌的用途。
3.权利要求1的巨噬菌体用于的水产养殖中弧菌病害的防治的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述弧菌是哈维氏弧菌。
5.包含权利要求1的巨噬菌体的细菌。
6.权利要求5的细菌，所述细菌是哈维氏弧菌。
7.—种产生巨噬菌体的方法，所述方法包括在细菌中培养权利要求1的巨噬菌体的步骤。
8.权利要求7的方法，所述细菌是哈维氏弧菌。
9.权利要求8的方法，其中所述哈维氏弧菌是德国微生物菌种保藏中心以保藏号:DSM-6904保藏的细菌。`
【文档编号】C12N7/00GK103555671SQ201310263942
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】骆祝华, 叶德赞, 于艳萍 申请人:国家海洋局第三海洋研究所