一种新的转基因米曲霉检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明名为“一种新的转基因米曲霉检测试剂盒及其检测方法”，涉及转基因微生物检测【技术领域】，本发明通过设计针对转基因米曲霉特异序列的带标记的引物和探针，结合应用PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因米曲霉的准确、高效快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高转基因米曲霉检测的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。本检测试剂盒使用方便快捷，原理和操作简单，可应用于快速检测转基因米曲霉。
【专利说明】一种新的转基因米曲霉检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因微生物检测【技术领域】，提供了一种利用PCR扩增和核酸试纸条技术相结合的快速检测转基因米曲霉的试剂盒，适用于转基因米曲霉的快速检测。
【背景技术】
[0002]米曲霉(Aspergillus oryzae),属于半知菌亚门，丝孢纲,丝孢目，丛梗孢科，曲霉属，是真菌中的一个常见种。分布广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等，是一种非常重要的工业用菌种。
[0003]目前酶制剂产品中的转基因微生物检测的技术还是主要依靠传统分离培养的形态学检测方法，检测灵敏度低，通常需要几天时间。近些年来，随着分子生物学和生物技术的快速发展，PCR技术成了快速检测的常用手段。但是扩增产物需要凝胶电泳，紫外凝胶成像，步骤多，耗时长，而且存在EB染色剂污染的问题。
[0004]本研究通过巧妙地设计针对转基因米曲霉的带标记的特异性引物和探针，应用 PCR扩增和核酸试纸条检测技术，实现了转基因米曲霉的高效快速检测。该方法特异性强， 灵敏度高、稳定性好，可以广泛应用于转基因米曲霉的准确快速检测。
【发明内容】
[0005]本发明需要解决的技术问题是提供用于检测转基因米曲霉的两套特异性引物和探针。[0006]本发明需要解决的另一问题是提供包含上述引物的核酸试纸条检测试剂盒。[0007]本发明用于检测转基因米曲霉的两套PCR引物及探针序列为:[0008]上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’[0009]下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’[0010]探针 1:PyrG-P-fitc:5`’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’[0011]上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3’[0012]下游引物 2:Np1-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’[0013]探针 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’[0014]本发明的转基因米曲霉检测试剂盒，包括以下成分:[0015](I)转基因米曲霉DNA模板和阴性对照野生型米曲霉模板[0016](2)转基因米曲霉带标记的上、下游引物和探针[0017]上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?[0018]下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’[0019]探针 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?[0020]上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin-GTAACCCAAGAGAATGCC-3?[0021]下游引物 2:Np1-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’[0022]探针2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3J
[0023](3) IOXTaq PCR Buffer, DDH2O, 2.5mM dNTP，5U / μ I Taq 酶
[0024]分别用上述方法对待测样品DNA进行PCR扩增，PCR产物用试纸条检测，两套引物探针的检测结果显示控制线正常，检测线呈现阳性，则说明该样品含有转基因米曲霉，若至少有一套引物、探针检测结果呈现阴性，则说明该样品中不含有转基因米曲霉。
[0025]与现有技术相比，本发明的进步在于:无需琼脂糖凝胶电泳、紫外凝胶成像，从而避免了溴化乙锭的污染，而且检测结果直观、可视，从PCR扩增到观察结果只需IOOmin左右，大大优于凝胶电泳成像。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1、图2转基因米曲霉试剂盒特异性测试结果，其中图1为PyrG特异性检测、图2为Npl特异性检测，I为阴性对照，2、3、4、5、6、7为野生型米曲霉，8为转基因米曲霉，从图1、图2可以看出，只有转基因米曲霉出现特异条带，使用本试剂盒能准确地检测出转基因米曲霉。
【具体实施方式】
[0027]第一套PyrG特异引物、探针设计:
[0028]`
【权利要求】
1.两套用于转基因米曲霉检测的特异性引物和探针，其特征在于，序列为:
上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3’
下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’
探针 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3’
上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3’
下游引物 2:Npl-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’
探针 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’。
2.一种用于检测转基因米曲霉的试剂盒其特征在于，包括如下成分: (1)阳性对照转基因米曲霉DNA模板和阴性对照野生型米曲霉DNA模板 (2)转基因米曲霉PyrG、Npl上下游特异引物和探针
上游引物 1:PyrG-F-bio:5’ biotin-AGCGCACGCGCTAGCCGT-3?
下游引物 I =PyrG-R:5’ -GTGGGTCCTGCTACCTTTCC-3’
探针 1:PyrG-P-fitc:5’ fitc-CTTGGAACGCATGAGTCTA-3?
上游引物 2:Npl-F-bio:5’ biotin—GTAACCCAAGAGAATGCC_3’
下游引物 2:Npl-R:5’ -AGTACCAGAGAAGCTCCA-3’
探针 2:Npl-P-fitc:5’ fitc-AGACTCCTGCAATATCCGA-3’
(3)IOXExTaq PCR Buffer, ddH20，2.5mM dNTP,5U/y IExTaq 酶 (4)生物素(biotin)、荧光素(fitc)抗原标记的薄膜层析试纸条。
3.—种转基因米曲霉的快速检测方法，包括如下步骤: (1)PCR反应体系:
【文档编号】C12N15/11GK103497992SQ201310263785
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】张裕君, 赵卫东, 刘国红, 贺艳, 郑文杰 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心