一种生物转化制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法
【专利摘要】本发明公开一种生物转化多唾液酸四己糖神经节苷脂为单唾液酸四己糖神经节脂（GM1）的方法。用细菌简单、高效水解多唾液酸四己糖神经节苷脂混合物，制备GM1。所用菌种为纤维属，名为Cellulosimicrobium sp.21，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7587。本发明具有选择性好、活性高，工艺简单，生产路线短，产品纯度高等优点，为GM1大规模生产提供了可能。CGMCC No.75872013.05.14
【专利说明】 一种生物转化制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物转化法制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，属于生物制药领域。
【背景技术】
[0002]神经节苷脂是神经鞘糖脂中的一种，由一分子长链的神经鞘氨醇、一分子长链的脂肪酸及一条含有唾液酸的寡糖链组成，主要存在于大脑和神经组织。神经节苷脂具有多种生物活性，在神经发生、生长、分化过程中起到重要作用，对于损伤后的神经修复也有重要作用，促进神经的再生、促进神经轴突生长和突触形成、恢复神经支配功能、改善神经传导、促进脑电活动及其他神经电生理指标的恢复；保护细胞膜、初级细胞膜各种酶恢复等作用。近年来单唾液酸四己糖神经节苷脂已作为临床药物用于神经性失调症的治疗，如阿兹海默症，帕金森症，脊髓损伤和中风等。目前的研究表明单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMl)可以直接通过血脑屏障作用于神经细胞，其作用机制主要是保护细胞膜的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP活性，改善细胞内外离子失衡，同时能降低活性氧自由基，防止神经细胞的损伤与死亡，促进神经细胞的再生。然而GMl含量为脑组织的万分之一，传统的提取方法为通过有机试剂的萃取从动物脑组织中进行提取和分离，方法繁复，收率低。而目前已公布的生物转化法制备GMl (专利号2004100182805)，其方法中要求在转化之前除去原有神经节苷脂中的GM1，虽然提高了总的产量但是仍需要多次分离，增加工作量，同时也增加了产物污染的风险。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种利用细菌将动物脑组织中的混合神经节苷脂转化为GMl的方法。
[0004]本发明的技术解决方案是:利用细菌简单、高效将多唾液酸神经节苷脂转化为GMl。
[0005]本发明涉及的细菌名为Cellulosimicrobium sp.21,于2013年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7587。
[0006]菌株形态特征:该菌株革兰氏阳性，长杆状，培养后期逐渐变为短杆状。菌体的大小为0.4?0.6微米X 1.6?3.0微米。菌体细胞呈排列整齐的中等长度杆状，栅栏排列，尾部为钝端。
[0007]菌株菌落特征:菌落为圆形，在固体培养基表面，菌体形成半透明的乳白色菌落，菌落圆滑。
[0008]本发明按照如下步骤:
[0009]a)发酵菌种的制备:取冻存管中保存的的细菌菌种，接种菌株于LB培养基中，37 °C摇瓶培养I天。
[0010]b)生物转化:按照体积分数1%_5%将菌株加入到转化培养基中，15-40°c恒温培养3-7 天。
[0011]c)回收GMl:离心除去菌体，干燥，提取缓冲液溶解，进行柱层析分离制备GMl纯品。其中，转化培养基为含有体积分数5%-30%的动物脑组织提取的神经节苷脂混合物，无机盐，调节PH值5-9。提取缓冲液溶解由乙酸乙酯，乙醇，氯化钙，水组成。
[0012]通过本发明，转化后GMl的比例占到总神经节苷脂的80%以上，并且步骤简单高效，可快速大量制备GMl。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1，HPLC结果图。其中，I为生物转化后的神经节苷脂混合物；2为生物转化前的神经节苷脂混合物；3为标准样品。
【具体实施方式】
[0014]实施例1发酵菌种的制备
[0015]取冻存管中保存的的细菌菌种，接种菌种于LB培养基中，37°C摇瓶培养I天，待菌种培养到一定浓度，接种于转化培养基中。
[0016]实施例2
[0017]取神经节苷脂混合物，加入到IL转化培养基(无机盐，pH7.0)中，使其浓度为10%，加入实施例1制得的发酵菌种50ml，于37°C摇瓶培养，3天后取出，采用文献Journal ofPharmaceutical and B1medical Analysis.Vol.8, 1063-1066，1990 年公开的高效液相色谱法检验，转化后GMl占总神经节苷脂的比例达到70%。
[0018]实施例3
[0019]取神经节苷脂混合物，加入到IL转化培养基(无机盐，pH7.0)中，使其浓度为20%，加入实施例1制得的发酵菌种50ml，于37°C摇瓶培养，3天后取出，采用文献Journal ofPharmaceutical and B1medical Analysis.Vol.8, 1063-1066，1990 年公开的高效液相色谱法检验，转化后GMl占总神经节苷脂的比例达到80%。
[0020]实施例4
[0021]取神经节苷脂混合物，加入到IL转化培养基(无机盐，pH7.0)中，使其浓度为10%，加入实施例1制得的发酵菌种30ml，于37°C摇瓶培养，3天后取出，采用文献Journal ofPharmaceutical and B1medical Analysis.Vol.8，1063-1066，1990 年公开的高效液相色谱法检验，转化后GMl占总神经节苷脂的比例达到60%。
【权利要求】
1.一种利用细菌将动物脑组织中的混合神经节苷脂转化为单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于使用纤维属细菌Cellulosimicrobium sp.21，编号CGMCC N0.7587菌株进行生物转化，其步骤如下: a)制备发酵菌种:取冻存管中保存的的细菌菌种，接种菌株于LB培养基中，37°C摇瓶培养I天； b)生物转化:按照体积分数1%_5%将菌株加入到转化培养基中，15-40°C恒温培养3-7天; c)回收:离心除去菌体，干燥；提取缓冲液溶解，柱层析分离制备单唾液酸四己糖神经节苷脂纯品。
2.根据权利要求1所述的生物转化制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于步骤b)中，转化培养基为含有体积分数5%-30%的动物脑组织提取的神经节苷脂混合物，无机盐。
3.根据权利要求1所述的生物转化制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于步骤c)中，提取缓冲液溶解由乙酸乙酯，乙醇，氯化钙组成。
【文档编号】C12P19/44GK104342469SQ201310332516
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月1日 优先权日:2013年8月1日
【发明者】周义发, 及莉, 冷佳益, 孙成新, 台桂花 申请人:东北师范大学