一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法
【专利摘要】本发明属于微生物发酵【技术领域】，公开了一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法。该培养基配方为：胰蛋白胨19～21g/L，酵母浸膏9～11g/L，磷酸缓冲液终浓度100mmol/L，无氨基氮源12.8～14.8g/L，生物素4×10-4g/L，甘氨酸0.05～0.15wt%和体积浓度为0.5％的甲醇，pH为6～8。本发明还公开了一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，利用本发酵方法发酵毕赤酵母重组菌，可获得高达130mg/L以上的重组蛋白表达量。
【专利说明】一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵【技术领域】，特别涉及一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基及高密度发酵方法。
【背景技术】
[0002]酵母是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物易培养、繁殖快、便于遗传操作等生长特性，又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。作为真核表达系统，毕赤酵母表达外源基因具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点:分子遗传水平的操作简单，易于构建高稳定性的工程菌，一般不会出现外源基因随生长繁殖而丢失现象；具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOXl)或磷酸甘油酸脱氢酶(GAP)基因启动子作为外源基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；能在胞内表达或分泌型高水平表达重组蛋白；蛋白质翻译后修饰更接近高等真核生物，如蛋白糖基化、二硫键形成等，重组蛋白容易正确折叠；重组蛋白能大批量发酵生产，影响重组蛋白产量及品质的因素易于控制。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。
[0003]毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx发酵生成的重组蛋白可将残留在农产品和饲料中的玉米赤霉烯酮毒素降解，从而提高农产品和饲料的品质，消除玉米赤霉烯酮毒素对养殖业及饲料工业的危害。因此，这种具有脱毒功能重组蛋白的生产将具有很好的应用前景。
[0004]在研究毕赤酵母对外源蛋白的表达时，国内外的学者发现毕赤酵母液泡中含有多种蛋白酶(李忠琴，许小平，杨海麟，王武.辣根过氧化物酶分光光度法测定黄嘌呤氧化酶的活性[J] ?分析化学，2006，(6): 821-825.)，并认为蛋白酶是影响外源蛋白表达的重要因素之一。同时发现，这些蛋白酶的酶活水平随着诱导环境中的营养物质的差异而有所不同，特别是氮源的缺乏会造成发酵液蛋白酶活力的增强(马晟利，孙德刚，吴双燕.健康青少年口腔优势菌产生过氧化氢的初步研究[J].中国微生态学杂志，2010，22(11):1008-1011.)，培养基中补加一些酪蛋白水解物、胃蛋白水解物或者直接添加各类氨基酸都是控制蛋白酶活性的有效措施(Xianqin Yang, Kesen Ma.Determination of hydrogen peroxide generated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide oxidase [J].Analytical Biochemistry, 2005, 344:130-134.);另外一些学者在研究中发现，采用控制PH值的方法可以有效的控制发酵液中蛋白酶的活力，使外源蛋白的表达量达到最大。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，利用该培养基能更有效发酵毕赤酵母重组菌以获得高蛋白产量。[0006]本发明另一目的在于提供一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，该方法利用上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，并控制发酵条件，从而获得闻蛋白量。
[0007]本发明再一目的在于提供上述高密度发酵方法在发酵毕赤酵母重组菌中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其配方为:胰蛋白胨19?21g/L，酵母浸膏9?llg/L，磷酸缓冲液终浓度lOOmmol/L，无氨基氮源(YNB) 12.8?14.8g/L，生物素 4X l(T4g/L，甘氨酸0.05?0.15wt%和体积浓度为0.5%的甲醇，pH为6?8。
[0010]所述的毕赤酵母重组菌指以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主、以获取蛋白表达为目的的基因重组菌。
[0011]优选地，所述的毕赤酵母重组菌指毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K_A4_Prx或毕赤酵母重组菌 GS115/pPIC9K-pr印roHD5。
[0012]所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基为液体培养基。
[0013]一种基于上述毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法，具体包含以下步骤:
[0014](I)种液的制备:将毕赤酵母重组菌甘油菌种于麦芽汁培养基两次平板活化后，取菌种接入BMGY液体培养基中，28?30°C，200?250r/min摇瓶培养12?18h，得到种液。
[0015](2)高密度发酵:将步骤(I)制得的种液离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤后， 接入毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，28?3(TC，200?250r/min摇瓶培养发酵；每隔24h补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养64?72h，终止发酵。
[0016]步骤(2)所述的离心收集菌体指在离心速率为4000?5000r/min下离心5? IOmin0
[0017]步骤(I)的BMGY液体培养基由以下方法制备得到:胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏 10g/L, 121°C,灭菌20min后,加入100mmol/L pH6的磷酸钾,无氨基氮源(YNB) 13.4g/L,生物素 4X10_4g/L，甘油 10g/L。
[0018]步骤(I)中，菌种液体培养是本领域技术人员的常用操作，其中用到的麦芽汁培养基平板和BMGY培养基均采用标准配方配制。
[0019]步骤(I)中，所述的毕赤酵母重组菌甘油菌种指常规甘油-80°C保存的毕赤酵母重组菌种。为了取得很好的种子活化效果，对其进行两次平板活化，两次平板活化后再进行 BMGY培养基中摇瓶培养12?18h，从而得到所需种液；因为经过了两次平板活化，所以能够确保甘油的完全去除，菌种完全恢复，有利于后期实验。
[0020]步骤(I)中限定了种液摇瓶培养时间为12?18h，这是因为此时重组菌已达到对数生长中期，生长力旺盛、菌体数量多，区别于常规的培养时间24h，该培养方法与发酵方法结合可最佳表达重组蛋白。
[0021]本发明的机理为:
[0022]本发明高密度发酵培养基中，甘氨酸最佳添加量为0.05?0.15wt%,区别于本【技术领域】的人员常用毕赤酵母诱导培养基BMMY，该发酵方法根据重组蛋白的氨基酸序列，选择性的加入含量较高的几种氨基酸，并根据毕赤酵母重组菌的重组蛋白合成率最终确定了甘氨酸的添加量为0.05?0.15wt%，从而实现毕赤酵母重组菌的高效率培养及表达。培养基中甘氨酸的添加会降低发酵液中蛋白酶的活性，减少了目的蛋白的降解，从而提高了重组蛋白的表达量。同时，氨基酸的添加补充了表达后期培养基中的氮源，使得细胞机体有足够的氮源维持细胞的正常生理活动和细胞活力，减少了因细胞活力降低而增加的蛋白酶的分泌量，从而降低了蛋白酶对重组蛋白的水解作用。
[0023]本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果:
[0024](I)本发明对发酵培养基配方及其发酵条件进行了研究改进，培养基中甘氨酸的添加有利于毕赤酵母重组菌的产物合成；
[0025](2)本发明的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养方法，pH控制在6?8，温度为28? 30°C，从而保证了高产率合成重组蛋白的实现；
[0026](3)本发明的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养方法，重组蛋白的表达量保持在 60.0mg/L以上，在较优条件下可达130mg/L以上，明显优于现有发酵工艺，说明该发酵方法可有效获得高产量的重组蛋白，将为消除玉米赤霉烯酮毒素对养殖业及饲料工业的危害起重要作用，并带来良好的经济效益和环境效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为实施例1中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基PH为6，培养条件为28°C、200r/min发酵培养64h。
[0028]图2为实施例2中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基PH为7，培养条件为29°C、230r/min发酵培养68h。
[0029]图3为实施例3中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基PH为7，培养条件为30°C、230r/min发酵培养72h。
[0030]图4为实施例4中毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基PH为8，培养条件为30°C、250r/min发酵培养72h。
[0031]图5为实施例5中 毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-pr印roHD5在高密度发酵培养基合成重组蛋白含量图。其中，培养基PH为7，培养条件为30°C、230r/min发酵培养72h。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0033]实施例1:毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx的高密度发酵
[0034](I)毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4_Prx的制备:
[0035](一)目的基因A4_Prx的扩增；
[0036](I)质粒pPIC9K-A4_Prx的构建及其验证
[0037]①目的序列设计与合成:按Genbank上不动杆菌Acinetobacter sp.SMO4的 JF964958.1序列，依照表达载体pPIC9K的多克隆位点，选择Avr II和NotI酶切位点，设计引物(PI，P2)用于从Acinetobacter sp.SM04的总DNA中扩增目的序列。具体序列如下:
[0038]JF964958.1 序列:
[0039]ATGAGCTTGATTAATACTGAAGTTAAACCATTCCAAGCAACTGCTTACCACAACGGCCAATTTGTTGAA GTTAACGAAACTAACCTTAAAGGTAAATGGTCTGTTGTATTCTTCTATCCAGCTGACTTCACTTTCGTTTGCCCAACTGAACTTGGTGACTTAGCTGACAACTACGCTGAATTCCAAAAACTTGGTGTTGAAATTTATGCTGTATCTACTGATA
CACACTTCACTCACAAAGCTTGGCACGACACTTCTGAAGAAATCAAAAAAATCCAATATCCATTAGTTGGTGACCCA
ACTTGGACTCTTTCTAAAAACTTCGACGTTCTTATCGAATCTGAAGGTTTAGCTGACCGTGGTACTTTCGTTATCGA
TCCAGAAGGTAAAATCCAAATCGTTGAACTCAACGCTGGTGGTATCGGCCGTGACGCATCTGAACTTCTTCGTAAAG
TAAAAGCTGCTCAATACGTACACGCTCACCCAGGTGAAGTTTGTCCAGCTAAATGGAAAGAAGGCGAAGCTACTCTT
GCTCCATCTATCGACTTAGTTGGTAAAATCTAA
[0040]上游引物 P1: 5，-TTACCTAGGATGAGCTTGATTAATACTG-3 ’
[0041 ]下游引物 P2:5 ’ -TATATTGCGGCCGCTTAGATTTTACCA-3 ’
[0042]引物的终浓度为20 u mol/L, _20°C储存备用。
[0043]PCR反应体系原料配比如下:
[0044]
【权利要求】
1.一种毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于配方为:胰蛋白胨19?21g/L， 酵母浸膏9?llg/L,磷酸缓冲液终浓度100mmol/L,无氨基氮源12.8?14.8g/L,生物素 4X 10 4g/L,甘氨酸0.05?0.15wt%和体积浓度为0.5%的甲醇，pH为6?8。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于:所述的毕赤酵母重组菌指以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115作为表达宿主、以获取蛋白表达为目的的基因重组菌。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于:所述的毕赤酵母重组菌指毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-A4-Prx或毕赤酵母重组菌GS115/ pPIC9K-preproHD5。
4.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基，其特征在于:所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基为液体培养基。
5.一种基于权利要求1所述的毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法， 其特征在于具体包含以下步骤:(1)种液的制备:将毕赤酵母重组菌甘油菌种于麦芽汁培养基两次平板活化后，取菌种接入BMGY液体培养基中，28?30°C，200?250r/min摇瓶培养12?18h，得到种液；(2)高密度发酵:将步骤(I)制得的种液离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤后，接入毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基中，28?30°C，200?250r/min摇瓶培养发酵；每隔24h 补加甲醇至终体积浓度为0.5%，发酵培养64?72h，终止发酵。
6.根据权利要求5所述的基于毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法， 其特征在于:步骤(I)所述的BMGY液体培养基由以下方法制备得到:胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L, 121°C,灭菌20min后，加入100mmol/L pH6的磷酸钾,无氨基氮源13.4g/L,生物素 4X10_4g/L，甘油 10g/L。
7.根据权利要求5所述的基于毕赤酵母重组菌高密度发酵培养基的高密度发酵方法， 其特征在于:步骤(2)所述的离心收集菌体指在离心速率为4 000?5000r/min下离心5? IOmin0
【文档编号】C12P21/00GK103436575SQ201310357119
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】唐语谦, 钟凤, 陈艺, 吴晖, 赖富饶, 肖俊梅, 余以刚, 肖性龙, 李晓凤, 刘冬梅 申请人:华南理工大学