一种在犬细胞中检测流感病毒rna聚合酶活性的报告基因质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。本发明的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。在双报告基因检测方法中采用本发明构建的报告基因质粒pGLucCa可以准确反应流感病毒在犬细胞中的RNA聚合酶活性，并且可以减少裂解细胞造成的误差，能够在不同时间点吸取细胞上清进行RNA聚合酶活性的测定，使得双报告基因检测RNA聚合酶活性的方法更简便、应用范围更广。
【专利说明】一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。
【背景技术】
[0002]犬流感是由犬流感病毒引起的犬的高度接触性传染病。患犬往往表现出咳嗽、肺炎等感冒症状。近年来，犬流感病毒感染的报道迅速增多，犬是人类重要的伴侣动物，犬的健康越来越受到人们的重视。此外，犬中的流感病毒可能通过人-犬的亲密接触而增加感染人的机会。因此，犬流感病毒不仅影响犬的健康，也对公共卫生安全构成了严重威胁。
[0003]流感病毒的聚合酶基因在其致病性、宿主适应性及跨种间传播等多个生物学特性方面有重要作用。有研究发现，较高的聚合酶活性是产生高致病性毒株的一个重要决定因子，病毒聚合酶活性增强，致病性伴随着增强；更有报道，某些聚合酶基因影响着病毒在人群中的传播能力。另外，聚合酶活性在一定程度上也能反映RNP各基因片段之间的兼容程度。有研究证明限制病毒重排的一个关键因素是RNP复合体的兼容性，而其RNP的兼容性正与其相应的聚合酶活性相关。所以，流感病毒的聚合酶基因对这些生物学特性的影响与聚合酶活性有很大的关系，聚合酶活性对病毒的产生和复制能力有重要影响。
[0004]传统的流感病毒聚合酶活性测定是采用双报告基因检测系统，报告基因分别是海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶，由于海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶不能分泌到细胞外，需要裂解细胞以测定荧光素酶的表达量，操作不方便；另外，以往用的报告基因质粒上多是人源启动子，无法准确的反应病毒聚合酶在犬细胞上的聚合酶活性。
【发明内容】
`[0005]本发明的目的是提供一种在犬细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。
[0006]本发明提供的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]上述质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0008]上述应用中，所述的病毒为流感病毒。
[0009]上述任一所述的应用中，所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感
[0010]上述任一所述的应用中，所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人HlNl流感病毒。
[0011]上述任一所述的应用中，所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在犬细胞中的RNA聚合酶活性。
[0012]上述任一所述的应用中,所述犬细胞为犬MDCK细胞。
[0013]一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包括上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、犬细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。
[0014]上述试剂盒中，所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1 (+)的多克隆位点得到的；
[0015]所述犬细胞为犬MDCK细胞。
[0016]上述任一所述的试剂盒中，所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。
[0017]一种检测待测病毒RNA聚合酶在犬细胞中RNA聚合酶活性的方法也属于本发明的保护范围，该方法是利用上述任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤:
[0018]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a ；
[0019]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸 酶活性的比值，记作b ；
[0020]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值,记作对照比值；
[0021 ] 若a显著大于对照比值，则判定所述待测病毒A的RNA聚合酶在犬细胞中具有RNA聚合酶活性；
[0022]若a和b显著大于对照比值，并且a显著大于b，则判定病毒A在犬细胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在犬细胞中的RNA聚合酶活性。
[0023]所述犬细胞为犬MDCK细胞。
[0024]所述待测病毒为流感病毒。
[0025]利用本发明构建的PGLucCa质粒作为报告基因质粒的双报告基因检测方法可以用于测定流感病毒在犬细胞上的RNA聚合酶活性。
[0026]本发明构建的双报告基因检测方法具有以下优点:
[0027]1、pGLucCa质粒选择犬源RNA聚合酶I型启动子作为报告基因的启动子，该犬源RNA聚合酶I型启动子可以应用在不同的犬源细胞上，具有该启动子的报告基因能准确反应流感病毒在犬细胞上的RNA聚合酶 活性。
[0028]2、该检测方法利用能够分泌到细胞外的分泌型Gaussia荧光素酶(GLuc)作为报告基因，选择同样能够分泌到细胞外的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为内参基因，质粒转染细胞后，收集培养液上清，测定Gaussia荧光素酶(GLuc)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性即可测定流感病毒的RNA聚合酶活性。此方法减少了裂解细胞的步骤以及减少了由此造成的误差，并且可以在不同时间点吸取细胞上清进行测定，使得检测方法更简便、应用范围更广。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为pGLucCa的结构示意图。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]猪H1N2 流感病毒 A/swine/Guangdong/1222/2006 (H1N2)在文献 “Zhao X，SunY，Pu J, Fan L, Shi W，Hu Y，Yang J, Xu Q, Wang J, Hou D, Ma G, Liu J.Characterization ofan artificial swine-origin influenza virus with the same gene combination asHlNl/2009virus:a genesis clue of pandemic strain.PLoS One.2011,6 (7): e22091.，，中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0033]禽H9N2 流感病毒 A/chicken/Hebei/LC/2008 (H9N2)在文献 “High geneticcompatibility and increased pathogenicity of reassortants derived from avian H9N2andpandemic HlNl/2009influenza viruses.PNAS March8, 2011, 108 (10):4164-4169.，，中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0034]人HlNl 流感病毒 `A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)在文献“Chou, Y.Y.，R.A.Albrecht, N.Pica, A.C.Lowen, J.A.Richt, A.Garcia-Sastre, P.Palese, and R.Ha1.The M segment ofthe2009new pandemic HlNlinfluenza virus is critical for its high transmissionefficiency in the guinea pig model.J Virol 85:11235-41?”中公开过,公众可从中国农
业大学获得。
[0035]犬MDCK细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为3131C0001000400014；
[0036]pGLuc Min1-TK2购自NEB公司，产品目录号为N8086S ；
[0037]pcDNA3.1 (+)购自 Invitrogen 公司，产品目录号为 V790-20 ；
[0038]pCMV/SEAP质粒购自Tropix公司，产品目录号为AVlOC ；
[0039]Secrete-Pair?Dual Luminescence Assay Kit 购自 GeneCopoeia 公司，产品目录号为 SPDA-DO10 ；
[0040]OPT1-MEM I培养基购自Invitrogen公司，产品目录号为1267485 ；
[0041]TranslT-LTl 购自 Mirus 公司，产品目录号为 MIR2300。
[0042]实施例1、pGLucCa质粒的构建
[0043]一、pFluGLuc 质粒的构建
[0044](—)基因片段A的合成
[0045]1、参考 NCBI 提供的 pRSET-TAUT_2P 序列(ID: gb | KC795008.11 )，确定 17 启动子序列为 5’ -TAATACGACTCACTATAGG-3’ ；
[0046]2、参考28S核糖体终止区序列(ID:gb|M12074.l| )，确定RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列为 5’ -ccggagtactggtcgacctccgaagttggggggg-3’ ；
[0047]3、参考NCBI提供的流感病毒数据库，确定非结构蛋白NSl基因5’UTR保守序列为5’ -AGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATA-3’。
[0048]4、依次按照17启动子、RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列和非结构蛋白NS I基因的5 ’ UTR保守序列，合成基因片段A，其基因序列为
[0049]5，-TTGGaattctaatacgactcactatagggagacccaagctgttaacgctagcagttaaccggagtactggtcgacctccgaagttgggggggAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAgGATCCAGCCA-3，。(下划线所示序列为酶切识别位点)
[0050]A中17启动子、聚合酶I终止子序列的反向互补序列之间用5’ -gagacccaagctgttaacgctagcagttaa-3’连接；!7启动子前加EcoR I酶切位点5’ -GAATTC-3’和保护碱基5，-TTG-3，;NS 基因 5，UTR 后加 BamH I 酶切位点 5，-GGATCC-3，和保护碱基 5，-AGCCA-3，;
[0051](二)用EcoR I和BamH I双酶切基因片段A，得到基因片段；用EcoR I和BamH I双酶切pGLuc Min1-TK2，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pFluGLuc，将重组质粒送测序，测序正确。
[0052]二、pGLucC a质粒的构建
[0053](一)基因片段B的合成
[0054]1、参考NCBI提供的流感病毒数据库，确定NEP基因3’UTR保守序列为5’_TGATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT-3’ ；
[0055]2、参考NCBI上犬RNA聚合酶I型启动子基因序列(ID:dbj |AB430549.11 )，确定本发明中使用的犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列为5’-ACCTACCTGGCAACAAAAAATGTTCATTTCGGGCMGAAAATAACCGCGCCTGCCGGCGGGGACCAGCCA CAGGTCACCGCGACCTCCCGGGACCGTGACACGGCCAACTGTACCCAAAACCTGCCCCACGGCGCCCCCCCACC CCCACCCCACGGAGCCCCCAGGGCTATCTGGTCGACCCAGGGAAACCGGGGGGGTGGGGGGGGGGTGAGGAGGG GCGATACGCGGTCGGTGGAGACGCCACGCCGCCACGCCGCCACGCCGCCACGCCGTCACGCCGCCACGCCGCCA CGCCAGTGATCTCCGGGAGGAGACTTTGAAAAATCATCAAAGTTCTCCGGAGGCAGGC-3，；
[0056]3、依次按照NEP基因3’UTR序列和犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列合成基因片段B，其序列如下:
[0057]5，-TGGTGACTAAGCggccGCTGATAAAAAACACCCTTGTTTCTACTACCTACCTGGCAACAAAAAATGTTCA TTTCGGGCAAGAAAATAACCGCGCCTGCCGGCGGGGACCAGCCACAGGTCACCGCGACCTCCCGGGACCGTGAC ACGGCCAACTGTACCCAAAACCTGCCCCACGGCGCCCCCCCACCCCCACCCCACGGAGCCCCCAGGGCTATCTGGTCGACCCAGGGAAACCGGGGGGGTGGGGGGGGGGTGAGGAGGGGCGATACGCGGTCGGTGGAGACGCCACGCC GCCACGCCGCCACGCCGCCACGCCGTCACGCCGCCACGCCGCCACGCCAGTGATCTCCGGGAGGAGACTTTGAA AAATCATCAAAGTTCTCCGGAGGCAGGCggtcacctaaatgctTCTAGAAATAATT-3，。(下划线所示序列为酶切识别位点)
[0058]B中NEP基因3 ’ UTR序列前加Not I酶切位点5，-GCggccGC-3 ’和保护碱基5’-TGGTGACTAA-3’，犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列后面加Xba I酶切位点5’ -TCTAGA-3’和保护碱基5’ -AATAATT-3’，犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列和Xba I酶切位点之间用5’ -ggtcacctaaatgct-3’序列连接。
[0059](二)用Not I和Xba I双酶切基因片段B，得到基因片段；用Not I和Xba I双酶切pFluGLuc，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pGLucCa，将重组质粒送测序，测序正确。
[0060]pGLucCa的结构示意图如图1所示。
[0061]图1中，T7promoter表不T7启动子序列；pol I terminator表不RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列；NS5’UTR表不非结构蛋白基因NSl的5’UTR保守序列；NS3’UTR表示NEP基因的3’ UTR保守序列；Canine Pol I Promoter表示犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列。
[0062]pGLucCa 的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0063]测序结果表明质粒pGLucCa上第26_44位为17启动子序列，第75-108位为RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列，第109-134位为非结构蛋白基因NSl的5’ UTR保守序列，第148-705位为为GLuc基因，第714-739位为NEP基因的3’UTR保守序列，第740-1089位为犬源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列。
[0064]实施例2、犬细胞中流感病毒RNA聚合酶活性的测定
[0065]一、提取猪 H1N2 流感病毒 A/swine/Guangdong/1222/2006 (H1N2)、禽 H9N2 流感病毒 A/chicken/Hebei/LC/2008(H9N2)和人 HlNl 流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的RNA,并反转录成cDNA，得到猪H1N2流感病毒的cDNA、禽H9N2流感病毒的cDNA和人HlNl流感病毒的cDNA。
[0066]二、合成表1的引`物。
[0067]表1PCR 引物
[0068]
【权利要求】
1.一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的病毒为流感病毒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于:所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人HlNl流感病毒。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于:所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在犬细胞中的RNA聚合酶活性。
7.一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒，包括权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、犬细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒 RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点得到的； 所述犬细胞为犬MDCK细胞。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。
10.一种检测待测病毒RNA聚合酶在犬细胞中RNA聚合酶活性的方法，是利用权利要求7-9中任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤: 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a ； 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作b ； 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP共同转入所述犬细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作对照比值； 若a显著大于对照比值，则判定所述待测病毒A的RNA聚合酶在犬细胞中具有RNA聚合酶活性； 若a和b显著大于对照比值，并且a显著大于b，则判定病毒A在犬细胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在犬细胞中的RNA聚合酶活性； 所述待测病毒为流感病毒。`
【文档编号】C12Q1/68GK103497960SQ201310438794
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】孙怡朋, 刘金华, 刘林青 申请人:中国农业大学