迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法
【专利摘要】一种迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法，属于海洋细菌冷冻真空干燥保存【技术领域】。成份为：脱脂乳粉，乳糖，海藻糖，维生素C，NaCl和无菌水。在无菌条件下将迟钝爱德华氏菌的活菌悬液与上述冻干保护剂溶液按体积比1:4～1:1的比例充分混合均匀后，分装，在-80℃条件下快速冷冻5～6小时，再在真空度0.28mbar、冻干舱温度-54℃的条件下冻干18小时后，将真空度降至0.034mbar，温度-54℃继续冻干2小时。冻干完成后向冻干舱内充入99.99％的干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封。本发明建立了迟钝爱德华氏菌冷冻真空干燥长期保存的技术方法，为深入开展迟钝爱德华氏菌的相关研究提供了技术支撑。
【专利说明】迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋细菌冷冻真空干燥保存【技术领域】，具体地涉及一种适用于迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂及其冻干方法。
【背景技术】
[0002]迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，又名迟缓爱德华氏菌，在世界范围内广泛分布于海、淡水环境中，是水生生物的重要致病菌，可引起鱼类、两栖类等多种水产经济动物的疾病，对养殖生产构成严重的威胁(郑大海等2004)。因此，有关迟钝爱德华氏菌的研究逐渐成为水产养殖病原学研究领域的一个热点，国内外学者对迟钝爱德华氏菌的分类、致病机理、抗原特性和疫苗等方面都进行了较为深入的研究(Matt J.Griffin, etal.2013，Jong Earn Yuj et al.2013，Meng Zhang, et al.2012，Seung Hyuk Choi, etal.2011X
[0003]近十年来，随着我国海水鱼类养殖产业的快速发展，由迟钝爱德华氏菌引起的疾病在不同的海水鱼类养殖品种中都有发现。中国水产科学研究院黄海水产研究所从患“脾肾结节症”的大菱鲆脾脏和肾脏中分离到了一株优势细菌，经过深入细致的病原学和病理学研究，证实大菱鲆“脾肾结节症”的致病原是迟钝爱德华氏菌(水产学报，2007年第31卷第4期)，并深入进行了迟钝爱德华氏菌和其他常见海水鱼类病原菌的多重PCR检测技术和荧光定量PCR检测技术研究(刘智超，中国海洋大学硕士毕业论文，2012年)。同时，针对包括迟钝爱德华氏菌在内的多种大菱鲆常见病原筛选了一种多效中草药复方(国家发明专利ZL201010100782.8)。这些研究主要集中于迟钝爱德华氏菌感染养殖大菱鲆发病的流行病学、病原学、病理学和防治技术等方面，并未涉及到迟钝爱德华氏菌的长期保存技术研究。
[0004]因为迟钝爱德华氏菌是鱼类较为常见且致病力较强的病原菌，已被公认为水生经济动物细菌性疾病病原学研究的模式物种之一。在深入研究了该菌的病原学特性和致病机理等方面后，国内外很多学者研究认为研制开发相应的疫苗是预防迟钝爱德华氏菌病最有效的措施之一，而如何长期保藏具有生物学活性的迟钝爱德华氏菌或其疫苗成为其中的关键技术环节。真空冷冻干燥技术是目前长期保藏微生物菌株并保存其活性最有效的技术方法，非常适宜用于迟钝爱德华氏菌活菌株或疫苗的长久保存。然而，由于迟钝爱德华氏菌自身的生物学特性、生境条件、营养需求、人工培养方法等有其特异性，很难借鉴其他微生物菌株的保存方法，因此寻找合适的真空冷冻干燥保护剂和冻干方法是实现迟钝爱德华氏菌冻干长久保存必须解决的技术难题。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种用于冷冻真空干燥保存迟钝爱德华氏菌菌株的冻干保护剂和具体的冻干方法，能够实现迟钝爱德华氏菌在常温下的长期保藏和保存活力，为深入开展迟钝爱德华氏菌的相关研究提供技术支撑。
[0006]本发明采用如下技术方案予以实现:[0007]—种迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂，它的组成成份为:脱脂乳粉、乳糖、海藻糖、维生素C、NaCl和无菌蒸馏水。[0008]进一步，所述的迟钝爱德华氏菌的真空冷冻干燥保护剂，它的组成成份及其终浓度为:脱脂乳粉50~150g/L，乳糖50~100g/L，海藻糖100g/L，维生素C 5~20g/L，NaCl15g/L，溶剂为无菌蒸馏水。
[0009]一种所述的保护剂的配制方法为:将脱脂乳粉、乳糖和海藻糖溶于无菌NaCl溶液中，在106°C条件下湿热灭菌30min，自然冷却后配制成溶液A ;将维生素C溶于无菌NaCl溶液中，并经0.22 μ m混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液B ;将配置好的溶液A和溶液B在无菌条件下混合，并振荡均匀后配制成冻干保护剂溶液，其各成份的终浓度为脱脂乳粉50~150g/L、乳糖 50 ~150g/L、海藻糖 100g/L、维生素 C 5 ~20g/L、NaCl 15g/L。
[0010]本发明还提供一种迟钝爱德华氏菌的冻干方法。
[0011]本发明是按如下技术方案实现的:
[0012]一种迟钝爱德华氏菌冷冻真空干燥保藏的冻干方法，具体步骤是将经纯化培养的迟钝爱德华氏菌用无菌的1.5% NaCl溶液配制成IO7~109cfu/mL的活菌悬液，并将活菌悬液与上述冻干保护剂溶液按体积比1:4~1:1的比例充分混合均匀后，分装至安培瓶中并置于_80°C条件下快速冷冻5~6小时，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.28mbar、冻干舱温度_54°C的条件下冻干18小时后，将真空度降至0.034mbar,并维持冻干舱温度_54°C的条件下继续冻干2小时，待冻干完成后向冻干舱内充入99.99%的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封。密封完毕的安培瓶内即装有冻干的迟钝爱德华氏菌菌粉，能够置于常温下长期保存。
[0013]本发明与现有技术对比的有益效果:
[0014]1.优化了冻干保护剂的配方，并在其中添加了一定的盐分，使其更加适用于迟钝爱德华氏菌的冻干保藏。
[0015]2.改良了冷冻真空干燥的冻干程序，将冻干程序设置为不同真空度的两个阶段，使冻干更为彻底，保存效果更好。
[0016]3.冻干完毕后向冻干舱中充入了高纯度二氧化碳气体并直接压盖密封，由于二氧化碳气体密度较大，有效隔绝了冻干菌株与空气的直接接触，在惰性气体的保护下使冻干菌株的保存期更长。
【具体实施方式】
[0017]下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明:
[0018]实施例1
[0019]从山东省威海市某大菱鲆养殖厂采集到患“脾肾结节症”的大菱鲆病鱼数条，将其打包充氧带回中国水产科学研究院黄海水产研究所实验室进行病原分离。无菌操作分别剪取少许病鱼的脾脏和肾脏组织，将其放入无菌培养皿中用灭菌的1.5%的NaCl溶液轻轻滴洗数次后，将组织剪碎。用接种环挑取少量剪碎的组织，在胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上进行划线分离细菌。将划线完毕的培养基置于28°C恒温培养箱培养48h，从形态一致的优势菌落中选取单个菌落，再次转接至一个新的胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上进行划线培养。重复以上步骤2~3次，直至获得病原菌的纯培养菌落。将获得的纯培养物制成高浓度的活菌悬液，并腹腔注射健康大菱鲆以验证其致病性。对验证后的病原菌进行常规生理生化表型实验和16S rDNA序列比对分析,鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。
[0020]挑取纯培养的迟钝爱德华氏菌单菌落接于胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，置于生化培养箱中在28°C、150rpm条件下培养20h后，于4000r/min离心8min弃上清，收集菌体沉淀，然后加入菌体体积15倍左右的浓度为1.5%的无菌NaCl溶液充分振荡均匀后，再次于4000r/min离心8min,弃上清,收集菌体沉淀,重复同样步骤两次后,用浓度为1.5%的无菌NaCl溶液将收集的菌体重悬配制成IO7~109cfu/mL的菌悬液备用。
[0021]先分别将5g脱脂乳粉、5g乳糖和IOg海藻糖溶于90mL浓度为1.5%的NaCl溶液中，在106°C条件下湿热灭菌30min,自然冷却后配制成溶液A。将0.5g维生素C溶于IOmL浓度为1.5%的无菌NaCl溶液中，并经0.22 μ m混合纤维素滤膜过滤后配制成溶液B。将配置好的溶液A和溶液B在无菌条件下混合，并振荡均匀后配制成IOOmL的冻干保护剂溶液，其各成份的终浓度为脱脂乳粉50g/L、乳糖50g/L、海藻糖100g/L、维生素C 5g/L、NaCl15g/L。
[0022]在无菌条件下，将已配置好的菌悬液和保护剂溶液按体积比1:1的比例混合并振荡均匀后，分装至数个2mL的无菌安培瓶中，每个安培瓶中装有1.5mL的混合液，将安培瓶盖上胶塞后在_80°C超低温冰箱中冷冻5h。然后将已结冰的混合溶液迅速放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，在真空度0.28mbar、冻干舱温度为_54°C的条件下冻干18小时，之后将真空度降低为0.034mbar,维持冻干舱温度_54°C继续冻干2小时。冻干程序完成后，向冻干舱内缓慢充入99.99%的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封即完成迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保存。冻干并密封后的安培瓶置于常温下保存。
[0023]在冻干完成后的当天，第7天和第90天，分别随机挑选5个安培瓶，在无菌条件下打开密封并加入1.5mL的灭菌蒸馏水进行复水，待冻干粉末完全溶解后用浓度为1.5%的无菌NaCl溶液进行梯度稀释，并用`胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板培养基涂布进行活菌计数，以测定冻干菌株的存活率。每个梯度进行2次平行实验，取其平均值，结果见表1。
`[0024]本次实验结果证明，通过本方法获得的迟钝爱德华氏菌冻干菌粉常温保存I天、7天和90天后的平均存活率均高于19%，取得了较佳的冻干保存效果。
[0025]表1迟钝爱德华氏菌冻干菌粉复水后的存活率
[0026]
【权利要求】
1.一种迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂，其特征在于它的组成成份为:脱脂乳粉，乳糖，海藻糖，维生素C、NaCl和无菌蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂，其特征在于它的各种成份的终浓度为:脱脂乳粉50~150g/L，乳糖50~100g/L，海藻糖100g/L，维生素C5~20g/L, NaCl 15g/L,溶剂为无菌蒸懼水。
3.利用权利要求1或2所述的冷冻真空干燥保护剂进行迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保藏的冻干方法，其特征在于它的方法步骤是: 用无菌的1.5% NaCl溶液将待冻干的迟钝爱德华氏菌纯培养菌落配制成IO7~109cfu/mL的活菌悬液，并在无菌条件下将活菌悬液与权利要求1或2所述的保护剂溶液按体积比1:4~1:1的比例充分混合均匀后，分装至安培瓶中并置于-80°C条件下快速冷冻5~6小时，再放入预冷的真空冷冻干燥机冻干舱中，设置真空度0.28mbar、冻干舱温度_54°C的条件下冻干18小时后，将真空度降至0.034mbar，维持冻干舱温度_54°C继续冻干2小时，待冻干完 成后向冻干舱内充入99.99%的高纯度干燥二氧化碳气体至标准大气压并压盖密封。
【文档编号】C12N1/04GK103468573SQ201310443283
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】张正, 王印庚, 于永翔, 廖梅杰, 荣小军, 史秀清, 李彬, 王岚 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所