一种检测香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：（1）将每株待测组培苗置于45mL水培营养液中培养至根长达10厘米，每1-4天更换水培营养液；（2）接种5mL分生孢子浓度为1×105-1×107cfu/mL的待测香蕉枯萎病病原菌的菌悬液，28℃自然光照条件下培养3小时；（3）用50mL新的水培营养液替换原有液体，28℃自然光照条件下培养20-25天，期间每1-4天更换新的水培营养液；（4）切开球茎观察褐变情况，统计病情指数，根据病情指数判断检测待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力。本发明提供的方法可广泛应用于科研与生产。
【专利说明】一种检测香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测香蕉枯萎病病原菌的致病力的方法。
【背景技术】
[0002]香蕉是继水稻、小麦、玉米之后的世界第四大粮食作物，也是全世界贸易量最大宗的鲜果。我国是香蕉的主产区之一，2009年香蕉总产量排名世界第二，香蕉产业的发展为我国国民经济的增长作出了重要贡献。
[0003]香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌古巴专化型所引起的真菌性土传维管束病害。香蕉枯萎病自1874年首次在澳大利亚被报道后迅速传播，并陆续在许多其他香蕉的产地发现。我国台湾省于1967年首次发现该病后，立即大面积流行，现已在海南、云南、广东、广西和福建等省都有发现。蕉园中一旦有植株感染上该病，其发病率一般都高达在10% -40%,部分发病率高的蕉园只能荒废，给我国香蕉产业带来巨大损失。
[0004]目前，关于香蕉枯萎病病原菌致病力的测定主要存在如下两种方法:(I)通过沙床香蕉苗测定致病力；(2)通过盆栽香蕉苗测定致病力。以上两种方法均存在很大的缺陷，沙床香蕉苗可能会由于沙子被污染，其中带有杂菌或者根结线虫等而导致实验结果不准确。盆栽香蕉苗成本高，不利于大规模实验，并且根部在土中生长，不便于观察，发病情况对环境因素的依赖很大。由于以上种种原因，建立一个标准化的香蕉枯萎病病原菌致病力测定方法意义重大。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测香蕉枯萎病病原菌(又称香蕉枯萎病致病菌)的致病力的方法。
[0006]本发明提供的检测待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力的方法，依次包括如下步骤:
[0007](I)将每株待测香蕉品种的组培苗置于45mL水培营养液中培养至根长达10厘米，期间每1-4天更换新的所述水培营养液；所述水培营养液的制备方法如下:取900-1000mgCaC03、450-500mg KN03、100_150mg KH2P04、150_200mg MgSO4 和 10_20mg FeSO4,溶于纯净水并用纯净水定容至IL ；
[0008](2)完成所述步骤(1)后，接种5mL菌悬液，28°C自然光照条件下培养3小时；所述菌悬液为悬浮待测香蕉枯萎病病原菌的分生孢子得到的孢子浓度为I X IO5-1 X 107cfu/mL的菌悬液(具体可为lX106cfu/mL的菌悬液)；
[0009](3)完成所述步骤(2)后，用50mL新的所述水培营养液替换原有液体，28 °C自然光照条件下培养20-25天，期间每1-4天更换新的所述水培营养液；
[0010](4)完成所述步骤(3)后，切开球茎观察褐变情况，统计病情指数，根据病情指数判断检测待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力。
[0011]如果病情指数为0，说明待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种不致病。病情指数越高，待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力越高。
[0012]所述水培营养液的制备方法具体如下:取950mg CaC03、475mg KN03、125mgKH2P04、175mg MgSO4和15mg FeSO4，溶于纯净水并用纯净水定容至1L。
[0013]所述菌悬液的制备方法具体如下:取香蕉枯萎病病原菌的分生孢子，用含IOOmg/HiL硫酸链霉素的PDA液体培养基作为液相，得到孢子浓度为I X IO5-1 X 107cfu/mL的菌悬液(具体可为I X 106cfu/mL的菌悬液)。
[0014]所述香蕉枯萎病病原菌可为尖孢镰刀菌古巴专化型，具体可为尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
[0015]所述香蕉品种可为巴西蕉或粉蕉。
[0016]所述组培苗具体可为吸芽的分生组织作为外植体得到的组培苗。
[0017]所述组培苗的制备方法依次包括如下步骤:
[0018]①取待测香蕉品种的分生组织，作为外植体；
[0019]②将步骤①得到的外植体接种于初代培养基，先28±2°C暗培养5-7天，然后28±2°C培养(每24小时的光照时间可为8-10小时，光照强度可为15001x) 20天；然后转
接至增殖培养基进行继代培养；
[0020]所述初代培养基为含5.0mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS培养基；所述增殖培养基为含3.0mg/L6-BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS培
养基;
[0021]③完成所述继代培养后(当步骤②中的外殖体增殖芽达到一定数量时)，转接至生根培养基，先28±2°C暗培养3-5天，然后28±2°C培养(每24小时的光照时间可为10-12小时，光照强度可为20001χ)，直至组培苗苗满足如下标准:假茎高2.5厘米以上，粗
0.3-0.4厘米；假茎浅绿色；具有2张以上自然平展的绿叶和2条以上白色的根，根长3厘米以上，有分叉侧根和根毛；
[0022]所述生根培养基为含0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂和2g/L活性炭的1/2MS培养基。
[0023]所述外植体的制备方法具体如下:挖取待测香蕉品种植株的吸芽，剥除假茎上的部分叶鞘，切取2-3厘米长的茎尖，先用75% (体积分数)酒精水溶液浸泡洗涤15秒，再用
1.5%(质量分数)次氯酸钠或0.2%(质量分数)升汞水溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台上继续逐叶剥除剩余的叶鞘，剥至高为1-1.5cm、直径为1.2cm，再将分生组织从顶部往下均匀切成4块，即为外植体。
[0024]本发明提供的方法克服了传统方法对环境条件依赖大、致病力测定不稳定、成本过高、容易污染等缺点，使得对病原菌致病力的测定简单化、标准化，测定结果也方便观察，可广泛应用于科研与生产。
[0025]本发明提供的方法的具体用途举例如下:(I)在田间采样分离得到的疑似病原菌可通过该方法进行分离鉴定，并可对不同地点采集的香蕉枯萎病菌致病力强弱进行测定；
(2)可通过水培不同品种的香蕉(如巴西蕉、粉蕉等)来鉴定香蕉枯萎病菌的不同生理小种；
(3)可通过接种绿色荧光蛋白(GFP)标记的香蕉枯萎病菌来对该菌在香蕉植株中的侵染过程进行观察。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为正常香蕉(左)与发病香蕉(右)的球茎纵切比较。
【具体实施方式】
[0027]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。巴西蕉:中国热带农业科学院种苗组培中心。粉蕉:中国热带农业科学院种苗组培中心。尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种:周端咏，刘一贤，谢德嘯等.香蕉枯萎病菌stel2基因的克隆与序列分析.热带作物学报[J].2011，32 (12):2298-2301。尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种:杨歆璇，羊玉花，杨腊英等.celex-100法快速提取镰刀菌基因组DNA.公共植保与绿色防控[A].2010。
[0028]实施例1、检测香蕉枯萎病原菌对巴西蕉的致病力
[0029]一、制备组培苗
[0030]1、制备外植体
[0031]挖取巴西蕉植株的吸芽，剥除假茎上的部分叶鞘，切取2-3厘米长的茎尖，先用75% (体积分数)酒精水溶液浸泡洗涤15秒(以杀死茎尖表面的病菌)，再用1.5%(质量分数)次氯酸钠或0.2%(质量分数)升汞水溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台上继续逐叶剥除剩余的叶鞘，剥至高为1-1.5cm、直径为1.2cm，再将分生组织从顶部往下均匀切成4块，即为外植体。
[0032]2、外植体的培养及增殖培养
`[0033]将步骤I得到的外植体接种于初代培养基，先28±2°C暗培养5-7天，然后28±2°C培养(每24小时的光照时间为8-10小时，光照强度为15001x) 20天；然后转接至增殖培养基进行继代培养，以促进不定芽的增殖。
[0034]初代培养基:含5.0mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS培养基。
[0035]增殖培养基:含3.0mg/L6-BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和5g/L琼脂的MS培养基。
[0036]3、生根培养
[0037]当步骤2中的外殖体增殖芽达到一定数量时，将其转接至生根培养基，先28±2°C暗培养3-5天，然后28±2°C培养(每24小时的光照时间为10-12小时，光照强度为20001x)，直至组培苗苗满足如下标准:假茎高2.5厘米以上，粗0.3-0.4厘米；假茎浅绿色；具有2张以上自然平展的绿叶和2条以上白色的根，根长3厘米以上，有分叉侧根和根毛；培养基面应无菌丝等污染物。
[0038]生根培养基:含0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂和2g/L活性炭的1/2MS培养基。
[0039]二、检测香蕉枯萎病病原菌对巴西蕉的致病力
[0040]实验地点为海南省海口市，实验时间为7月份。
[0041]1、取步骤一得到的巴西蕉的组培苗，分别将每株组培苗置于含有45mL水培营养液的水培容器中培养至根长达到10厘米(通常需要5-10天，每2天更换一次水培营养液，注意假茎底部要高于水培营养液的液面)，然后接种5mL菌悬液，28°C自然光照条件下培养3小时。
[0042]水培营养液的制备方法:取950mg CaC03、475mg KN03、125mg KH2PO4、175mgMgS0jP15mg FeSO4，溶于纯净水并用纯净水定容至1L。
[0043]菌悬液的制备方法:取香蕉枯萎病病原菌(尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种)的分生孢子，用含lOOmg/mL硫酸链霉素的PDA液体培养基作为液相，得到孢子浓度为lX106cfu/mL的菌悬液。
[0044]2、完成步骤I后，用50mL新的所述水培营养液替换水培容器中的原有液体，28°C自然光照条件下培养，每2天更换一次所述水培营养液，20-25天左右切开球茎观察褐变情况，统计病情指数。
[0045]病情指数=(发病级数X该级株数)/ (最高级数X总株数)X 100%。
[0046]发病级数判断标准:0级:球茎内部不变色；
[0047]I级:球茎内部不变色，但根与球茎交接处变色；
[0048]2级:球茎内部0-5%变色；
[0049]3级:球茎内部6-20%变色；
[0050]4级:球茎内部21-50%变色；
[0051]5级:球茎内部50%以上变色；
[0052]6级:球茎内部全 部变色；
[0053]7级:死株。
[0054]进行三次重复实验，每次重复实验中对10株巴西蕉组培苗进行试验。
[0055]通过统计病情指数，可以了解致病菌致病力强弱。尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种不能对巴西蕉致病(即所有组培苗的发病级数均为O级，病情指数为0)，尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种能对巴西蕉致病(病情指数为40%)。
[0056]正常香蕉(左)与发病香蕉(右)的球茎纵切比较见图1。
[0057]实施例2、检测香蕉枯萎病原菌对粉蕉的致病力
[0058]一、制备组培苗
[0059]用粉蕉植株代替巴西蕉植株，方法同实施例1的步骤一。
[0060]二、检测香蕉枯萎病病原菌对粉蕉的致病力
[0061]实验地点为海南省海口市，实验时间为7月份。
[0062]用步骤一制备的粉蕉的组培苗代替巴西蕉的组培苗，方法同实施例1的步骤二。
[0063]进行三次重复实验，每次重复实验中对10株粉蕉组培苗进行试验。
[0064]通过统计病情指数，可以了解致病菌致病力强弱。尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种能对粉蕉致病(病情指数为40%)，尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种能对粉蕉致病(病情指数为40%)。
【权利要求】
1.一种检测待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力的方法，依次包括如下步骤: (O将每株待测香蕉品种的组培苗置于45mL水培营养液中培养至根长达10厘米，期间每1-4天更换新的所述水培营养液；所述水培营养液的制备方法如下:取900-1000mgCaC03、450-500mg KN03、100_150mg KH2P04、150_200mg MgSO4 和 10_20mg FeSO4,溶于纯净水并用纯净水定容至IL ； (2)完成所述步骤(1)后，接种5mL菌悬液，28°C自然光照条件下培养3小时；所述菌悬液为悬浮待测香蕉枯萎病病原菌的分生孢子得到的孢子浓度为lX105-lX107cfu/mL的菌悬液； (3)完成所述步骤(2)后，用50mL新的所述水培营养液替换原有液体，28°C自然光照条件下培养20-25天，期间每1-4天更换新的所述水培营养液； (4)完成所述步骤(3)后，切开球茎观察褐变情况，统计病情指数，根据病情指数判断检测待测香蕉枯萎病病原菌对待测香蕉品种的致病力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述水培营养液的制备方法如下:取950mgCaC03、475mg KN03、125mg KH2PO4U75mg MgS0dP15mg FeSO4,溶于纯净水并用纯净水定容至IL0
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述菌悬液为孢子浓度为IXlO6Cfu/HlL的菌悬液。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述菌悬液的制备方法如下:取香蕉枯萎病病原菌的分生孢子，用含lOO`mg/mL硫酸链霉素的PDA液体培养基作为液相，得到菌悬液。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述香蕉枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型I号生理小种或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述香蕉品种为巴西蕉或粉蕉。
【文档编号】C12R1/77GK103497989SQ201310443260
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】黄俊生, 毛超, 杨腊英, 梁昌聪, 郭立佳, 刘磊, 王国芬 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所