一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8α,15α-环氧化石杉碱甲的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia?lacerate)HS-ZJUT-C13A，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC?M?2012433。本发明提供的菌株，可用于制备具有神经保护疗效的化合物8α，15α-环氧化石杉碱甲，转化方法具有发酵条件简单、菌种易培养、底物转化率高等优势，具有工业化规模生产的潜力，是一种获得该化合物的新途径，既保护了珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏，又能给缓解石杉碱甲临床用药需求短缺的局面开拓新思路。
【专利说明】—种蛇足石杉内生真菌及其在制备8 α，15 α -环氧化石杉碱甲的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物化学【技术领域】，具体涉及一种蛇足石杉内生真菌及其在制备8 α，15 α -环氧化石杉碱甲的应用，该应用主要是指采用微生物转化的方法制备8 α，15 α -环氧化石杉碱甲。
【背景技术】
[0002]石杉碱甲(huperzine A)是来源于石松科石松属植物蛇足石杉(Huperziaserrata)的一个生物碱类化合物。大量科学研究已经表明，石杉碱甲对中枢乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase, ACHE)具有高效、可逆、高选择性的抑制作用，可用于治疗阿尔茨海默症(AD)，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。因此，石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注，研究的热点主要集中于该化合物及其类似物的化学合成、结构修饰、活性评价、构效关系等方面。
[0003]目前，石杉碱甲及其类似物来源主要有三条途径:
[0004]途径一:从蛇足石杉植株中提取。该方法的缺陷在于:①蛇足石杉属于高等蕨类植物，生长缓慢(自然生长周期长达10~15年)，孢子萌发率低，使得野生资源匮乏(MaXQ, et α 1.The Lyc opodium alkaloids.Nat.Prod.Rep., 2004, 21, 752-772.);②人工栽培技术落后，使得蛇足石杉植株的成活率极低蛇足石杉植株体内的石杉碱甲含量相对较低，王峻等学者采集6种石杉科植物分别对其根、茎、叶、孢子囊等部位测定石杉碱甲含量，发现蛇足石杉植株全草的石杉碱甲含量仅为0.0332%，根部最少为0.0045%，孢子囊最多为0.0601% (王峻，潘胜利.湖南省石杉属植物中石杉碱甲含量的研究[J].中国药学杂志，2005，21，1616-1618.)。
[0005]途径二:通过蛇足石杉近缘植物的组织培养技术获得。该方法的缺陷在于:由于蛇足石杉近缘植物中含有丰富的微生物，使得其组织培养材料的灭菌困难，因此只有极少数获得了初步成功。Wojciech Szypula等研究报道，以伏贴石杉进行组织培养,其幼嫩新梢中石杉碱甲含量为3.33mg/kg，但未见其大田培养成功，也难以大规模获得石杉碱甲。
[0006]途经三:化学合成。如意大利科学家Kozikowski AP等(1989年)进行了石杉碱甲类似物的合成、英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成，该方法的缺陷在于:①由于石杉碱甲分子结构存在较强的刚性，对其进行结构修饰的难度很大，目前已经报道的修饰也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基，结构修饰的位点较单一；②合成出来的石杉碱甲类似物只有极少数具有明显的治疗效果，可筛选的化合物较少所有的化学合成路线均存在反应条件苛刻、目标产物收率低、无法实现工业化生产等技术障碍。
[0007]微生物生物合成及转化是一种新兴的获得天然产物及其类似物的手段，其本质是利用微生物或其产生的酶(系)对外源添加物进行合成与结构修饰的过程，具有操作简便、条件温和、选择性高、立体专一性强等优势，可以完成非活化饱和碳链的氧化、醚键的断裂等化学方法较难进行的反应。[0008]有关石杉碱甲的微生物转化研究，近年来才刚兴起，但主要集中在通过微生物发酵的手段来获取石杉碱甲及其类似物。如CN101195804B的中国发明专利(发明名称:蛇足石杉内生真菌及其应用，申请号:200610119149.7)中公开的一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)。该菌株保藏号为CCTCC M206118。该发明通过蛇足石杉内生真菌菌株液体发酵，产生了石杉碱甲类似化合物。又如CN102168017B的中国发明专利(发明名称:一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法，申请号:201010296985.9)中公开的一种石杉碱甲高产菌，该菌株为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides) isolate YLJ-13，保藏号为CCTCC M2010181。该菌株在改良马铃薯液体培养基进行发酵，从发酵液中得到石杉碱甲。上述两个技术方案的不足之处均在于:通过发酵方法获得的目标化合物产率低，无法满足工业化生产的需求。
[0009]2010年，中国医学科学院药物研究所戴均贵研究员通过研究Streptomycesgriseus CACC200300(来源未报道)对石杉碱甲的微生物转化，首次获得了包括8 α，15 α -环氧化石杉喊甲在内的5个新化合物(Zhang XY, Zou JH and Dai JG.TetrahedronLett, 2010，51，3840-3842.)，这是截至目前唯一的一例有关石杉碱甲微生物转化的报道；其后的药理学研究表明仅8 α，15 α -环氧化石杉碱甲对硝普钠诱导的PCI2细胞凋亡具有保护作用(Ning N, Hu JF, Yuan YH, Zhang XY, Dai JG and Chen NH.Acta.Pharmacol.Sin.,2012，33，34-40)，显示出了该化合物具有被开发成为神经保护类药物的潜质。8 α，15 α -环
氧化石杉碱甲的分子式为C15H18N2O2，结构式如下所示:
【权利要求】
1.一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate) HS-ZJUT-C13A，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC M2012433，保藏单位地址为中国，武汉,武汉大学。
2.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的ITS碱基序列为:
3.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的固体培养为:在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28°C培养，菌丝呈白色绒毛状，生长蓬松、呈放射形生长，且多为气生菌丝，与培养基结合紧密；培养4~7天，菌落即铺满整皿，菌落干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。
4.根据权利要求3所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，通过如下方法制得:取200g马铃薯去皮、切块后，加IL水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。
5.一种用如权利要求1~4所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15α-环氧化石杉碱甲的应用，其制备步骤如下: (1)挑取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28°C培养，使菌株活化； (2)将活化好的菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，投入底物石杉碱甲，28°C发酵培养，得转化产物； (3)发酵结束，除去菌丝，调节发酵液的PH至9~11，用萃取剂萃取，减压蒸馏回收溶剂，得转化产物的提取物； (4)将转化产物的提取物用MCI大孔树脂进行柱层析、洗脱，再经凝胶柱层析、纯化、洗脱，即得8α，15α-环氧化石杉碱甲。
6.根据权利要求5所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15 α -环氧化石杉碱甲的应用，其特征在于，步骤(2)中的发酵条件为:温度28±2°C、转速为160~200转/分钟，培养时间6~14天,底物石杉碱甲的终浓度为0.01~0.lmg/mL。
7.根据权利要求5所述的蛇足石杉内生真菌在制备8α，15 α -环氧化石杉碱甲的应用，其特征在于，步骤(3)中的萃取剂为氯仿，发酵液的PH调节剂为浓氨水和无水碳酸钠的混合。
【文档编号】C12N1/14GK103667072SQ201310445192
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】单伟光, 应优敏, 占扎君 申请人:浙江工业大学