一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法。本发明还提供了适用于进行人基因组CpG甲基化水平测序的BSP引物。本发明的方法适用于微量样品的基因组DNA检测，本发明的方法不仅可实现高通量检测，而且检测效率高、成本低廉，并能与最新高通量测序技术衔接。
【专利说明】一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学的DNA甲基化分析领域；更具体地，本发明涉及一种高通 量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检测方法。
【背景技术】
[0002] DNA序列改变以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普通和重要， 这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控机制被称为表观遗传学机制，包括组蛋白乙酰 化、DNA甲基化、MicoRNA、非编码长RNA等。其中以DNA甲基化研究最为深入，无论在针对 个别基因、还是在新兴的全基因组学层面以及功能调控领域都被广泛研究，并且在肿瘤临 床实践的诊断和治疗中的DNA甲基化的应用前景也受到了很大的重视。在肿瘤细胞中，一 些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的基因呈现出高甲基化的状态并转录失活，受累基 因包括抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因和抗凋亡基因等，由此促进了肿瘤的发 生发展。DNA甲基化的研究不仅可以从新的角度使人们进一步了解肿瘤的发生发展机制，肿 瘤细胞DNA呈现出的异常甲基化谱式已经成为一个新的肿瘤生物标志物的研究领域，而且 由于DNA甲基化修饰的可逆性，使其也具有成为分子治疗靶点的可能。
[0003] 当今DNA甲基化研究的主要方法分为全基因层面和基因层面。在全基因组 层面包括以DNA杂交为基础的芯片技术，有用特定蛋白富集基因组中甲基化DNA片段 后再与芯片杂交的CHIP-chip技术和将基因组DNA进行亚硫酸修饰后与芯片杂交的 methylation array技术；以高通量为基础的下一代测序技术，其中同样包括用特定蛋 白富集基因组中甲基化DNA片段后进行测序的方法如MethylCap-seq、MeDIP-seq和将 基因组DNA进行亚硫酸修饰后进行高通量测序的方法如Genome-wide Bisulfite-seq、 Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)。需要说明的是只有Genome-wide Bisulfite_seq、Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)这 2 种方法是单 碱基分辨率的DNA甲基化检测方法，其他组学研究方法都需后续的单基因单位点层面的甲 基化状况检测验证。在特定基因层面的检测方法包括以PCR(聚合酶链式反应）为基础对特 定DNA序列的MSP (甲基化特异性PCR)、qMSP (荧光定量甲基化特异性PCR)、MSRE_qPCR (甲 基化敏感内切酶酶切定量PCR);以测序为基础的BSP (亚硫酸处理PCR产物测序）、焦磷酸 测序。以PCR为基础的技术方法简便，但仅对引物或探针退火的几个CpG(CG二核苷酸）位 点进行检测。焦磷酸测序一个反应只能对60bp左右的特定序列中的CpG位点进行甲基化 检测，检测1个样本需200元，当需检测大样本受检样本和多区域甲基化水品时，价格极其 昂贵，如需检测100个样本中5个区域的甲基化水平，大致费用为：100*5*200=10万元。而 BSP方法是最为常用的特定位点单碱基分辨率的甲基化检测，可对500bp内的PCR产物中的 多个CpG检测，但一个PCR反应只能检测一个样品的一个特定位点，且需对PCR产物进行复 杂的连接克隆转化，并对克隆进行5个以上的一代测序（每个测序成本最少30元），无法进 行多样本多位点的甲基化检测，特别是微量DNA样本的多特定位点甲基化检测，当检测大 样本，多区域甲基化水平时，同样价格昂贵，同样如需检测100个样本中5个区域的甲基化 水平，大致费用为：100*5*5*30=75, 000元。
[0004] 综上所述，当今的甲基化组学研究都需要在后续的试验中，在多样本（临床样本 或细胞样本）中对批量的来自于甲基化组学中特定位点进行验证，但上述的基因层面的技 术都无法胜任这种多样本多位点的高通量单碱基分辨率甲基化检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种高通量多样本多靶点单碱基分辨率的甲基化水平检 测方法。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测方 法，所述方法包括：
[0007] (1)提取n个受试样本的目的基因组DNA;其中n为彡10的正整数（较佳地，n为 10-500 的正整数；如 15, 20, 50,100,140,150, 200, 300,400);
[0008] (2)对来自n个受试样本的目的基因组DNA分别用重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸 氢盐或重亚硫酸氢盐处理，分别获得n种处理产物；
[0009] (3)分别以⑵的n种处理产物为模板，分别用BSP引物组扩增含有CpG位点的序 列，获得--对应每一受试样本的n种扩增产物；
【权利要求】
1. 一种高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测方法，其特征在于，所述方法包 括： ⑴提取η个受试样本的目的基因组DNA;其中η为彡10的正整数； (2) 对来自η个受试样本的目的基因组DNA分别用重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐 或重亚硫酸氢盐处理,分别获得η种处理产物； (3) 分别以（2)的η种处理产物为模板，分别用BSP引物组扩增含有CpG位点的序列， 获得--对应每一受试样本的η种扩增产物； ⑷分别提供(ΙΝΤ(?种IlluminaIndexadapter正向接头和相同数量反向 接头，每一正向接头和一反向接头编成一组，形成(INT(?/_IT)+丨)2个不同组；选择其中的 η个组，每组中对正向接头与反向接头退火形成双链IlluminaIndexadapter,获得的η组 退火形成双链IlluminaIndexadapter与（3)获得的η种扩增产物分别连接；获得各自连 接有不同组的接头的η种连接产物； (5)将⑷中获得的各自连接有不同组的接头的η种连接产物进行混合，用针对Illumina Index adapter接头的引物序列进行PCR扩增，进行高通量测序。
2. -种构建用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的多样本文库的方法，其特征在 于，所述方法包括： ⑴提取η个受试样本的目的基因组DNA;其中η为彡10的正整数； (2) 对来自η个受试样本的目的基因组DNA分别用重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐 或重亚硫酸氢盐处理,分别获得η种处理产物； (3) 分别以（2)的η种处理产物为模板，分别用BSP引物组扩增含有CpG位点的序 列，获得一一对应每一受试样本的η种扩增产物；所述的BSP引物组的各引物中设置可与 IlluminaIndexadapter接头连接的序列； ⑷分别提供([NT(Vtl)+1)种Illumina Index adapter正向接头和相同数量反 向接头，每一正向接头和一反向接头编成一组，形成(INTd)+I)2个不同组；选择其中 的η个组，每组中对正向接头与反向接头退火形成双链IlluminaIndexadapter,获得的η组退火形成双链IlluminaIndexadapter与（3)获得的η种扩增产物分别连接；获得各自 连接有不同组的接头的η种连接产物； (5)将⑷中获得的各自连接有不同组的接头的η种连接产物进行混合，用针对IlluminaIndexadapter接头的引物序列进行PCR扩增，获得的扩增产物即为多样本文库。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，所述的BSP引物组包括SEQ IDNO: 1?SEQIDNO:60 的序列。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，根据SEQIDNO: 1?SEQID N0:60的引物的退火温度，分成多个PCR扩增系统，分别进行扩增； 较佳地，SEQIDNO: 1?SEQIDNO: 22的引物退火温度52°C，在一个PCR扩增系统中 扩增；SEQIDNO: 23?SEQIDNO: 50的引物退火温度54°C，在一个PCR扩增系统中扩增； SEQIDN0:51?SEQIDN0:60的引物退火温度60°C，在一个PCR扩增系统中扩增。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，η为小于144的正整数，步骤（4)中，所 述的IlluminaIndexadapter正向接头的核苷酸序列如SEQIDN0:61?SEQIDN0:72 所示； 所述的IlluminaIndexadapter反向接头的核苷酸序列如SEQIDN0:73?SEQID NO:84所示。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（5)中，运用Illuminasolexa，SOLID，IonTorrent或 454 方法测序。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法为非疾病诊断方法。
8. -种用于高通量检测目的基因组的甲基化水平的检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒中包括：SEQIDNO: 1?SEQIDNO:60的BSP引物。
9. 如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括： SEQIDN0:61?SEQIDN0:72所示的IlluminaIndexadapter正向接头；和SEQID N0:73?SEQIDN0:84 所不的IlluminaIndexadapter反向接头；或 所述试剂盒中还包括：重硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐。
10. 如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括： DNA抽提试剂； 荧光定量PCR检测试剂； PCR扩增试剂； PCR纯化试剂；和/或DNA连接试剂。
【文档编号】C12Q1/68GK104450872SQ201310444865
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】余坚, 高维强, 赵仰星, 孙晋枫, 张红宇, 顾峻, 何英华, 王韦 申请人:上海市肿瘤研究所