产生抗人d-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用ELISA法克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。并利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以D-二聚体作为检测抗原，进行抗体配对试验，获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。杂交瘤细胞株分泌相应的单克隆抗体，能进行配对和检测天然血清，初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
【专利说明】产生抗人D- 二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药工程【技术领域】，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人D-二聚体的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]D-二聚体(D-dimer)是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。具体而言，血衆中纤维蛋白原在凝血酶(thrombin)、FactorXIIIa (转谷酰胺酶)和钙离子的作用下，去掉血纤肽A、B，暴露出新的结合位点，自发聚集形成非共价结合的纤维蛋白束；纤维蛋白束再在Factor XIIIa的作用下，形成的异肽键，将聚合形式以共价键的方式稳定下来，称为交联纤维蛋白，即血栓的基本骨架；交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下，降解为不同大小的交联纤维蛋白降解产物，其最小结构(DD/E，也有文献认为是DD)因为含有两个由异肽键共价交联的D片段而称为D- 二聚体。
[0003]近年来，D-二聚体作为体内交联纤维蛋白水解的标志性产物，其临床诊断价值已得到普遍认同。它以其高度的敏感性和阴性预示能力，在深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的排除、弥散性血管内凝血(DIC)的诊断及溶栓治疗效果监测等方面具有很好的临床应用价值。
[0004]目前实验室中检测D-二聚体都是基于免疫学的方法，包括免疫层析(胶体金)方法、双向测流免疫测定法、化学发光酶联免疫法和免疫比浊测定法(包括免疫散射比浊法和免疫投射比浊法，每一种又有乳胶凝集增强和普通的两种类型)。所有这些方法都需要高质量的D- 二聚体特异性抗体，上述部分方法只用一种抗体即可工作，部分方法需要两种抗体进行配对后才能实现测定。目前D- 二聚体检测所用抗体全部来自于国外，国内尚未见到相关抗体报道和销售，客观上影响 了国内公司在D- 二聚体检测试剂上的研发，在一定程度上导致了目前国内D-二聚体检测试剂市场基本上被欧美公司全部占据的局面。
【发明内容】
[0005]本发明根据临床病人在凝血-纤维蛋白溶解过程中血液成分的相关变化，以纯化的天然D-二聚体为免疫原，通过改良的杂交瘤技术，获得杂交瘤细胞株，分泌D-二聚体特异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体能够配对用于D-二聚体的免疫检测。该抗体对将有助于D- 二聚体免疫检测试剂的研发。
[0006]本发明提供的两株产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明将其命名分别为1C6 (细胞保藏号CCTCC NO:C2013138)，培养物名称:杂交瘤细胞株1-C6 (IgGl)和IDlO (细胞保藏号CCTCC NO:C2013139)，培养物名称:杂交瘤细胞株1-D10 (IgG2b)。保藏单位为中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，简称CCTCC)，地址:中国武汉武汉大学，保藏日为2013年9月5日。
[0007]杂交瘤细胞株1C6和1D10均由纯化的D- 二聚体免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。
[0008]本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1C6所产生的单克隆抗体。
[0009]本发明还提供一种由杂交瘤细胞株IDlO所产生的单克隆抗体。
[0010]本发明还提供一种用于检测D- 二聚体的试剂盒，其包含杂交瘤细胞株1C6和/或IDlO所产生的单克隆抗体。
[0011]本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法，其主要包含步骤:
1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠；
2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合，利用间接ELISA法进行正向和负向筛选，克隆化筛选出能稳定分泌抗D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0012]具体地，步骤I)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。2周后，追加免疫一次。
[0013]具体地，步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，以聚乙二醇为融合剂，形成融合细胞，将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置CO2中在37°C培养；用间接ELISA法进行筛选，筛选时，先用纤维蛋白原及其降解产物包被，进行负向筛选，去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞；然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于CO2中于37°C培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。
[0014]上述的单克隆抗体可用于制备检测人D- 二聚体的制剂。
[0015]本发明利用已制备 的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以D-二聚体作为检测抗原，进行抗体配对试验，经过优化ELISA反应条件，获得能检测天然D- 二聚体的抗体配对并以此成功建立了检测D- 二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
[0016]本发明通过杂交瘤技术，制备了抗D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10,分泌相应的单克隆抗体，能进行配对和检测天然血清，初步建立了检测D- 二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
[0017]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1表示单克隆抗体1C6的ELISA鉴定，其中上行为包被D-二聚体抗原，中行为包被D-单体，下行为包被纤维蛋白原及其降解产物；每一行中左边第I孔为阴性对照，第2到12孔为抗体倍比稀释，从1:1000、1:2000、…….到1:106。
[0019]图2表示单克隆抗体IDlO的ELISA鉴定，其中上行为包被D-二聚体抗原，中行为包被D-单体，下行为包被纤维蛋白原及其降解产物；每一行中左边第I孔为阴性对照，第2到12孔为抗体倍比稀释，从1:1000、1:2000、…….到1:106。
[0020]图3表示单克隆抗体1C6的免疫印迹鉴定，其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹，右侧为变性电泳后的免疫印迹；每图中，DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原，DD-C为国内公司的D- 二聚体抗原，第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)ο
[0021]图4表示单克隆抗体IDlO的免疫印迹鉴定，其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹，右侧为变性电泳后的免疫印迹；每图中，DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原，DD-C为国内公司的D- 二聚体抗原，第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)。
[0022]图5表示HRP标记抗体的效价检测结果。其中上行为单克隆抗体1C6，下行为单克隆抗体IDlO ;包被抗原为D- 二聚体，孔1、2和3是阴性对照，孔4为标记抗体1:1000稀释，孔 5 为 1:2000，孔 6 为 1:4000，......，孔 12 为 1:256000。
[0023]图6表示D- 二聚体ELISA检测体系的分析特异性鉴定，分别测定D- 二聚体和各种相关抗原，横坐标为抗原浓度，单位为单位为μ g/ml ;纵坐标为450nm处吸光度。
[0024]图7表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线，横坐标为D-二聚体的浓度，单位为μ g/ml ;纵坐标为450nm处吸光度。
[0025]图8表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimerPlus试剂测定结果比较，横坐标为本发明中涉及方法的检测结果，纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果，单位均为ng/mL。
【具体实施方式】
[0026]本发明以纯化的D- 二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术经多次细胞融合，利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化,所得的单克隆抗体进行效价测定，亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌D- 二聚体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10，ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
[0027]本发明建立了 D- 二聚体的ELISA检测体系:应用抗D- 二聚体抗体1C6为捕获抗体，抗D- 二聚体抗体IDlO为检测抗`体，建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法，能够准确检测血清中的天然D- 二聚体，并以此成功建立了检测D- 二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
[0028]材料和来源
实验动物:Balb/C小鼠购自第三军医大学实验动物中心(中国重庆)。
[0029]细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
[0030]D- 二聚体等抗原购自Abcam公司，HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。
[0031 ] 纯化柱和填料购自美国GE公司。
[0032]其余试剂均为国产分析纯试剂。
[0033]
实施例1抗D-二聚体单克隆抗体的制备 1.D-二聚体单克隆抗体的制备
将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100 yg/ml)。2周后，将D-二聚体与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100 μ g/ml)；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死小鼠取出小鼠脾脏,将脾细胞进行细胞融合。
[0034]融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8:1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置于6% CO2中在37°C培养。用间接ELISA法进行筛选。筛选时，先用纤维蛋白原及其降解产物包被，进行负向筛选，去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞；然后用D- 二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于6% CO2中于37°C培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行单克隆抗体的扩大培养。
[0035]采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠，于腹腔内注入液态石蜡0.5 mL，I周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4X IO5个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。
[0036]2.D- 二聚体单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行纯化，具体方案为:配置抗体纯化所需buffer:Binding Buffer(A 液)20 mmol/L 憐酸钠，0.8 mol/L (NH4)2S04,pH 7.5 ；Elution Buffer (B 液):20 mmol /L 憐酸钠，pH 7.5 !Regeneration Buffer (C 液):20 mmol/L 憐酸钠,pH 7.5，并按体积比30 %加入异丙醇；在单抗腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致，0.45U m滤膜过滤等待上样；选用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白纯化仪，A、B液和C液对柱子进行充分洗涤；用A液进行充分平衡后，将准备的样品从A管上样，上样后用A液平衡柱子，去除杂蛋白，再用B液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0,将抗体分装冷冻于_20°C保存；用Regeneration Buffer使填料进行再生，然后用Binding Buffer进行平衡即可。
[0037]3.ELISA鉴定抗D- 二聚体单克隆抗体
将纯化的D- 二聚体抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5 μ g/ml, ELISA条板每孔加入100 μ 1，4°C包被过夜。次日取出板子弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，
1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100 μ I/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳
对照孔。37°〇孵育111，洗板，加入二抗，1:3000 HRP标记山羊抗小鼠IgG，按100μ I/孔加入对应条孔中，37°C孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100 μ I/孔，避光显色lOmin，加入终止液50μ1/孔。在450nm处测定吸光度值。结果如图1和图2所示，单克隆抗体1C6对D- 二聚体效价达到1:50万，对D-单体的效价为1:8000，对纤维蛋白原及其降解产物的效价为O ;单克隆抗体1D10对D- 二聚体效价为1:100万，对D-单体效价为0，对纤维蛋白原及其降解产物的效价为O。
[0038]4.抗D-二聚体单克隆抗体的免疫印迹鉴定
I)将Marker 3 μ 1、D- 二聚体抗原20 μ 1、相关对照抗原20 μ I行SDS-PAGE。
[0039]2)电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10 min。
[0040]3)将0.22 μπι PVDF膜先用无水甲醇处理20 S，再用ddH20洗涤5 min。然后再浸入Transfer Buffer超过5 min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。
[0041]4)转膜:从下至上依次排列:滤纸一PVDF膜一胶一滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18 V恒压电转移1.5 h0
[0042]5)转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddH20清洗两遍，TBST洗5 min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2 h。
[0043]6)弃去封闭液，用I X TBST漂洗膜3次，每次15 min。
[0044]7)加入以1:1000稀释的纯化抗体，4°C孵育过夜。I X TBST漂洗膜3次，每次15min。
[0045]8)加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体，37°C孵育3 h。
[0046]9) IXTBST 洗涤 3 次，每次 15 min。
[0047]10)用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在D-二聚体对应分子量处处均可见抗D-二聚体单克隆抗体结合清晰条带。结果如图3和图4所示。在7%非变性条件下，单克隆抗体1C6和IDlO均能识别并结合两种不同来源的D- 二聚体，不识别D-片段和E-片段，在7%变性条件下，两种单克隆抗体均不识别和结合这四种形式的抗原。。
[0048]实施例2双抗体夹心ELISA法检测D- 二聚体 1.HRP标记抗体
本法是以NaIO 4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下:
I) HRP酶的准备:称取10 mg HRP酶，加2 mL纯水配置为5 mg/ml的HRP液体，按照每mg HRP酶加入34 μ?计算，加340 μ? NaIO4,4°C避光放置，I h后，按照每mg HRP酶加入250 PL的量加入乙二醇250 μ?，避光放置4°C，30 min后转入透析袋中，用I mM醋酸缓冲液(pH 4.0~4.4)透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。
[0049]2)抗体的准备:0.01 M的PBS缓冲液进行4°C透析过夜，并测定蛋白浓度。
[0050]3)标记:抗体与HRP酶按1:1 (质量比)混合，加入I mol/L Na2CO3缓冲液(1:80)，调解反应的pH为9.5，25°C反应2~3 h。
[0051]4)终止:新鲜配制 0.1 mol/L NaH4B (4 mg/mL),按照每 mg HRP 酶加入 47 μ L。4°C放置2 h后，转入透 析袋。用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0~7.2)透析过夜，期间至少换液两次，避光。
[0052]5)HRP标记抗体的效价检测:将纯化的D- 二聚体抗原用包被稀释液稀释至5 μ g/ml，ELISA条板每孔加入100 μ 1，4°C包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板，加入350 μ I/孔的1%BSA进行封闭，37°C，2h。洗板后将HRP标记好的待鉴定单克隆抗体作1:1000，
1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100 μ I/孔加入对应条孔中，另作空白及阴性
对照孔。37°C孵育40min，弃液，洗板，拍干，加入底物液100 μ I/孔，避光显色lOmin，加入终止液50 μ I/孔。在450nm处测定吸光度值。结果如图5所示，结果显示，1-C6和1-D10酶标抗体的效价均> 1:256000，满足应用要求。
[0053]6)分装保存:标记好的抗体用棕色EP管分装，并测定抗体效价。_20°C避光保存。
[0054]2.抗体配对及临床样本的检测
I)标本收集:
从第三军医大学第一附属医院收集临床血浆标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5 ml Ep管中，-80°c保存，并将病人基本信息录入电脑，做好编号。
[0055]2)标本检测:
选取单克隆抗体1C6作为捕获抗体，酶标单克隆抗体IDlO作为检测抗体，D- 二聚体校准品为测定对象，检测方法如下:a.包被酶标板:用包被液将抗体稀释为5 yg/ml，每孔加100 μ I, 4°C包被过夜。b.将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。c.封闭:每孔加封闭液350 μ 1，37°C孵育I h，洗涤3遍，甩干。d.用抗体稀释液将D-二聚体校准品从50 Ug/ml开始倍比稀释，每孔加100 μ 1，第一孔为空白对照，做标准曲线。检测临床标本时，每孔加标本100 yl，37°C孵育I h。e.洗板3遍，甩干。f.将相对应的酶标二抗以1:5000稀释，每孔加入100 yl，37°C孵育30 min。g.洗板5遍，甩干。h.每孔加入100 μ I底物显色液，室温避光显色5 min。1.每孔加入50 μ I终止液，450nm处读取吸光度值，同时制作标准曲线，根据标准曲线确定临床样本中D- 二聚体的含量。
[0056]具体请参照图6、图7和图8。图6显示基于单克隆抗体1C6和IDlO建立的ELISA体系结果表明，新建的ELISA仅对D- 二聚体反应，而对纤维蛋白原、FgDP-X和FgDP-Y没有反应，提示该检测体系具有良好的特异性。图7表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线，横坐标为D-二聚体的浓度，单位为μ g/ml ;纵坐标为450nm处吸光度。提示该检测体系在0-2 μ g/ml范围内线性良好。图8表示D- 二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较,横坐标为本发明中涉及方法`的检测结果，纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果,单位均为ng/mL。提示该检测体系与公认方法检测结果相关良好，具有很好的检测准确度。
[0057]同时请参照表1，其中对D- 二聚体ELISA检测体系测定D- 二聚体与Simens公司的D-dimer Plus试剂测定结果进行了比较，结果表明，对于阴性标本，二者之间的符合率为97%，对于阳性标本，二者之间的符合率为84%，总体符合率为91%。
[0058]表1新建ELISA体系与公认试剂检测结果比较
—I阴性结果I阳性结果I合if
SiemensD-DimerPLUS140112252
1C6/1D1013694230
符合率(％)\97|84丨91
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属【技术领域】
的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保
护范围当视权利要求所界定者为准。
【权利要求】
1.一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2013138。
2.—种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO:C2013139。
3.—种权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
4.一种权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
5.一种用于检测人D- 二聚体的试剂盒，其包含权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体。
6.一种权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含步骤: 1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠； 2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合，利用间接ELISA法进行正向和负向筛选，克隆化筛选出能稳定分泌抗D- 二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤I)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化，乳化完成后，对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，2周后，追加免疫一次。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，以聚乙二醇为融合剂，形成融合细胞，将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中，并置CO2中在37°C培养；用间接.ELISA法进行筛选，筛选时，先用纤维蛋白原及其降解产物包被，进行负向筛选，去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞；然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于CO2中于37°C培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。
10.权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。
【文档编号】C12N5/20GK103468644SQ201310444744
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】赵忠颢, 王晓东, 李金芳 申请人:重庆探生科技有限公司