一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上，对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料，采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10，对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体，可获得高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、反应时间及质粒浓度进行探索，在缩短原生质体分离时间的同时，大大提高了转化效率。用较微量的质粒DNA即可获得外源基因在原生质体内高效的表达，且转化效率可达70%以上。本发明有益的效果：它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。
【专利说明】一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及涉及水稻原生质体的分离的新方法以及质粒转化原生质体的相关应用，主要是一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法。
【背景技术】
[0002]原生质体瞬时表达是细胞功能学研究的重要操作手段。近年来，双子叶植物拟南芥原的生质体被广泛用于胞内运输机制的探索、蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA与蛋白质的相互反应等许多领域。单子叶植物水稻的原生质体的相关报道也越来越多。但由于研究起步较晚，在原生质体分离和转化的方法上还有很多可以改进的地方。在过去很长一段时间内，单子叶植物原生质体是借助植物组织培养技术建立的悬浮细胞培养体系分离而来的，这种方法所需周期较长，且培养过程中容易染菌，并不能做到瞬时、快捷。研究发现，以水稻幼茎，叶和叶鞘等组织为试验材料，也可以分离出优质的原生质体。但幼茎、叶及叶鞘的原生质体形态上还有一定的差别，这些差别并没有完全证实。此外，不管是在拟南芥、水稻还是其他植物的原生质体分离过程中，在获取原生质体的过程中都采用离心的方法收集，容易混有大量的细胞碎片，会干扰后续过程中的转化效率及其他酶促反应。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。[0004]本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，主要是根据密度梯度自沉降的方法可以不使用离心而使大小均一的细胞在合适的浓度梯度上沉淀，以及原生质体自身可以摄取外源大分子物质的原理，酶解水稻幼茎细胞壁获得的原生质体和建立高效的瞬时表达体系，该方法包括如下步骤:
[0005]( I)水稻种子去颖壳，消毒；
[0006](2)消毒种子在1/2MS培养基上培养10-15天，待其长成15_20cm高的幼苗；培养条件:25°C，光照12h，黑暗12h，光照强度:8000Lux ；
[0007](3)取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20-30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL ；
[0008](4)加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下:在室温22_25°C条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤Ih ;然后置于水平摇床上60r/min 摇 4h ；
[0009](5)用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4°C滤液静置30min以上，待溶液分层；
[0010](6)吸取中层IOml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤(100g离心5-10min，弃上清)，2-3次，即获得较为纯净的原生质体；[0011](7)原生质体转化:以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTANl转化进入原生质体:转化体系如下:10ul质粒，IOOul原生质体用MMG溶解，11Ou140%的PEG-Cacl2 ;室温放置5_15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为Iml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入Iml W5悬浮原生质体，于25°C黑暗条件下培养2-24小时。
[0012]所述的消毒方法如下:体积百分比为70%酒精洗30s ;蒸馏水洗一次；体积百分比为50%NaC10摇洗30min ;灭菌蒸懼水洗8_10次。
[0013]所述的酶解液为3%纤维素酶R-1O和0.6%果胶酶R_10、1M蔗糖、pH5.7的0.2MMESUM 二水氯化钙、2M氯化镁配制成的混合液，55°C温育lOmin，使蛋白酶失活，冷却后过滤除菌。
[0014]转化时，原生质体需预先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液悬浮，MMG由4mMMESρΗ5.7，0.4Μ Mannitol, 15mM MgCl2 组成，转化采用的媒介为 PEG，由 40%PEG4000，0.2MMannitol, IOOmM CaCl2 组成。
[0015]本发明的有益效果是:使用本方法简单快速，应用真空抽滤，使细胞产生轻微的质壁分离，加速渗透剂和酶液的渗透，能大大提高酶解效率。在短时期的酶解后，就能获得大量游离细胞。采用密度梯度自沉降法可从水稻的幼茎中分离到高纯度的原生质体细胞，细胞内的叶绿体含量少，大小较为一致，在较高倍的物镜下可清晰的辨别细胞器的结构为后续的转化和其它分子生物学操作提供方便。并通过改变后续转化时的质粒浓度，转化时间和转化条件等参数，建立起一个快速、简便并高效的水稻原生质体瞬时表达系统，为今后水稻基因功能组学研究搭建了一个可 靠的技术平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是采用离心法和密度梯度自沉降法获得的原生质体对比图
[0017]图2是离心和自沉降所获原生质体二乙酸荧光素染色对比图(12x)
[0018]图3是不同浓度质粒转染原生质体的活力对比图1
[0019]图4是不同浓度质粒转染原生质体的活力对比图2 ；
[0020]图5是不同转化条件下所得原生质体活力对比图。
【具体实施方式】
[0021]下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
[0022]实施例中，使用的溶液组成如下:
[0023]TVL 溶液:0.3mol/LSorbitol,50mM CaCl20
[0024]W5 溶液:154mM NaCl, 125mM CaCl2.2H20, 5mM KCl,2mM MES (pH5.7)。
[0025]酶解液:1MSurcose,0.2M MES (pH5.7), IM CaCl2.2H20, 2M KCL, 3%Cellulase,
0.6%Mecerozyme ;酶解液先在55?水浴中温育lOmin,除蛋白酶,然后用滤膜过滤除菌。
[0026]MMG 溶液:4mM MES (ρΗ5.7),0.4M Mannitol, 15mM MgCl20
[0027]PEG 转化液:40%PEG4000，0.2M Mannitol, IOOmM CaCl20
[0028]1/2MS培养基:每升水中含1.1g MS, 0.125g MES, IOg蔗糖以及4g植物凝胶，调pH至5.7。水稻原生质体的分离
[0029]I)取适量颗粒饱满的日本晴种子去颖壳，装入50ml无菌离心管，70%的乙醇洗30s ;无菌水清洗一次；加入足量50%的次氯酸钠,置水平摇床消毒30min后在超净台用灭菌蒸馏水洗8-10次。
[0030]2)种子在1/2MS培养基上培养至12天龄。培养条件:温度25°C，光照12h，黑暗12h，光强:8000Luxo
[0031]3)在超净台上用锋利的手术刀片将植物组织切成0.5mm大小条段，转入装有15mlTVL溶液的小烧杯中静置20-30分钟。[0032]4)加入酶液15ml，摇匀，抽真空Ih ；
[0033]5)置于水平摇床上，25°C黑暗条件下，60rpm，摇4h。
[0034]6)用25um的尼龙膜过滤酶解后的混合液到无菌的50ml离心管中，弃滤洛,在滤液上层缓慢滴加20ml W5溶液，4°C静置30min以上，发现分层现象。
[0035]7)吸取中层的原生质体富集层溶液约IOml左右至50ml离心管，加入等体积的W5溶液，混匀；水平低速离心机100g离心5min，去上清；再加入IOml W5重悬原生质体，100g离心5min，去上清。最后加入2_3mlW5，即可得到较为纯净的原生质体。
[0036][0029]叶、叶鞘及幼茎原生质体分离
[0037]a.培养出的12天龄的水稻“日本晴”幼苗分别取叶、叶鞘及幼茎切成0.5mm大小片段，放入锡箔纸包裹的装有15mlTVL溶液的小烧杯20min ;加入过滤除菌的酶液，抽真空Ih ;放置水平摇床上,60rpm,摇4h。
[0038]b.用25um的尼龙膜将滤液过滤到50ml离心管中，轻轻地挤尽滤液,尽量减少体积损失。用移液枪在滤液上方缓慢滴W5溶液20ml，4°C静置30min以上。
[0039]静置后的结果，由叶和叶鞘分离的原生质体量极少，基本没有分层现象，而由幼茎分离的原生质体富集层相当明显。
[0040]吸出中间层溶液10ml，用W5洗2_3次，得到的原生质体在显微镜下观察，叶及叶鞘分离的原生质体富含叶绿体，且细胞较小。而由幼茎分离的原生质体细胞较大，液泡较为明显，细胞内结构比较清楚，更便于显微观察。
[0041]密度梯度自沉降法和离心法的比较
[0042]I)水稻“日本晴”种子在1/2MS培养基上培养至12天龄。培养条件:温度25°C，光照12h，黑暗12h，光强:
[0043]2)幼茎切成0.5mm大小片段，放入锡箔纸包裹的装有15ml TVL溶液的小烧杯20min ;加入过滤除菌的酶液,抽真空Ih ;放置水平摇床上,60rpm,摇4h。
[0044]3)用25um的尼龙膜将滤液过滤到50ml离心管中，挤尽滤液，尽量减少体积损失。用移液枪在滤液上方缓慢滴W5溶液20ml，4°C静置30min以上。
[0045]4)将中层原生质体吸出10ml，用W5液体洗涤2_3次(加入IOml W5溶液，100g离心lOmin，去上清)，再加入3ml W5，所得悬浮液为密度梯度自沉降法分离的原生质体。
[0046]5)用上述同样的方法培养和酶解水稻组织，并用100g离心IOmin的方法收集原生质体，得到的沉淀即为离心法所分离的原生质体。
[0047]6)分别两种方法所得的原生质体溶液IOOul，用等体积的0.01%FDA (二乙酸荧光素)染色IOmin,加入800ulW5稀释到1ml, 100g离心5min,去上清,再加入适量W5,混匀。用荧光显微镜拍摄白光和绿色荧光下的原生质体并计数，计算发荧光的原生质体与总原生质体数的比值(取三个视野，计算平均值)。
[0048]两种方法所得的原生质体如图1所示，图1结果显示，离心所得的原生质体小，富含叶绿素的原生质体和细胞碎片较多，而密度梯度自沉降所得的原生质体大，纯度高，且细胞内结构清晰易辨认，有利于下游操作过程的显微观察。
[0049]FDA染色结果如图2所示，通过计算原生质体活力，可知离心所得原生质体含有许多失去活力的细胞，整体活力明显低于自沉降法所得。
[0050]计算自沉降法所得的原生质体得率，尽管有一部分留在离心管中没有吸出来，但计数上显示，由此方法分离的原生质体个数仍可达1.68X IO7个/gFw，数量上相当可观，按每次转化用3 X IO5个计，可转化56次。
[0051]水稻原生质体的瞬时转化
[0052]I)原生质体于冰上放置30min, 100g离心5min,去上清；
[0053]2)加入1.5-2mlMMG重悬原生质体。
[0054]3)在2ml圆底离心管中加入质粒DNAlOul。
[0055]4)加入原生质体IOOul，与质粒均匀混合。
[0056]5)加入PEG转化液IIOul，轻拍离心管底部，使液体混合均匀，室温放置5分钟以上。
[0057]6)加入W5至离心管中总体积Iml,终止反应；100g离心5min,去上清。
[0058]7)加入Iml W5重悬原生质体，25°C暗条件培养过夜。
[0059]8)吸取上层清液，留约lOOul，轻拍离心管底，悬起原生质体。
[0060]9)由于原生质体的转化效率受多方面因素的影响，为使原生质体瞬时表达体系的应用更为方便，做了如下调整:
[0061]不同浓度质粒转化水稻原生质体的瞬时表达体系设置不同的质粒浓度，即IOul质粒中分别含有lug、3ug、5ug、7ug、10ug,分别转化原生质体,在突光显微镜下观察,所得图片如图3-4。图3-4结果显示，随着质粒浓度的增大，发绿色荧光的原生质体数量逐渐增多。当质粒浓度在0.7ug/ul时已转化效率已达到70%-75%，能满足下一步的显微观察及其它细胞生物学和分子生物学实验要求。
[0062]转化时给予不同环境条件处理
[0063]加入PEG后，对转化体系做了如下处理:(I)室温放置5min ; (2)室温放置IOmin ；
(3)室温放置15min;(4)冰上放置5min，42°C水浴5min，冰上放置5min ; (5)室温放置5min，42°C水浴5min，室温放置5min。通过计算转化效率，得到了下表结果图5 (1:常温放置5min ；2:常温放置IOmin ；3:常温放置15min ；4:冰上放置5min，42°C热激5min，冰上放置5min ；5:室温放置5min，42°C 5min,室温5min)，室温放置时间在IOmin左右时，转化效率明显高于室温放置5min和15min，可见转化时放置时间过短或太长都对转化效率有消极影响。另外，热激处理结果显示，先经过冰上处理再经过热激处理的转化体系，最终转化效率明显低于只经过热激处理的转化体系。由此推断，在转化过程中，太过剧烈的温度变化会对原生质体造成一定的伤害，但在常温条件下对原生质体进行42°C热激对转化效率的提高有促进作用的。
[0064]最后需要说明的是，除本实施例外，本发明还可以有其它实施方式和变形，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。凡本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变 形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于:该方法包括如下步骤: (1)水稻种子去颖壳，消毒； (2)消毒种子在1/2MS培养基上培养10-15天，待其长成15-20cm高的幼苗；培养条件:25°C。，光照12h，黑暗12h，光照强度:8000Lux ； (3)取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20-30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL ； (4)加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下:在室温22-25°C条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤Ih ;然后置于水平摇床上60r/min 摇 4h ； (5)用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4°C滤液静置30min以上，待溶液分层； (6)吸取中层IOml的原生质体，用10mlff5溶液洗涤，100g离心5-10min，弃上清，2-3次，即获得较为纯净的原生质体； (7)原生质体转化:以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTANl转化进入原生质体:转化体系如下:10ul质粒，IOOul原生质体用MMG溶解，11Ou140%的PEG-Cacl2 ;室温放置5_15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为Iml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入Iml W5悬浮原生质体，于25°C黑暗条件下培养2-24小时。
2.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于:所述的消毒方法如下:体积百分比为70%酒精洗30s ;蒸馏水洗一次；体积百分比为50%NaC10摇洗30min ;灭菌蒸馏水洗8-10次。
3.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于:所述的酶解液为3%纤维素酶R-1O和0.6%果胶酶R-10、IM蔗糖、pH5.7的0.2M MES、IM 二水氯化钙、2M氯化镁配制成的混合液，55°C温育lOmin，使蛋白酶失活，冷却后过滤除菌。
4.根据权利要求1所述的快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于--转化时，原生质体需预先在冰上放置30min，然后加入MMG溶液悬浮，MMG由4mM MES pH5.7，.0.4M Mannitol，15mM MgCl2 组成，转化采用的媒介为 PEG,由 40%PEG4000,0.2M Mannitol，IOOmM CaCl2 组成。
【文档编号】C12N5/04GK103710377SQ201310467412
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】朱英, 段炼, 徐恒, 钱君, 郭小雨 申请人:浙江省农业科学院