一种蜂胶提取物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明通过大量的工艺研究从蜂胶中得到了一种具有抗炎、保肝作用的提取物。通过严谨的活性实验证明该提取物具有对人白细胞弹性蛋白酶具有抑制作用；对四氯化碳致肝损伤具有保护作用。本发明可应用于植物源抗炎、保肝产品的开发。目前我国对于蜂胶的利用较为原始，本发明所述蜂胶提取物作为生产植物源抗炎、保肝产品的原料，具有食用安全、工艺流程简单的优点。所制备的片剂处方和制备方法简单，且质量稳定，有利于推广应用。
【专利说明】一种蜂胶提取物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蜂胶提取物，具体涉及一种由特定方法制备得到的蜂胶提取物及其应用。
【背景技术】
[0002]蜂胶是蜜蜂采集植物的树胶，并混入其上额腺分泌物和蜂蜡经蜜蜂咀嚼调制而成的一种胶状物质。蜂胶的化学组成主要包括黄酮类，萜烯类，芳香族酸及芳香族酸的酯类，酚、醇类，醛、酮类，此外还含有微量的蛋白质和酶。目前蜂胶被证实具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、消炎、抗氧化、抗癌等广泛的药理活性。这些作用的发现直接为研制特种营养保健与药品提供了依据。
[0003]实验证明，蜂胶具有较好的抗炎作用。蜂胶乙醇提取液和蜂胶水提取液可对抗胸膜炎大鼠胸水增多。另外许多实验都证明了蜂胶对于各种肝损伤均有显著的保护作用。
[0004]现有技术公开了一些蜂胶提取物的制备方法，如 申请人:的一个专利ZL200710111189.1公开了一种具有生物活性的水溶性蜂胶提取物和浅色蜂胶提取物。其中公开了先将蜂胶原料粉碎，加10-60%乙醇溶液提取2-4次，每次溶剂的用量不低于四倍量，提取液合并滤过，减压回收乙醇得浓缩液，静置得到沉淀和上清液，沉淀水洗后干燥即可得到固体浅色蜂胶提取物。
[0005]但上述技术方案得到的提取物主要为浅色蜂胶，未能有效的富集抗炎保肝活性成分，不具有很好的抗炎保肝的生物学活性，无法有效应用于以抗炎、保肝为目的的营养保健与药品的研制。
[0006]有鉴于此，特提出本发明。`
【发明内容】
[0007]本实验的目的是提供一种具有抗炎、保肝活性的蜂胶提取物，并进一步提供其制备方法和应用方法。
[0008]为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种蜂胶提取物，其制备步骤为:
[0009](I)取蜂胶粉末加入3~6倍体积40%乙醇进行提取，过滤分离，取残渣；
[0010](2)将残渣加入3~6倍体积70%乙醇，加热进行提取，过滤分离上清，重复提取，合并上清，4°C冰箱过夜，抽滤或者离心，残渣备用，上清经过减压脱醇，静置24h~48h，弃上清，保留沉淀，即得70%醇溶物；
[0011](3)向经过70%乙醇提取后的残渣加入3~6倍体积95%乙醇，加热进行提取，过滤分离上清，残渣重复提取2-4次，合并上清；4°C冰箱过夜，抽滤或者离心，取上清即得95%醇溶物；
[0012](4)将步骤(2)中得到的70%醇溶物和步骤(3)中的95%醇溶物合并，减压浓缩并干燥后即得蜂胶提取物。
[0013]本发明所述的蜂胶粉末可采用现有技术公开的多种已知蜂胶原料，作为优选的技术方案，本发明所述蜂胶粉末含胶量在25~50%，在该含量范围内本发明所述制备方法的提取效果最佳。
[0014]本发明所述的提取物，步骤(1)在提取前还包括蜂胶粉碎筛子筛选的过程，优选过20-120目筛，以便于更好地提取。
[0015]本发明的提取物，所述步骤(1)中，加热提取温度30~35 °C，提取时间4~12小时，重复提取次数1~2次。所述步骤(2)中，加热提取温度30~50°C，提取时间24~72小时，重复提取次数2~4次。所述步骤(3)中，加热提取温度30~45°C，提取时间12~48小时，重复提取次数2~3次。
[0016]虽然现有技术公开了以不同浓度乙醇作为介质对蜂胶进行提取的技术方案，但由于仅采用了常规醇提的技术方案，未对提取介质及提取条件作出优化调整，所得提取物的成分复杂，杂质(无抗炎、保肝活性者)含量大，导致无法有效应用于实际制剂制备过程。同时，提取率和提取规模达不到产业化应用的要求，有效部位(具有抗炎、保肝活性者)提取率低至百分之十左右。为了获得更好地提取效果，并使其能够批量化生产，本发明设计了上述提取条件，分别针对每一提取阶段选择了最佳的提取介质及提取条件，促使活性成分最大程度的溶出及杂质(无抗炎、保肝活性者)的去除。
[0017]更进一步地，本发明对提取方式上也作出了优化限定，本发明可选超声波提取或常温浸提，本发明中则更多采用了控温浸提(30~50°C)，以更好地提取并保护活性成分。步骤(1)到步骤(3 )中均为搅拌提取，步骤(1)中搅拌速度50~lOOrpm，步骤(2 )和(3 )中搅拌速度110~200rpm。在该搅拌速度下，有利于加快物质的溶出，提高提取效率。
[0018]本发明的提取物，其中制备步骤(1)和(3)中，减压浓缩脱去乙醇时的温度为35~45。。。
[0019]本发明的提取物，其中制备步骤(4)中干燥方式为自然干燥、真空干燥或冷冻干燥。
[0020]本发明的提取物，步骤4中减压浓缩温度为40~60°C。
[0021]本发明得到的蜂胶提取物经过40%乙醇的提取分离，可以将蜂胶中亲水组分除去。将70%乙醇提取物经过减压浓缩分为70%醇溶部分和70%水溶部分，目的是将活性成分更大程度富集。70%乙醇提取物和95%乙醇提取物经过4°C静置，目的是除蜂蜡和除杂。提取物富集了相关功能成分，作用效果明显。上述溶剂的选择是发明人在大量试验研究的基础上确定的，能够最大化地保留活性物质，去除蜂胶粉末中无抗炎、保肝活性的杂质。本发明所述的制备方法提取率高，对设备条件要求低，方法简单，易于实施，成本低，适合生产。
[0022]本发明的第二目的在于保护上述蜂胶提取物在制备治疗抗炎、保肝药物中的应用。
[0023]本发明发现所得到的的提取物具有很好抗炎、保肝活性，故而可将其按照常规方法制备成可临床应用或方便服用的各种食品、药品或保健品，如一种抗炎组合物，或一种保肝组合物。
[0024]此外，本发明进一步要求保护含有上述蜂胶提取物的药物组合物。所述组合物包括但并不限于片剂、胶囊剂、注射剂等。本发明优选为片剂或者胶囊剂。
[0025]目前现有技术未见关于蜂胶提取物成熟制剂的相关报道，因考虑提取物的组成复杂，保存过程中容易出现质量问题，并且具体的溶出释放也不尽人意。发明人长期致力于提取物制剂的研究，并最终得到一种理想的片剂，通过对其处方提出特异性调整，使得到的片剂的稳定性和溶出都能达到理想水平，真正实现了其可产业及推广式的应用。
[0026]本发明所述含有蜂胶提取物的片剂，由包括如下重量份的原料制备而成:蜂胶提取物80-120份、糊精2-6份、交联聚乙烯吡咯烷酮5-10份、硬脂酸镁0.2-0.6份。
[0027]其中，优选由包括如下重量份的原料制备而成:蜂胶提取物100份、糊精4份、交联聚乙烯吡咯烷酮8份、硬脂酸镁0.4份。
[0028]本发明所述的片剂可采用现有技术公开的习用方法制备而成，本发明对此不作特别限定，本领域技术人员可以理解，对于片剂而言，核心的因素即处方，在处方明确的基础上，选择适宜的制备方法来制备片剂是本领域的常规技术手段，对片剂质量的影响可以忽略。 [0029]为了提高活性成分的稳定性及溶出速率，中药提取物制备片剂的制备通常需要加入大量的赋形剂与崩解剂及粘合剂等，但上述方法容易导致片剂的服用量增加，导致片剂的大型化，成本高，且因辅料的用量过多容易引发潜在的不良反应等问题。此外，中药提取物不同于西药的活性成分，辅料的选择对提取物中活性成分群也存在相互影响的作用关系，因此，在中药提取物的制备过程中，处方的选择直接决定片剂的质量。
[0030]本发明所述片剂通过特异性选择了糊精+交联聚乙烯吡咯烷酮的配合使用，结合硬脂酸钠，能够确保片剂具有理想的稳定性和溶出度。经试验证明，以本发明所述的简单片剂处方，采用现有技术已知的常用制备方法，经检测，所得片剂的硬度大于21daN，崩解时间为 12-18min，在 5min、10min、15min、30min 及 45min 的溶出率分别为 30-40%、60_70%、75-85%、92-96%、94-99%。由此可知本发明得到了崩解时间段且溶出性良好的片剂。
[0031]本发明所述的胶囊剂可将蜂胶提取物粉末直接灌装胶囊壳即可得到，本发明对此不作特别限定。
[0032]采用上述技术方案，本发明通过大量的工艺研究从蜂胶中得到了一种具有抗炎、保肝作用的提取物。通过严谨的活性实验证明该提取物对人白细胞弹性蛋白酶具有抑制作用；对四氯化碳致肝损伤具有保护作用。本发明可应用于植物源抗炎、保肝产品的开发。目前我国对于蜂胶的利用较为原始，本发明所述蜂胶提取物作为生产植物源抗炎、保肝产品的原料，具有食用安全、工艺流程简单的优点。所制备的片剂处方和制备方法简单，且质量稳定，有利于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为蜂胶提取物对四氯化碳致肝细胞SOD含量影响的结果示意图；
[0034]图2为蜂胶提取物对四氯化碳致肝细胞MDA含量影响的结果示意图；
[0035]图3为蜂胶提取物对四氯化碳致肝细胞LDH含量影响的结果示意图；
[0036]图4为蜂胶提取物对四氯化碳致肝细胞CYP2E1水平影响的结果示意图；
[0037]图5为蜂胶提取物对四氯化碳致肝细胞Caspase-3蛋白水平影响的结果示意图。
【具体实施方式】
[0038]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。[0039]实施例1
[0040]一种蜂胶提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤:
[0041]1、称取粉碎后过120目筛的蜂胶粉(含胶量5090401.3g，置于锥形瓶中，按体积比为1:6加入40%乙醇,30°C下，90rpm的转速下提取8h,按体积比为1:4加入40%乙醇,相同条件下提取12h，提取液合并过滤，减压浓缩作为试验例中40%提取物备用。
[0042]2、取步骤I所得残渣，按体积比为1:6加入70%乙醇，30°C下，ISOrpm的转速下提取I天，按体积比为1:4加入70%乙醇，相同条件下提取2天，体积比为1:3加入70%乙醇，相同条件下提取3天，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤。将滤液减压回收乙醇至完全无醇，静置2天，分离沉淀和上清，沉淀水洗后干燥，即为70%醇溶物；水洗液和上清合并，干燥后即为70%乙醇水溶部分，作为试验例中70%水提物备用。
[0043]3.取步骤2所得70%醇溶物，按体积比为1:6加入95%乙醇，30°C下，150rpmn的转速下提取12h，按体积比为1:4加入95%乙醇，相同条件下提取24h，体积比为1:3加入95%醇，相同条件下提取48h，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤。即得95%醇溶物，将其与70%醇溶物合并，减压干燥即得所述蜂胶提取物165.5g，提取得率为41.24% ;并将各提取物置于_20°C保存备用。
[0044]实施例2
[0045]一种蜂胶提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤:
[0046]1、称取粉碎后过80目筛的蜂胶粉(含胶量50%) 100g，置于锥形瓶中，按体积比为1:4加入40%乙醇，35°C下，IOOrpm的转速下提取12h,按体积比为1:3加入40%乙醇,相同条件下提取4h，提取液合并过滤，减压浓缩作为试验例中40%提取物备用。
[0047]2、取步骤I所得残渣，按体积比为1:6加入70%乙醇，40°C下，200rpm的转速下提取2天，按体积比为1:5加入70%乙醇，相同条件下提取I天，体积比为1:3加入70%乙醇，相同条件下提取I天，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤。将滤液减压回收乙醇至完全无醇，静置2天，分离沉淀和上清，沉淀水洗后干燥，即为70%醇溶物；
[0048]3.取步骤2所得70%醇溶物，按体积比为1:4加入95%乙醇，45°C下，I IOrpmn的转速下提取24h，按体积比为1:3加入95%乙醇，相同条件下提取24h，体积比为1:3加入95%乙醇，相同条件下提取48h，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤，得95%醇溶物，将其与70%醇溶物合并，减压干燥即得所述蜂胶提取物40.89g，提取得率为40.89%。
[0049]实施例3
[0050]一种蜂胶提取物的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤:
[0051]1、称取粉碎后过80目筛的蜂胶粉(含胶量50%) 500g，置于锥形瓶中，按体积比为1:3加入40%乙醇,35?下，60rpm的转速下提取12h,按体积比为1:4加入40%乙醇,相同条件下提取6h，提取液合并过滤，减压浓缩作为试验例中40%提取物备用。
[0052]2、取步骤I所得残渣，按体积比为1:6加入70%乙醇，40°C下，ISOrpm的转速下提取2天，按体积比为1:5加入70%乙醇，相同条件下提取I天，体积比为1:3加入70%乙醇，相同条件下提取I天，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤。将滤液减压回收乙醇至完全无醇，静置2天，分离沉淀和上清，沉淀水洗后干燥，即为70%醇溶物；
[0053]3.取步骤2所得70%醇溶物， 按体积比为1:6加入95%乙醇，45°C下，150rpmn的转速下提取24h，按体积比为1:3加入95%乙醇，相同条件下提取24h，体积比为1:4加入95%乙醇，相同条件下提取24h，合并提取液，4°C静置一夜，然后进行抽滤，得95%醇溶物，将其与70%醇溶物合并，减压干燥即得所述蜂胶提取物202g，提取得率为40.4%。
[0054]实施例4蜂胶提取物片剂
[0055]处方:蜂胶提取物1000g、糊精40g、交联聚乙烯吡咯烷酮80g、硬脂酸镁4g。
[0056]制备方法:将蜂胶提取物与糊精、交联聚乙烯吡咯烷酮混合，视具体情况酌情加入少量75%乙醇制粒，60°C干燥；加入硬脂酸镁，混合，压片即得。经检测，本实施例所得片剂的硬度为24daN,崩解时间为12min,在5min、lOmin、15min、30min及45min的溶出率分别为40%、70%、85%、96%、99%。
[0057]实施例5蜂胶提取物片剂
[0058]处方:蜂胶提取物800g、糊精20g、交联聚乙烯吡咯烷酮50g、硬脂酸镁2g。
[0059]制备方法:将蜂胶提取物与糊精、交联聚乙烯吡咯烷酮混合，视具体情况酌情加入少量75%乙醇制粒，60°C干燥；加入硬脂酸镁，混合，压片即得。经检测，本实施例所得片剂的硬度为21daN,崩解时间为14min,在5min、lOmin、15min、30min及45min的溶出率分别为30%、60%、75%、92%、94%。
[0060]实施例6蜂胶提取物片剂
[0061]处方:蜂胶提取物1200g、糊精60g、交联聚乙烯吡咯烷酮100g、硬脂酸镁6g。
[0062]制备方法:将蜂胶提取物与糊精、交联聚乙烯吡咯烷酮混合，视具体情况酌情加入少量75%乙醇制粒，60°C干燥；加入硬脂酸`镁，混合，压片即得。经检测，本实施例所得片剂的硬度为25daN,崩解时间为18min,在5min、lOmin、15min、30min及45min的溶出率分别为 35%、63%、78%、93%、96%。
[0063]为了证明上述提取物的抗炎保肝的效果，发明人使用上述实施例1中提供的方法制备得到的蜂胶提取物(以下也可称为活性提取物)进行了药效学实验，研究结果如下:
[0064]—、蜂胶提取物抗炎实验-人弹性蛋白酶(HLE)抑制实验
[0065]在微量进样管中(250 μ L)先后加入PBS缓冲液30 μ L、HLE酶液50 μ L和样品液2(^1^，371:平衡101^11。再加入底物溶液50yL。样品和空白都重复三次。
[0066]37 0C反应120min后加入20%的醋酸溶液50 μ L终止反应，最后将各反应液在405nm波长下进行HPLC分析，测定PNA生成量；空白组以DMSO代替样品液。反应体积150 μ L0液相条件:色谱柱:C18 (VP-0DS, 150mmX 4.6mm, 5 μ m);流动相:甲醇和水；梯度洗脱条件:甲醇体积分数:0min~IOmin为25%, IOmin~15min为25%~90%, 15min~20min为90%~25%，20min~25min为25% ;流速:lmL/min ;检测波长:405nm ;柱温:40°C;进样体积:40 μ L0
[0067]表1蜂胶活性提取物对HLE的影响
[0068]
【权利要求】
1.一种蜂胶提取物，其特征在于，采用如下方法制备而成: (1)取蜂胶粉末加入3~6倍体积40%乙醇进行提取，过滤分离，取残渣； (2)将残渣加入3~6倍体积70%乙醇，加热进行提取，过滤分离上清，重复提取，合并上清，4°C冰箱过夜，抽滤或者离心，残渣备用，上清经过减压脱醇，静置24h~48h，弃上清，保留沉淀，即得70%醇溶物； (3)向经过70%乙醇提取后的残渣加入3~6倍体积95%乙醇，加热进行提取，过滤分离上清，残渣重 复提取2-4次，合并上清；4°C冰箱过夜，抽滤或者离心，取上清即得95%醇溶物； (4)将步骤(2)中得到的70%醇溶物和步骤(3)中的95%醇溶物合并，减压浓缩并干燥后即得蜂胶提取物。
2.如权利要求1所述的蜂胶提取物，其特征在于，所述蜂胶粉末含胶量在25~50%。
3.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述步骤(1)中，加热提取温度30~35°C，提取时间4~12小时，重复提取次数I~2次。
4.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述步骤(2)中，加热提取温度30~50°C，提取时间24~72小时，重复提取次数2~4次。
5.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述步骤(3)中，加热提取温度30~45°C，提取时间12~48小时，重复提取次数2~3次。
6.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述步骤(1)到步骤(3)中均为搅拌提取，步骤(1)中搅拌速度50~lOOrpm，步骤(2)和(3)中搅拌速度110~200rpm。
7.权利要求1-6任一项所述蜂胶提取物在制备治疗抗炎、保肝药物中的应用。
8.含有权利要求1-6任一项所述蜂胶提取物的药物组合物。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于:所述药物组合物为片剂，由包括如下重量份的原料制备而成:蜂胶提取物80-120份、糊精2-6份、交联聚乙烯吡咯烷酮5-10份、硬脂酸镁0.2-0.6份。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于:所述药物组合物为片剂，由包括如下重量份的原料制备而成:蜂胶提取物100份、糊精4份、交联聚乙烯吡咯烷酮8份、硬脂酸镁0.4份。
【文档编号】A23L1/076GK103655628SQ201310473370
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】孙丽萍, 徐响, 杜夏, 沈新锋 申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所