一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用。本发明以来源于Penicillium?sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶为母本，采用分子生物学技术对酸性多聚半乳糖醛酸酶序列进行区域替换后表达。在此改造条件下，酸性多聚半乳糖醛酸酶比活性比野生型（突变前）的比活性提高11.1倍；催化效率比野生型（突变前）提高33.5倍，并且最适反应pH值不变。利用此策略可以大大提高多聚半乳糖醛酸酶的催化效率，为其在食品、果蔬加工等工业生产领域提供了基础。此策略对多聚半乳糖醛酸酶及其它酶的催化效率提高具有重要的指导意义。
【专利说明】一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]果胶是一类带负电荷的高分子多糖，由不同酯化度的D-(+)_-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链，分子量介于25~360kDa之间(Jayani et al.，2005)。它广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组织中，是果蔬植物细胞中胶层(胞间层)的主要成分。
[0003]内切多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)属于糖苷水解酶第28家族(GH28)，作用于果胶酸时能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1，4-糖苷键，产生聚合度为10~14的寡聚半乳糖醛酸。它是一种降解果胶的重要工业用酶，主要应用在食品工业中的果蔬汁生产加工领域。果蔬汁的混浊和粘度大等问题主要是由果胶质引起的，在果蔬汁的提取和澄清过程通过酸性果胶酶处理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度(Nakkeeran etal., 2011;Rehman et al.，2013)。
[0004]我国果蔬汁生产规模逐年扩大，目前在商品化的果胶酶主要有黑曲霉等真菌来源的复合果胶酶酶系，也有单一的果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶酶种。从质量上看，现有果胶酶还普遍存在酶活力不高，稳定性较差的问题。高比活、高催化效率的多聚半乳糖醛酸酶工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。诱变分为自然突变和人工诱变，自然突变成功的几率非常小，人工诱变的工作量较大且有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质难以控制。筛选的盲目 性较大，不容易获得目的菌株。酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提高比活力和催化效率的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因。
[0007]本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0008]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]本发明以来源于Penicillium sp.的酸性多聚半乳糖醒酸酶为母本,采用分子生物学技术对酸性多聚半乳糖醛酸酶序列进行区域替换后表达。
[0010]根据本发明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，是多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop区域替换后得到的突变体，即多聚半乳糖醛酸酶的loop区域氨基酸序列由“RNGDKGSL” 突变为 “SAGDSQG”
[0011]所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNSAGDSQGGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC
[0013]所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0014]TCTCCAGCTGCCGAACCGGCTGAAGGGAACAGACTCATCCCTCGTGGATCTGCTTGCACCTATTCAGGAGTCAATGGTGCAGCTGCAGCGATAGCCGGAAAGGCAGGTTGCTCCAGTATTACTCTCAATAACGTTGCAGTGCCTGCCGGGACTACGCTGGATTTGACTGGTCTGGCCGCGGGTACCAAGGTGATATTTGAGGGAACCACTACTTTCGGCCATAAGCAGTGGGTGGGCCCTCTGATCTCCATCTCTGGGACCAACATCGCAGTTTCTGGGGCTGCCGGTCACGTCATTGATGGCCAAGGTGCCCGCTGGTGGGATGGAAAGGGTTCCAACACCAAGACCAATATCAAACCTAAGTTCTTCCTCGCCCACAATCTCAAGGGAGCCTCCACTATTACGGGGTTGAACATCAAGGATACTCCCGTTCAGGTCTTCAGCATCGATAGCTCGTCGGGTCTGACGATCAGTGGTGTCACAATTGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGTCACAACACCGACGGGTTCGATATCGGCGACAGTGATCACATTACCATCACTGGTGCTACAGTTTATAACCAAGACGACTGCCTGGCCATCAATTCTGGGACGAACATTATTTTCTCCGGCGGTTACTGCTCTGGTGGGCACGGATTGTCTATCGGCTCAGTCGGTGGCCGTTCCAATAATGTGGTAGACACCGTCCATATCAGCAGCACCCAGGTCGTCAACTCTCAGAATGGTGTCCGTGTCAAAGCTGTCGCTGGCGCCACCGGTAGTATCAAAGGCGTGACTTACCAGGATATTACCCTCTCCGGCATTACGAGCCAGGGAGTCACCATCCGCCAAGACTACACCAATTCTGGCTACACTGGAAACCCCACGACCCAGGTTCCAATCACTGGACTCACCTTGAATAATGTGCACGGCACGGTCACATCCAGTGGCACCGATATCACCGTCGAGTGTGGAAGTGCTGCCAGTTGTTCAGGCTGGACTTGGACTAAAGTTGCAGTCAGTGGCGGCAAGGCGGATTTGTGCAAGAATGCACCTGCCAACACTTGC
[0015]本发明还是提供一种制备高催化效率多聚半乳糖醛酸酶的方法:
[0016]I)采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因序列；
[0017]2)将催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9r上，重组载体命名pPIC9r-PG63X ；
[0018]3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GSl 15，诱导表达，获得突变株，优选为GSl 15/PG63X。
[0019]本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-PG63X。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaB I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG63X。
[0020]本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/PG63X。
[0021]本发明还提供了上述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的应用，例如在果蔬汁工业中的应用。
[0022]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品工业中应用新的多聚半乳糖醛酸酶。本发明的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体最适PH为3.5，与野生型的一致，但是比活力比野生型提高11.1倍；催化效率比野生型提高33.5倍。最适pH值都与苹果汁天然pH值3.5—致且在低温范围内都能保持稳定的活性，单酶应用试验结果表明它性质优良，与一定量的果胶裂解酶协同效果能达到商业复合酶的水平。这样一种在酸性PH环境和中低温范围内保持稳定并具有高酶活的多聚半乳糖醛酸酶被认为是果蔬汁生产行业中性质优良的工业用酶，有着非常广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:在毕赤酵母中表达的重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker ；1:纯化的酶液。
[0024]图2:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体与野生型的最适pH。
[0025]图3:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体与野生型的最适温度。
[0026]图4:高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体与野生型的动力学曲线。
【具体实施方式】
[0027]试验材料和试剂
[0028]1、菌株及载体:表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实
验室保存。
[0029]2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0030]3、培养基:
[0031](I)LB培养基:0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，l%NaCl，ρΗ7.0
[0032]⑵YPD培养基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖
[0033](3)MD 固体培养基:2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34%ΥΝΒ, 0.00004%Biotin
[0034](4)MM 固体培养基:1.5% 琼脂糖，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 0.5% 甲醇
[0035](5) BMGY培养基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油(V/V)，1.34%YNB，0.00004%Biotin
[0036](6)BMMY培养基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 0.5% 甲醇(V/V)
[0037]实施例1高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因PG63X的克隆
[0038]本发明以来源于PeniciIIium sp.的酸性多聚半乳糖醛酸酶(其氨基酸序列如SEQID N0.3)为母本，采用分子生物学技术对酸性多聚半乳糖醛酸酶序列进行区域替换后表达。
[0039]SEQ ID N0.3 如下所示:
[0040]SPAAEPAEGNRLIPRGSACTYSGVNGAAAAIAGKAGCSSITLNNVAVPAGTTLDLTGLAAGTKVIFEGTTTFGHKQWVGPLISISGTNIAVSGAAGHVIDGQGARWWDGKGSNTKTNIKPKFFLAHNLKGASTITGLNIKDTPVQVFSIDSSSGLTISGVTIDNRNGDKGSLGHNTDGFDIGDSDHITITGATVYNQDDCLAINSGTNIIFSGGYCSGGHGLSIGSVGGRSNNVVDTVHISSTQVVNSQNGVRVKAVAGATGSIKGVTYQDITLSGITSQGVTIRQDYTNSGYTGNPTTQVPITGLTLNNVHGTVTSSGTDITVECGSAASCSGWTWTKVAVSGGKADLCKNAPANTC
[0041]以Penicillium sp.基因组DNA为模板，在多聚半乳糖醛酸酶的催化活性通道loop区域处设计区域替换引物，采用over-lap PCR的方法扩增高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体编码基因PG63X。
[0042]表1.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63X特异性引物
[0043]
【权利要求】
1.一种高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体，其特征在于，所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体。
3.根据权利要求2所述的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.包含权利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体pPIC9r-PG63X。
6.包含权利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株。
7.包含权利要求2所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株GSl15/PG63X。
8.一种制备高催化效率多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步骤: 1)用权利要求4所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达； 3)回收并纯化所表达的高催化效率多聚半乳糖醛酸酶。
9.权利要求1所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体的应用。
【文档编号】C12N1/19GK103525788SQ201310520015
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】姚斌, 孟昆, 涂涛, 罗会颖, 石鹏君, 黄火清, 王亚茹, 柏映国, 杨培龙 申请人:中国农业科学院饲料研究所