一种旱稻抗旱基因、功能标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种旱稻抗旱基因、功能标记及应用，所述的旱稻抗旱基因OsbHLH120属于bHLH类转录因子，位于水稻第9染色体RM24271和RM566之间；该旱稻抗旱基因OsbHLH120与水稻正常的序列相比在编码区缺失了15个碱基，所述缺失碱基位于基因转录起始密码子下游第628-642bp。同时，本发明根据该转录因子水旱稻序列差别特点设计旱稻特异基因功能标记，通过该功能标记可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的旱稻资源，并将这些旱稻资源用于抗旱型水稻育种，以及利用该功能标记进行标记辅助选择，更快速、准确进行抗旱型水稻品种的选育。
【专利说明】一种旱稻抗旱基因、功能标记及应用【技术领域】
[0001]本发明涉及一种旱稻抗旱基因，同时还涉及抗旱基因的功能标记及应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]旱稻，又称陆稻，亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)的旱作生态类型，适于多种类型旱地种植。由于其具有耐旱性强、耐瘠性好、适应性广等特点，是水稻抗旱性改良育种的宝贵种质资源。随着水资源的日益短缺，发掘和利用旱稻优异基因，培育抗旱性强的水稻品种也显得越来越重要。[0003]转录因子作为反式作用因子可激活或抑制基因的转录，精细调控下游功能基因表达，实现对各种逆境的应答。多种转录因子组成的网络系统在植物的非生物逆境的响应和调控中起着非常重要的作用；已有报道SNACl、0sSKIPa、DST等转录因子可以增强水稻抗旱能力。近年来有研究表明bHLH家族转录因子也参与水稻胁迫响应过程，bHLH家族结构域的基序包含了约60个氨基酸，由一个碱性氨基酸区(basic region)和一个螺旋.环.螺旋(HLH region)区组成，碱性区约含15个氨基酸，其中含有较多的碱性氨基酸，这个区域的活性主要与转录因子与DNA特定序列的结合有关，螺旋.环.螺旋区的主要作用是与其他蛋白结合形成二聚体，协同行使功能。水稻中bHLH家族含有至少165个成员，其中0sbHLH148与OsJAZ蛋白互作参与茉莉酸信号途径调节水稻耐旱性，高表达0sbHLH148能够引起水稻植株对干旱胁迫的耐性；0rbHLH001也是一种bHLH类转录因子，在盐胁迫下能够与OsAKTl启动子区域的E-box特异结合从而诱导AKTl的表达升高，调节并维持离子平衡。
[0004]L0C_0s09g28210 (0sbHLH120)属于 bHLH 转录因子家族，位于第 9 染色体 RM24271与RM566之间，编码区无内含子。有研究表明，该基因能够被干旱诱导表达。3叶I心期进行20%PEG6000胁迫处理，通过水稻Affymetrix芯片分析显示，PEG胁迫引起耐旱品种湘丰早119根系中0sbHLH120转录因子表达水平升高，上调2.2倍。水稻日本晴在5叶期进行20%PEG6000胁迫处理，荧光定量PCR分析发现胁迫处理诱导叶片中该基因表达上调，并且在处理后8h表达量达到最大；同时水稻叶片全基因组表达谱芯片结果分析也证明了苗期干旱胁迫会导致0sbHLH120表达量上调，上调倍数达3.79，这表明该转录因子与抗旱性的关系。
[0005]功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的。一旦遗传效应被定位在特定的功能性基序上，基于这种相关性发展的功能标记则不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无。在应用上，功能标记能够避免由于重组交换而产生的选择错误，在群体的目标基因检测时更加有效；由于来源于基因内部，直接反映目标性状的表现，可以准确的检测、跟踪目标基因，且其遗传效应值具有普适性，且可靠性高，对人工育种群体和自然群体均有效，在利用回交转育抗旱、高产等性状的转移时，功能标记的应用可以更好的避免连锁累赘，所以功能标记的开发有助于推动育种中的分子标记辅助选择的应用和关联分析中基于候选基因策略的研究，而且有利于在种质资源中发掘有利基因。旱稻特异转录因子0sbHLH120功能标记的开发，将推动旱稻种质资源的挖掘与研究，有助于在旱稻内充分挖掘该位点的各种等位基因，并且结合抗旱表型分析可得到等位基因中的优势抗旱等位基因及相应的抗旱种质材料，为抗旱型水稻品种杂交育种中亲本的选择，抗旱性状的转育奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种旱稻抗旱基因。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种旱稻抗旱基因，所述的旱稻抗旱基因0sbHLH120属于bHLH类转录因子，位于水稻第9染色体RM24271和RM566之间；该旱稻抗旱基因0sbHLH120与水稻正常的序列相比在编码区缺失了 15个碱基，所述缺失碱基位于基因转录起始密码子下游第628-642bp。
[0008]所述缺失的15个碱基如SEQ ID N0.1所示。
[0009]本发明的目的还在于提供一种根据旱稻抗旱基因特异序列设计的抗旱基因功能标记 InDel-bHLH120。
[0010]本发明所采用的技术方案还在于提供一种根据水稻抗旱基因特异序列设计的抗旱基因功能标记InDel-bHLH120，引物序列如下:
[0011]正向引物序列:5'-GGCCATCCACTACGTCAAGT-3'
[0012]反向引物序列:5'-GGGAAACGATTGTCTCATCACC-3'。
[0013]该抗旱基因功能标记在水稻中的理论扩增片段为201bp，在旱稻中的理论扩增片段为186bp。·
[0014]本发明的目的还在于提供一种旱稻抗旱基因在抗旱水稻新品种的分子标记辅助选择育种方面的应用。
[0015]本发明所采用的技术方案还在于提供一种旱稻抗旱基因在抗旱水稻新品种的分子标记辅助育种选择方面的应用。
[0016]本发明的旱稻抗旱基因0sbHLH120是位于水稻第9染色体RM24271和RM566之间的bHLH转录因子，与水稻序列相比，在位于基因转录起始密码子下游第628-642bp，缺失了15个碱基。同时，本发明根据该转录因子水旱稻序列差别特点设计旱稻特异基因功能标记，通过该功能标记可以有目的的选择含有该基因特征碱基序列的旱稻资源，并将这些旱稻资源用于抗旱型水稻育种，以及应用该功能标记进行分子标记辅助选择育种，以更快速、准确进行抗旱型水稻品种的选育。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为0sbHLH120 (3-2)对4个代表性水、旱稻代表性品种扩增产物的部分测序结果;
[0018]图2为InDel_bHLH120对34个水、旱稻材料的检测结果；
[0019]1-21为水稻品种，依次为:日本晴、越富、新稻18、郑稻18、新丰2号、方欣I号、方欣4号、镇稻88、郑稻4号、9311、桂朝2号、特青、宜1577、I1-32B、CBB23、中国香稻、培矮64S、矮脚南特、二九南I号、珍汕97B、竹珍B ；
[0020]22-34为旱稻品种，依次为:IRAT109、巴西陆稻、毫格劳、丹东陆稻、台东陆稻、旱稻277、旱稻297、郑旱2号、秦爱、红旱稻、白毛稻、抚宁紫皮、天津旱稻；
[0021]图3为InDel-bHLH120对(水稻越富/旱稻IRAT109导入系IL392)F2群体的检测
结果;
[0022]M为DNA Marker，Pl为水稻品种越富，P2为旱稻IRAT109，F1为越富和IRAT109的杂合基因型，其他条带都为F2群体的个体样品。
【具体实施方式】
[0023]实施例1旱稻抗旱基因及其特异序列的获得
[0024]1、实验材料[0025]水稻品种:日本晴、越富、新稻18、郑稻18、新丰2号、方欣I号、方欣4号、镇稻88、郑稻4号、9311、桂朝2号、特青、公居73。
[0026]旱稻品种:IRAT109、巴西陆稻、晕格劳、丹东陆稻、台东陆稻、旱稻277、旱稻297、郑旱2号、秦爱、郑旱6号、郑旱9号。
[0027]2、DNA 提取
[0028]于水稻苗期取叶片，采用SDS法提取DNA，具体步骤如下:
[0029]取新鲜叶片于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中；加入600 μ L SDS提取液(65°C预热)，65°C水浴30min，每隔5min颠倒混匀数次；然后加入400 μ L氯仿:异戍醇(24:1),轻柔混摇IOmin, 12000g离心IOmin ;再将上清液转移至另一 1.5mL无菌离心管中，加入400 μ L氯仿:异戍醇(24:1),轻柔混摇IOmin, 12000g离心IOmin ;将上清液转移至另一 1.5mL无菌离心管中，加入等体积预冷(_20°C )的异丙醇，混匀后于_20°C静置30min ；12000g离心IOmin后弃上清，用70%乙醇漂洗沉淀2次，无水乙醇漂洗I次，离心后除去残余乙醇，晾干；最后加入100 μ L TE缓冲液溶解DNA，贮存于_20°C备用。
[0030]3、PCR测序及测序分析
[0031]以水稻品种日本晴中的0sbHLH120序列(Genbank登录号:ΝΜ_001069892.1)为模板，设计引物，扩增各水旱稻品种中的0sbHLH120的DNA片段，引物由软件Primer5.0设计，序列如下:
[0032]0sbHLH120(3-2)F:5/ -CGTGCACCAGCTGGACTT-3'，
[0033]0sbHLH120(3-2)R:5/ -AGGTACGGGAAACGTACTGC-3'；
[0034]引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用灭菌ddH20稀释到ΙΟμπιοΙ/L，-20°C保存备用。
[0035]PCR 反应体系为 20.0 μ L，包括 10 X Taq Buffer2.0 μ L、DNA1.5 μ LUO μ mol/L引物(0sbHLH120(3-2)F/R)各 1.0 μ L、10mmol/L dNTP0.5 μ L 和 2.5U/uL TaqDNA 聚合酶
0.2μ L、ddH2013.8μ L。
[0036]PCR 扩增程序为:预变性 94°C 4min ;变性 94°C 30s，退火 55°C 30s,延伸 72°C 30s，35个循环；延伸72°C 10min，4°C保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，DNA纯化试剂盒纯化后由华大基因科技服务有限公司测序。
[0037]通过BioEdit软件进行序列比对分析(图1)，发现旱稻IRAT109、巴西陆稻、毫格劳、丹东陆稻、台东陆稻、旱稻277、旱稻297、郑旱2号、秦爱9个旱稻均在距基因转录起始密码子下游第628-642bp缺失15个碱基，而水稻日本晴、越富、镇稻88、9311、新稻18、郑稻
18、新丰2号、方欣I号、方欣4号、郑稻4号、桂朝2号、特青、公居73却不存在该碱基片段的缺失，郑旱6号、郑旱9号虽然也是旱稻，但却与水稻序列相同，不存在上述的缺失片段。其原因是这两个旱稻品种都是水稻和旱稻杂交选育而成，在水稻与旱稻的杂交组配选择过程中，该基因片段被替换成水稻的基因型。所以在该基因位点两个旱稻品种出现与水稻相同的碱基序列。由此可得知，含有该缺失序列的OsbHLH120为典型旱稻所特有的，与栽培稻的抗旱性有直接的关系。
[0038]实施例2抗旱基因功能标记InDel-bHLH120及其对水旱稻资源的基因型分析
[0039]1、设计引物
[0040]选取旱稻0sbHLH120基因中缺失区段两侧的序列，根据其缺失位置两侧300-500bp范围内的碱基序列信息，利用软件Primer5.0设计引物，序列为
[0041]InDel-bHLH120F:5/ -GGCCATCCACTACGTCAAGT-3' (SEQ ID N0.2)，
[0042]InDel-bHLH120R:5/ -GGGAAACGATTGTCTCATCACC-3' (SEQ ID N0.3)；
[0043]引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用灭菌ddH20稀释到IOymol/L，_20°C保存备用。
[0044]2、实验材料及其抗旱性分析
[0045]水稻:日本晴、越富、新稻18、郑稻18、新丰2号、方欣I号、方欣4号、镇稻88、郑稻4号、9311、桂朝2号、特青、宜1577、II _32B、CBB23、中国香稻、培矮64S、矮脚南特、二九南I号、珍汕97B、竹珍B。·
[0046]旱稻:IRAT109、巴西陆稻、毫格劳、丹东陆稻、台东陆稻、旱稻277、旱稻297、郑旱2号、秦爱、红旱稻、白毛稻、抚宁紫皮、天津旱稻。
[0047]材料的抗旱性鉴定试验种植在河南农业大学科教园区抗旱大棚内，设干旱处理和正常水分处理两种栽培方式。正常水分处理在全生育期保水10cm，按水田常规管理模式进行。干旱处理人工控制降雨。材料于6月5日旱田直播，10月9号收获。单粒点播，试验采用随机区组设计，2次重复，每重复种植3行，行长1.5m,行距0.25m,株距0.08m。播种前水、旱田施基肥纯N150kg/ha，P205150kg/ha和K20150kg/ha。分蘖期旱田追施尿素300kg/ha。旱棚控制降雨后，旱田植株在出苗至分蘖前期进行重度干旱胁迫，开花后进行轻度水分胁迫。旱稻全生育期灌溉共5次，约350mm，分别为播种后立即灌水80mm，分蘖中期灌水60mm,拔节孕穗期灌水70mm,开花期灌水80mm,灌衆期灌水60mm。成熟时,每材料连续取第2行中间5株，考察单株产量，获得各性状的平均值，作为单株产量的测定值。以干旱处理和正常水分的产量相对值作为评价材料抗旱性的综合指标，按抗旱性由强到弱把材料划分抗旱I级、抗旱II级和敏旱3个级别。13个旱稻材料抗旱性都较强，都表现为抗旱I级或抗旱II级，而21个水稻品种的抗旱性都较差，抗旱级别都为敏旱，如表1。
[0048]表1 34个水旱稻品种的抗旱级别
[0049]
【权利要求】
1.一种旱稻抗旱基因，其特征在于，所述的旱稻抗旱基因0sbHLH120属于bHLH类转录因子，位于水稻第9染色体RM24271和RM566之间；该旱稻抗旱基因0sbHLH120与水稻正常的序列相比在编码区缺失了 15个碱基，所述缺失碱基位于基因转录起始密码子下游第628-642bp。
2.根据权利要求1所述的旱稻抗旱基因，其特征在于，所述缺失的15个碱基如SEQIDN0.1所示。
3.一种根据权利要求1所述的旱稻抗旱基因特异序列设计的抗旱基因功能标记InDel-bHLH120，其特征在于，引物序列如下: 正向引物序列:5' -GGCCATCCACTACGTCAAGT-3' 反向引物序列:5' -GGGAAACGATTGTCTCATCACC-3'。
4.一种如权利要求1所述的旱稻抗旱基因在抗旱水稻新品种的分子标记辅助选择育种方面的应用。`
【文档编号】C12Q1/68GK103710354SQ201310533233
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】李俊周, 韩迎春, 赵全志, 李勇, 杜彦修, 张静, 孙红正 申请人:河南农业大学