郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种郁金香类黄酮-3’-羟化酶TfF3’H蛋白及其编码基因，所述蛋白质为如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮-3’-羟化酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ?ID?NO.3所示的核酸序列。本发明中郁金香类黄酮-3’-羟化酶基因通过构建过表达载体转化到烟草中后50%以上转基因烟草花色粉色加深，相应地，转基因烟草花瓣里矢车菊素含量上升20-30%。这表明郁金香类黄酮-3’-羟化酶能作用于花色苷合成途径，影响矢车菊素合成，改变植物花色。
【专利说明】郁金香类黄酮-3’ -羟化酶Tf F3’ H蛋白及其编码基因
【技术领域】
[0001] 本发明涉及郁金香花色苷合成途径中的关健酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香类黄酮-3’ -羟化酶TfF3’ H蛋白及其编码基因，属于分子【技术领域】。
【背景技术】
[0002]花的颜色是影响植物传粉的重要因素，同时也决定一种花卉的商品价值和观赏价值。改变花色，创造新花色，可以增加花卉的商品价值和观赏价值。花朵的颜色是花瓣细胞中积累花色素的结果，花色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素以及甜菜碱类。类黄酮是花色素的一大类，它使花朵产生从黄到紫的全部颜色。
[0003]类黄酮_3’_轻化酶(flavonoid3’_hydroxylase，F3’H,以前文献中曾称为二氢黄酮醇-3’-羟化酶，现多称为类黄酮-3’-羟化酶)属于细胞色素P450单加氧酶，它具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能，在植物类黄酮的合成以及次生代谢中起重要作用。它能在辅因子NADPH和O2的作用下，催化单加氧反应，分别将柚皮素(naringenin)和二氢山奈酹(dihydrokaempferol) B-环的3’位置羟基化,催化形成圣草酹和二氢槲皮素。而圣草酚和二氢槲皮素是合成花色素的重要前体物质，是花的重要成色物质，对于花青素的生物合成起重要作用，从而形成不同的花色素苷，使植物表现不同的花色。F3’ H基因的表达活性会直接影响花朵的最终颜色，例如在矮牵牛中表达其自身得到的F3’ H基因使得缺失F3’ H基因和F3’ 5’ H基因的淡粉色矮牵牛变为深粉色；将龙胆F3’ H基因转化入烟草中，发现在转基因烟草体内出现花青素和槲皮素含量的增加，从而影响了烟草的花色；F3’H基因的缺失时,裂叶牵牛(Ipomoea nil )、三色牵牛(Ipomoea tricolor)和圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)会产生含有天竺葵色素衍生物的浅红色的花。因此,对F3’H基因表达进行调控是改变花色的途径之一。
[0004]F3’ H基因已在多种植物中得到克隆，但在郁金香(Tulipa fosteriana)中，F3’ H基因的克隆、表达模式及F3’H蛋白编码序列目前尚不清楚。目前，未有任何与郁金香F3’H蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明填补郁金香F3’ H基因家族成员的克隆、表达模式分析以及郁金香F3’ H蛋白及其编码基因的空白，提供了一种郁金香TfF3’ H蛋白序列，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。本发明公开了郁金香TfF3’ H蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；构建了 TfF3’ H基因过表达载体并转化烟草，分析了 TfF3’ H基因对转基因烟草花色苷合成及花色的影响。利用本发明提供的郁金香类黄酮3’ -羟化酶TfF3’ H，能为基因工程改变花色，获得创新花色提供一种有效的技术手段。此外，此外，利用本发明的郁金香TfF3’ H基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出与F3’ H发生相互用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的，[0007]本发明目的在于提供一种具有郁金香类黄酮-3’ -羟化酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮_3’ -羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0008]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.4所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0009]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.4所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0010]另一方面，本发明提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0011]优选的，所述核酸序列具体为:
[0012](a)碱基序列如SEQ ID N0.3第I~1533位所示；
[0013]或(b)与SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能与SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸进行杂交的序列。
[0015]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
[0016]此外，本发明还提供了一种检测上述核酸序列的探针，所述探针为具有上述核酸序列8~100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码郁金香F3’ H相关的核酸分子。
[0017]本发明提供的分尚出的DNA分子,该分子包括:具有SEQ ID N0.3所不核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香TfF3’H蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ IDN0.3所示序列有至少70%的同源性；或者能与SEQ ID N0.3所示序列的核苷酸序列杂交。
[0018]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0019]在本发明中，术语“郁金香类黄酮_3’ -羟化酶蛋白编码序列”指编码具有郁金香TfF3’H蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.3所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.3所示序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.3所示序列中从核苷酸第I~1533位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0020]该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfF3’H相同功能的蛋白的SEQ ID N0.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
[0021]在本发明中，术语“郁金香类黄酮-3’ -羟化酶TfF3’ H蛋白”是指具有郁金香TfF3’H蛋白活性的SEQ ID N0.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfF3’H相关相同功能的、SEQ ID N0.4所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfF3’ H蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0022]本发明的郁金香TfF3’ H多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfF3’H相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfF3’ H多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0023]在本发明中，“郁金香TfF3’ H保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.4所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0024]表1
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香类黄酮_3’ -羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.4所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.4所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为: Ca)碱基序列如SEQ ID N0.3第I~1533位所示； 或(b)与SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID N0.3第I~1533位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID N0.3第I~1533位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。`
【文档编号】C12N9/02GK103589694SQ201310533249
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红 申请人:上海交通大学