一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本发明提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3），5’端侧链（1）、环区（2）以及3’端侧链（3）均为单链核苷酸，其中，5’端侧链（1）和环区（2）具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链（1）和3’端侧链（3）的部分核苷酸序列互补，3’端侧链（3）具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本发明提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。
【专利说明】—种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒
【技术领域】 [0001]本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]miRNA是真核生物细胞中一类非编码小分子RNA，主要在转录后水平发挥调控靶基因的作用。miRNA参与调节众多生理病理过程，特别在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的调节作用。伴随着癌症的发生发展，miRNA水平在外周体液(特别是血清)中的异常波动成为癌症早期诊断的重要生理指标。然而，miRNA通常尺寸小，在体液中的丰度低，且同一家族内不同miRNA的核酸序列高度相似，因而实现miRNA的高灵敏分析具有很大的挑战性。
[0003]目前，qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)、miRNA微阵列和第二代测序技术是主要的miRNA检测手段。其中，miRNA微阵列和第二代测序技术在高通量检测和挖掘新的miRNA上较有优势，但是检测的特异性和灵敏度有待提高；此外，目前微阵列和第二代测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和数据解析，从而限制了它们的广泛应用；qRT-PCR是目前最为认可的miRNA定量检测手段，具有较高的检测特异性和灵敏度，但是该方法需要额外的反转录反应，并且引物设计的难度较高，操作过程较为繁琐。
[0004]滚环扩增是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法，以单链环状DNA为模板，以寡聚核苷酸为引物(与部分环状模板互补)，在有顶替作用的DNA聚合酶作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处再顶替剥离下旧的DNA链而进行下一轮扩增，如此循环，生成包含若干重复序列的DNA长链。基于滚环扩增的miRNA检测通常需要高温孵育(55°C~65°C )促进锁式探针和miRNA间的退火，然而处理的温度接近或高于发卡结构的miRNA前体的熔解温度，miRNA前体本身包含miRNA序列，因此会形成miRNA前体与锁式探针之间的错配，从而影响检测的特异性。
[0005]针对上述问题，有必要提供一种不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏对检测样品中miRNA浓度的方法。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针。本发明第二方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法。本发明第三方面提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测试剂盒。本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒在生物医学研究和疾病早期诊断方面具有广阔的应用价值，不仅能特异性的区分待测miRNA、与待测miRNA相似的序列、及目标miRNA的前体，而且简单易行，能快速、高灵敏检测样品中miRNA的浓度。
[0007]本发明所述“miRNA”是指微小核糖核酸。[0008]第一方面，本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)，所述5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链(I)和环区
(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链(I)和3’端侧链(3)的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链(3)具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0009]优选地，所述发卡探针的3’端侧链(3)依次包括与5’端侧链(I)互补的核苷酸序列(31)以及与5’端侧链(I)不互补的核苷酸序列(32)，所述核苷酸序列(32)与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸(4)，所述双链核苷酸(4)的解链温度为5~
15。。。
[0010]进一步优选地，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸(5)和核苷酸序列(32)组成，环部为环区(2)，其中，所述双链核苷酸
(5)为所述5’端侧链(I)与核苷酸序列(31)互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；
[0011]当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与发卡探针的5’端侧链(I)及环区(2)互补形成双链核苷酸(6 )，所述双链核苷酸(5 )解体，随后所述环形探针结合发卡探针的3 ’端侦 ( 3)，得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述发卡探针的3’端侧链(3)与环形探针结合的互补区为双链核苷酸(7)。
[0012]本发明所述核苷酸链之间互补形成双链核苷酸为两条具有互补核苷酸序列的单链核苷酸通过其互补碱基之间的氢键作用形成双链。
[0013]在滚环扩增反应体系中，所述环形探针很难竞争性结合初始状态发卡探针的3 ’端侧链(3)，只有当目标miRNA与发`卡探针互补配对后，探针的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，即发卡探针由初始状态转为成为解链状态时，环形探针极易结合到发卡探针的3’端侧链(3);形成miRNA-发卡探针-环形探针复合物后，发卡探针作为引物、环形探针作为模板，在Phi29DNA聚合酶的参与下实现滚环扩增。
[0014]进一步优选地，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸(5)的解链温度为45~650C;所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸(7)的GC含量为40~60%，解链温度为45~65°C。
[0015]发卡探针的设计是本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法的关键所在，设计所述发卡探针时有两个原则如下:
[0016]1、发卡探针茎干的5’端侧链(I)和环区(2)同目标miRNA的碱基完全互补；
[0017]2、发卡探针茎干的发卡结构(与5’端侧链(I)互补形成)区域(31)和3’端侧链的突出区域(32)同环形探针的部分碱基完全互补；
[0018]本发明提供的发卡探针和环形探针的具体设计原则如下:
[0019]I)、整个发卡探针的熔解温度范围为45~65°C，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在;
[0020]2)、传统的发卡探针的5’端侧链和3’端侧链完全互补，而本发明提供的发卡探针在其3’端添加一小段序列(32)，该小段序列(32)可以调节发卡探针与环形探针配对区域的GC含量在40%~60%，并确保发卡探针与环形探针配对时退火温度范围为45~65°C，以确保其在扩增反应条件下能稳定存在；此外，所添加的小段序列(32)单独与环形探针配对时退火温度范围为5~15°C，以确保其在滚环扩增反应条件下不能单独与环形探针结合；
[0021]当目标miRNA与发卡探针互补配对后，探针茎干的发卡结构被完全打开，暴露出与环形探针互补的区域，且在扩增反应条件下，因为环形探针和发卡探针配对的退火温度范围为45~65°C，所以该配对能稳定存在，从而发卡探针可以作为引物在Phi29DNA聚合酶的参与下实现滚环扩增。
[0022]优选地，所述发卡探针为脱氧核糖核苷酸链。
[0023]优选地，所述环形探针为脱氧核糖核苷酸链。
[0024]优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0025]所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列为发明人根据本发明设计发卡探针的原则、以及已知miR-486-5p的序列进行设计。
[0026]优选地，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027]该发卡探针的设计十分简单，探针的5’端侧链(I)、环区(2)的序列由目标miRNA的序列决定，只需要额外的调节3’端突出序列以增强发卡探针与环形探针互补时的稳定性，当目标miRNA与发卡探针的互补配时改变了发卡探针的二级结构，使得发卡探针的3’端可以作为引物在Phi29等DNA聚合酶的参与下进行滚环扩增，经过一轮又一轮的引物延伸和链置换得到大量的单链的扩增产物，最终通过对产物的定量来衡量目标miRNA的水平。
[0028]第二方面，本发明提供了`一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，包括如下步骤:
[0029]提供或配置滚环扩增反应体系，及
[0030]在25~40°C下恒温反应2~16小时，及
[0031]灭活,得到扩增产物,及
[0032]在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测；
[0033]其中，所述滚环扩增反应体系含有DNA聚合酶、待测miRNA样品、环形探针和发卡探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)，所述5’端侧链
(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链(I)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5 ’端侧链(I)和3 ’端侧链(3 )的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链(3)具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0034]本发明提供的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法中采用的发卡探针为脱氧核糖核苷酸。
[0035]优选地，所述发卡探针的3’端侧链(3)依次包括与5’端侧链(I)互补的核苷酸序列(31)以及与5’端侧链(I)不互补的核苷酸序列(32)，所述核苷酸序列(32)与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸(4)，所述双链核苷酸(4)的退火温度范围为5~15°C。
[0036]进一步优选地，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸(5)和核苷酸序列(32)组成，环部为环区(2)，其中，所述双链核苷酸
(5)为所述5’端侧链(I)与核苷酸序列(31)互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在；[0037]当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与5，端侧链(I)及环区(2)互补形成双链核苷酸(6)，所述双链核苷酸(5)解体，随后所述环形探针结合3’端侧链(3)，得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述3’端侧链(3)与环形探针结合的互补区为双链核苷酸⑴。
[0038]进一步优选地，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸(5)的解链温度为45~650C;所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸(7)的GC含量为40~60%，解链温度为45~65°C。 [0039]优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0040]优选地，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0041]优选地，所述步骤(2)中，所述恒温反应的温度为35°C。
[0042]优选地，所述步骤(2 )中，所述恒温反应的时间为4小时。
[0043]所述步骤(2)中，所述恒温反应的时间2~16个小时为优选条件，此外，也可根据需要过夜恒温反应。
[0044]在25~40°C的反应温度下，与发卡探针完全互补的目标miRNA能打开发卡结构进行高效的滚环扩增，而序列相似的非目标miRNA较难与发卡探针稳定结合；同样条件下，反应体系的温度低于miRNA前体的溶解温度，所以miRNA前体仍然维持二级结构，也较难与发卡探针互补结合，很能启动扩增反应。所以，本发明提供的方法能够特异性区分miRNA、与miRNA序列相似的miRNA、及miRNA前体。
[0045]优选地，所述步骤(3)中，所述灭活的条件为在65°C下灭活10分钟。
[0046]优选地，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentRexo ^DNA聚合酶。
[0047]所述Phi29DNA聚合酶为从Bacillus subtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，除了具有3’ 一5’核酸外切酶校读功能，还具有特殊的链置换和连续合成特性；所述Bst DNA聚合酶(大片段)是Bacillus stearothermophiIus DNA聚合酶的一部分，具有5’ 一 3’ DNA聚合酶活性，但不具有5’ 一 3’核酸外切酶活性；所述VentR (exo - ) DNA聚合酶是一种高保真的耐热DNA聚合酶，是VentR DNA聚合酶经基因工程改造而得，去除了3’ 一 5’核酸外切酶校读活性。
[0048]优选地，所述待测miRNA样品为合成的miRNA样品、从细胞或组织中纯化的含miRNA的待测样品、或含有miRNA的待测血清裂解液。
[0049]优选地，所述含有miRNA的待测血清裂解液的制备方法为:取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95~100°C孵育后，放冰上冷却；然后离心分离取上清液，得到所述含有miRNA的待测血清裂解液。
[0050]进一步优选地，所述血清样品的孵育条件为在98°C下孵育5分钟，冰上冷却的时间为3分钟。
[0051]进一步优选地，所述离心分离取上清液的条件为17000g转速下4°C离心15分钟。
[0052]现有的miNRA检测手段绝大多数都需要提前对样品中的miRNA进行抽提和纯化，这不但增大了样品检测的起始需求量也增加了检测的繁琐程度。传统从血清等体液样品中检测miRNA时，通常需要提纯RNA以排除血清中蛋白对检测的干扰。本发明将血清稀释液进行简单的热处理，从而破坏血清中蛋白与miRNA的相互作用，使蛋白变性沉淀；然后通过高速离心将变性蛋白与miRNA分离，得到血清裂解上清液；该血清裂解上清可以直接采用本发明提供的方法检测miRNA，不需要miRNA抽提和纯化而能直接检测血清裂解液中miRNA的含量，并能特异性的区分待测miRNA、与祀标序列相似的miRNA、及目标miRNA的前体。
[0053]本发明直接使用血清裂解液进行检测，每次检测仅需IOul的血清进行样品制备，远远的低于要满足RNA抽提所需的血清起始量(100微升左右)。
[0054]优选地，所述发卡探针为初始状态的发卡探针，所述初始状态的发卡探针的制备方法为:取合成后的发卡探针，用发卡探针退火缓冲液稀释，90~100°C孵育5~10分钟，然后冷却至室温使所述核苷酸单链折叠形成所述初始状态的发卡探针，其中，所述发卡探针退火缓冲液为氯化镁和三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合液。
[0055]进一步优选地，所述合成后的发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0056]优选地，所述滚环扩增反应体系，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:1 ~1:10。
[0057]进一步优选地，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1: 5。
[0058]进一步优选地，所述发卡探针退火缓冲液的pH为8.0。
[0059]进一步优选地,所述核苷酸单链采用发卡探针退火缓冲液稀释至50nmol/L。
[0060]进一步优选地，所述稀释后的核苷酸单链的孵育条件为在95°C下孵育5分钟。
[0061]进一步优选地,所述冷却至室温的条件为缓慢冷却3~4小时。
[0062]缓慢冷却有利于发卡结 构的形成。
[0063]进一步优选地，所述混合液中，所述氯化镁的摩尔浓度为5mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-盐酸的摩尔浓度为10mmol/L。
[0064]在预制备退火的发卡探针后，整个滚环扩增反应是在恒温的均相体系中完成的，只需将待测样品与探针、Phi29DNA聚合酶和反应所需原料混合即可；此外，作为扩增模板的环形探针可以预先统一制备，不需要在每次检测反应时都进行环化反应，从而简化检测步骤。
[0065]优选地，所述步骤(4)中，所述荧光光谱检测采用的荧光染料为SYBR Green II染料。
[0066]滚环扩增的产物为大量长度不同的DNA单链，这些产物可以通过SYBR Green II荧光染料定量检测。
[0067]在设定的反应温度下，没有与miRNA互补配对的发卡探针可以仍然保持其二级结构，不会与环形探针结合启动扩增反应，最后检测时只有极低的背景荧光信号，从而实现miRNA的特异性检测。
[0068]第三方面，本发明提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，用于检测待测样品中miR-486-5p的浓度C，所述miR-486_5p的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其特征在于，包括如下步骤:
[0069]提供或配置含miR-486_5p的待测样品、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的发卡探针Q1、具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的环形探针Q2、用于滚环扩增的DNA聚合酶P ;
[0070]配置滚环扩增反应体系1、2、3及4:所述滚环扩增反应体系I含有DNA聚合酶P、样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系2含有样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系3含有DNA聚合酶P、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系4含有DNA聚合酶P、及环形探针Q2 ；
[0071]随后在25~40°C下恒温反应2~16小时；
[0072]灭活，得到扩增产物；
[0073]在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测，得到滚环扩增反应体系1、2、3及4扩增后产物的荧光强度值，所述滚环扩增反应体系1、2、3及4的荧光强度值分别为F1、F2、F3 及 F4 ；
[0074]根据获得的上述参数，计算miR-486_5p浓度C如下式
[0075]1glOY=0.28841oglOC+3.545
[0076]式中，
【权利要求】
1.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，包括发卡探针和环形探针，所述发卡探针依次包括5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)，所述5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链(I)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5’端侧链(I)和3’端侧链(3)的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链(3)具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针的3’端侧链(3)依次包括与5’端侧链(I)互补的核苷酸序列(31)以及与5’端侧链(O不互补的核苷酸序列(32)，所述核苷酸序列(32)与所述环形探针的部分核苷酸序列互补时形成双链核苷酸(4)，所述双链核苷酸(4)的解链温度为5~15°C。
3.如权利要求2所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针具有茎-环二级结构的初始状态，由茎部和环部构成，茎部由双链核苷酸(5)和核苷酸序列(32)组成，环部为环区(2)，其中，所述双链核苷酸(5)为所述5’端侧链(I)与核苷酸序列(31)互补形成，当待测miRNA不存在时，所述发卡探针以初始状态存在； 当待测miRNA存在时，所述待测miRNA与发卡探针的5’端侧链(I)及环区(2)互补形成双链核苷酸(6 )，所述双链核苷酸(5 )解体，随后所述环形探针结合发卡探针的3 ’端侧链(3)，得到miRNA-发卡探针-环形探针复合物，其中，所述发卡探针的3’端侧链(3)与环形探针结合的互补区为双链核苷酸(7)。
4.如权利要求3所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述初始状态发卡探针的双链核苷酸(5)的解链温度为45~65°C ;所述miRNA-发卡探针-环形探针复合中，所述双链核苷酸(7)的GC含量为40~60%，解链温度为45~65°C。
5.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针，其特征在于，所述环形探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 提供或配置滚环扩增反应体系，及 在25~40°C下恒温反应2~16小时，及 灭活，得到扩增产物，及 在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测； 其中，所述滚环扩增反应体系含有DNA聚合酶、待测miRNA样品、环形探针和发卡探针，其中，所述发卡探针依次包括5’端侧链(I)、环区(2)以及3’端侧链(3)，所述5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，所述5’端侧链(I)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，所述5 ’端侧链(I)和3 ’端侧链(3 )的部分核苷酸序列互补，所述3’端侧链(3)具有与所述环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR excTDNA聚合酶。
9.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述待测miRNA样品为合成的miRNA样品、从细胞或组织中纯化的含miRNA的待测样品、或含有miRNA的待测血清裂解液。
10.如权利要求9所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述含有miRNA的待测血清裂解液的制备方法为:取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95~100°C孵育5~10分钟，冰上冷却2~5分钟；然后离心分离取上清液，得到所述含有miRNA的待测血清裂解液。
11.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述发卡探针为初始状态的发卡探针，所述初始状态的发卡探针的制备方法为:取合成后的发卡探针，用发卡探针退火缓冲液稀释，90~100°C孵育5~10分钟，然后冷却至室温使所述核苷酸单链折叠形成所述初始状态的发卡探针，其中，所述发卡探针退火缓冲液为氯化镁和三羟甲基氨基甲烷-盐酸的混合液。
12.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述滚环扩增反应体系，所述发卡探针和所述环形探针的摩尔比为1:1~1:10。
13.如权利要求7所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述荧光光谱检测采用的荧光染料为SYBR Green II染料。
14.一种基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，用于检测待测样品中miR-486_5p的浓度C，所述miR-486-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，其特征在于，包括如下步骤: 提供或配置含miR-486-5p的待测样品、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的初始状态的发卡探针Q1、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的环形探针Q2、用于滚环扩增的DNA聚合酶P ; 配置滚环扩增反应体系1、2、3及4:所述滚环扩增反应体系I含有DNA聚合酶P、样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系2含有样品、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系3含有DNA聚合酶P、发卡探针Q1、及环形探针Q2 ;所述滚环扩增反应体系4含有DNA聚合酶P、及`环形探针Q2 ；` 随后在25~40 °C下恒温反应2~16小时； 灭活，得到扩增产物； 在扩增产物中加入荧光染料，进行荧光光谱检测，得到滚环扩增反应体系1、2、3及4扩增后产物的荧光强度值，所述滚环扩增反应体系1、2、3及4的荧光强度值分别为F1、F2、F3及F4 ； 根据获得的上述参数，计算miR-486-5p浓度C如下式
15.如权利要求14所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测方法，其特征在于，所述含miR-486-5p的待测样品的制备方法为:取血清样品用磷酸盐缓冲液稀释，95~100°C孵育后，放冰上冷却；然后离心分离取上清液，得到所述含有miR-486-5p的待测血清裂解液。
16.如权利要求1所述的基于滚环扩增反应的miRNA检测探针在制备检测miRNA的基因芯片或试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103555838SQ201310533375
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】张春阳, 李莹 申请人:深圳先进技术研究院