人ror2基因突变及其用途
【专利摘要】本发明涉及人ROR2基因突变及其用途。本发明提供了检测人ROR2基因的突变的方法，并提供了相关的检测试剂盒。本发明方法是通过测序确定SEQIDNO:1所示序列中的第2472位核苷酸（ROR2基因的第9号外显子的第887位核苷酸），检测其是否存在C→A突变。本发明研究发现，人ROR2基因（SEQIDNO:1所示序列）第2472位核苷酸发生C→A突变时，导致ROR2蛋白氨基酸序列SEQIDNO:2中S758X的改变，形成了截短的ROR2蛋白，与短指症B型疾病的发病相关。本发明可以用于短指症中B型的辅助诊断，用于发现遗传性白内障的潜在携带者，为该病的预防提供依据。
【专利说明】人R0R2基因突变及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及人R0R2的基因突变和分析人R0R2基因的突变的方法，以及此突变在短指症B型辅助诊断的用途。
【背景技术】
[0002]短指症(Brachydactyly),又名短趾症,是一种常染色体显性遗传疾病。是指(趾)骨、掌(跖)骨发育异常导致的指(趾)骨缩短、缺如或融合的手足先天畸形。1951年，Bell根据畸形发生部位和患者受累程度的不同，将遗传性短指畸形分为A、B、C、D、E五种类型，并将A型进一步细分为A1、A2、A3三种亚型。其中短指症B型(Brachydactyly type B, BDB)是众分型中表型最严重的一种，表型独特。BDB患者2-5指远节指骨及指甲发育不良甚至缺失，中间指骨发育不良，伴有指甲的部分或完全缺失；拇指可表现正常也可呈现扁宽或末节指骨分叉畸形；足部表型与手部相似，但受累程度较轻。
[0003]受体酪氨酸激酶样孤独受体2 (Tyrosine-protein kinase transmembranereceptor2, R0R2)基因为 BDBl 的主要致病基因[Oldridge, M., Fortuna, A.M., Maringa, M.,Propping, P., Mansour, S., Pollitt, C., DeChiara, T.M., Kimble, R.B., Valenzuela, D.M., Yancopoulos, G.D., Wilkie, A.0.M.Dominant mutations in R0R2 , encodingan orphan receptor tyrosine kinase, cause brachydactyly type B.NatureGenet.24:275-278，2000.],由 Oldridge 等于 1999 年定位于 9q22。该基因全长约235kb，共9个外显子，编码长度为943个氨基酸。它参与了早起的软骨细胞形成发育，与软骨及骨骼生长相关[DeChiara, T.M.，Kimble, R.B.，Poueymirou, ff.T.，Rojas, J.，Masiakowski, P., Valenzuela,D.M., Yancopoulos, G.D.Ror2, encoding a receptor-liketyrosine kinase, is required for cartilage and growth plate development.NatureGenet.2000.24:271-274] OR0R2基因与其配体Wnt5a结合抑制典型的Wnt信号途径，影响胚胎发育、细胞增殖和分化调控[Mikels, A.J.，Nusse, R.Purified Wnt5a protein activatesor inhibits beta—catenin—TCF signaling depending on receptor context.PLoSBiol.4:ell5,2006.Note:Electronic Article.]。
[0004]导致BDB的基因突变非常稀有，到目前为止，国际上共发现约10种致病突变，国内仅发现2种，均位于R0R2基因的第8、9外显子内，以无义突变或移码突变的形式导致截短蛋白或异常C-末端的产生。
[0005]本发明以BDB家系为研究对象，结合基因测序技术及单链构象多态性技术，鉴定了 R0R2的一个新的致病突变。目前国际上还没有关于R0R2基因S758X突变导致短指症B型疾病的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于提供一种检测人R0R2基因突变的方法；
[0007]本发明的第二个目的在于提供用于检测人R0R2基因突变的试剂盒。[0008]本发明研究发现R0R2基因9号外显子第887位核苷酸C — A无义突变与BDB相关联。该突变致所编码的第758位氨基酸就由丝氨酸(TCG)变成终止密码子(TAG)，这一突变致使R0R2蛋白被截短185个氨基酸，从而使其理化性质和功能发生改变。经研究发现，与人类BDB疾病密切相关。
[0009]为此，本发明第一方面，提供一种检测人R0R2基因的突变的方法，其包括以下步骤:
[0010](a)确定在样品中人R0R2基因编码的第758位氨基酸，或SEQ ID NO:1的第2471至2473位核苷酸；
[0011](b)检测在所述位置是否存在氨基酸S — X突变。
[0012]具体地，所述的突变是在SEQ ID NO:1第2273位核苷酸C —A的突变，使得其在此处形成终止密码。
[0013]本发明的第二方面，提供一种分离的核酸，它具有SEQ ID N0:1所示的序列，且第2472位为A，或者包括第2472位核苷酸的SEQ ID N0.1所示序列的特异性片段。
[0014]进而本发明提供一种分子标记，其为上述SEQ ID N0.1所述的核酸序列，或者所述的特异性片段，通过该分子标记，能够判断是否存在BDB患病风险。
[0015]在本发明的第三方面，提供用于扩增包括上述突变位点的特异性引物。例如，该引物其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人R0R2基因的SEQ ID NO:1所示序列中第2472位核苷酸C — A突变或者基因组R0R2基因的9号外显子第887位处的C — A突变的扩增产物。
[0016]在本发明的第四方面 ，提供一种可与上述SEQ ID N0.1特异性杂交并检测所述突变位点的寡核苷酸探针。例如，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人R0R2基因的SEQ ID NO:1所示序列中第2472位核苷酸C — A突变或者基因组R0R2基因的9号外显子第887位处的C — A碱基突变。
[0017]在本发明的第五方面，提供了 BDB疾病分子诊断的试剂盒。该试剂盒包括用于人R0R2基因的第2472位核苷酸检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序列相应位点检测的试剂，或用于该基因表达产物相应位点检测的试剂。其可以是:1)检测基因组的PCR试剂盒；或2)检测mRNA的荧光定量PCR检测试剂盒，或Northern检测试剂盒。例如，可以包括上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针；或3)检测该突变蛋白的免疫检测试剂盒。
[0018]本发明研究发现人R0R2基因的SEQ ID NO:1所示序列中第2472位核苷酸C — A突变或者基因组R0R2基因的9号外显子第887位处的C — A突变，这一突变导致R0R2蛋白氨基酸序列SEQ ID N0:2中S758X的改变，形成了截短的R0R2蛋白，与人类BDB疾病发病相关。本发明可以用于BDB疾病的辅助诊断，用于发现BDB疾病的潜在携带者，为该病的预防提供了依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1显示的是家系中对照及人群中对照的测序图(正向)，图中箭头所指为SEQ IDN0.1的第2472位，为野生型(C/C)；
[0020]图2显示的是家系中患者的测序图(正向)，图中箭头所指为SEQ ID N0.1的第2472位，为突变型(C/A)；【具体实施方式】
[0021]本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了人R0R2基因的突变(C.2273G > A，S758X，NM_004560.3)在一个BDB家系中呈现杂合突变，有典型的临床表现，中指骨缩短或与远端指骨融合，伴有指甲发育异常和拇指远端指骨分叉，显示这个突变可能影响到基因的功能，使骨骼发育异常，导致了 BDB的发生。已经有R0R2基因特异性敲除的小鼠模型，导致了严重的软骨发育异常并伴有其他发育异常而夭折。
[0022]人R0R2基因的基因组序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。人R0R2的基因组序列可以从GenBank中犾得。
[0023]本【技术领域】的人员均知道，有许多的分析技术可以用于检测人R0R2基因的突变。这些技术包括(但不局限于)=DNA测序、杂交测序、酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Min1-sequencing、Taqman技术、高分辨率熔解曲线(HRM)、变性的高效液相色谱(DHPLC)和分子信标等。
[0024]另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体对BDB的易感性。
[0025]本发明的检测样品可以是从体液、组织甚至头发等样品中抽提的基因组DNA或mRNA ο
[0026]用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据R0R2基因的基因组序列(SEQID NO:1的序列)或cDNA序列进行设计，并用常规的合成技术进行合成即可。
[0027]以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规进行或者按照试剂盒建议的条件完成。
[0028]实施例1基因组的抽提和测序
[0029]用常规的酚氯仿法从人的血液中提取基因组DNA，用于常规PCR扩增。引物序列为:
[0030]正义引物:5’CCGATGACTGTCCCGCCTG 3，
[0031]反义引物:5’GCGTTGCTCACATTGCTCACTG 3’
[0032]扩增体系:(总体积50 μ L )
【权利要求】
1.一种检测人/----基因突变的方法，其包括步骤: (a )确定在样品中人/----基因编码的氨基酸序列的第758位氨基酸，或该基因的第2471至2473位碱基； (b )检测在所述位置是否存在S — X的突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变是在SEQID NO:1第2472位核苷酸C — A的突变，对应于SEQ ID NO: 2的第758位氨基酸存在Ser — Ter突变。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核苷酸序列是第2472位为A的SEQ IDNO:1所示的序列。
4.一种分子标记，其为权利要求3所述分离的核酸。
5.一种用于辅助诊断短指症B型疾病的试剂盒，其包括用于人/----基因的第2472位核苷酸特异检测的试剂，或用于该基因转录的mRNA序列相应位点检测的试剂，或用于检测该基因表达产物相应位点的检测试剂。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为:I)检测基因组的PCR试剂盒；或2)检测mRNA的荧光定量PCR试剂盒，或Northern检测试剂盒；或3)检测该突变蛋白的免疫试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括序列为SEQIDNO:3和4的引物对。
8.一种检测人/----基因突变的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3和4所示。
9.一种寡核苷酸探针，其特异性地与SEQ ID NO:1杂交并检测其第2472位核苷酸。
【文档编号】C12N15/11GK103555837SQ201310533358
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】郑芳, 董素芳, 韩明君, 宋贵波 申请人:武汉大学