一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组dna的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的方法及试剂盒。该方法包括如下步骤：1）菌体裂解，2）沉淀菌体蛋白，3）去除菌体蛋白，4）沉淀基因组DNA，5）去离子，6）溶解DNA。其中步骤1）所用到的菌体裂解缓冲液含有：38～42mMTris-acetatepH7.8，18～22mMsodium-acetate，0.8～1.2mMEDTA，0.8～1.2%SDS。本发明方法提取获得的鸭疫里默氏杆菌基因组DNA，不仅提取效率高，而且基因组DNA的纯度高，为后续分子生物学的研究奠定了坚实基础，且操作简单可行，实用性强。
【专利说明】一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物的分子生物学领域，特别提供了一种从默氏杆菌基因组中高效提取高分子量基因组的方法。通过该方法提取的基因组可以满足许多分子生物学分析的需要。
【背景技术】
[0002]鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种革兰氏阴性菌,无运动性，不形成芽孢，主要引起家鸭、火鸡和其它多种鸟类的传染性败血症。自郭玉璞等于1982年确定我国存在该病以来，鸭疫里默氏杆菌病一直是危害我国养鸭业的主要疾病。该病的发病率和死亡率都很高，其发病率可达90%以上，死亡率最高可达75%，耐过的病鸭常常长成残次鸭或僵鸭，饲料转化率降低，生长发育迟缓。该病在世界范围内广泛流行，是目前造成养鸭业经济损失的最主要和最为严重的传染病之一。给养鸭业造成了巨大的经济损失。
[0003]鸭疫里默氏杆菌全基因组测序的完成，标志着对该菌的研究已经进入了功能基因组时代。基因组DNA的提取技术是进行鸭疫里默氏杆菌分子生物学研究的基本技术之一，DNA产率的高低，质量的好坏直接影响到后续实验的成败，因此探讨如何快速、高效地提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA是一项非常有意义的工作。
[0004]目前实验室提取细菌基因组DNA的方法主要有试剂盒法、CTAB/NaCl、蛋白酶K等法。但这些方法往往存在各自的局限性，缺乏通用性，对于鸭疫里默氏杆菌基因组的提取，效果往往不够理想，如成本昂贵、耗时、基因组浓度低以及不能大量提取等。
【发明内容】
[0005]针对上述不足，本发明的目的在于提供一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的方法及试剂盒。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的方法，包括如下步骤:
I)菌体裂解:向收集的鸭疫里默氏杆菌菌体中加入裂解缓冲液，充分重悬细菌，静置裂解，所述裂解缓冲液含有:38 ~42 mM Tris-acetate pH 7.8,18 ~22 mM sodium-acetate,
0.8 ~1.2 mM EDTA,0.8 ~1.2% SDS。
[0007]2)沉淀菌体蛋白:在重悬液中加入1/4~1/2倍体积的5 M NaCl溶液，充分混匀，尚心，取上清；
3)去除菌体蛋白:往步骤2)所得上清液中加入I~1.5倍体积的氯仿，轻柔地颠倒离心管至溶液变成牛奶状，离心，取上层水相；重复本步骤I~3次；
4)沉淀基因组DNA:往步骤3)所得上层水相中加入1.5~2.5倍体积无水乙醇，低温放置.1~2小时；
5)去离子:用65~75%乙醇溶液洗涤沉淀；
6)溶解DNA:待乙醇挥发完全后，加入适量双蒸水溶解沉淀，即为基因组DNA。[0008]步骤I)所述的鸭疫里默氏杆菌菌体采用下述方法收集:取对数生长期的鸭疫里默氏杆菌过夜培养菌液于离心管中，室温12000 r/min离心3 min,弃去上清,收集得到菌体。
[0009]作为优选的，步骤I)所述裂解缓冲液含有:40 mM Tris-acetate pH 7.8,20 mMsodium-acetate,I mM EDTA,1% SDS。
[0010]作为优选的，步骤2)所述离心的条件为:4°C, 12000 r/min离心10 min。
[0011]作为优选的,步骤3)所述离心的条件为:室温12000 r/min离心5min。
[0012]作为优选的，步骤4)是在一 20°C放置I~2小时。
[0013]一种用于快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的试剂盒，其包括:裂解缓冲液、蛋白沉淀液、DNA沉淀液和DNA洗涤液，其中，
裂解缓冲液含有:38 ~42 mM Tris-acetate pH 7.8,18 ~22 mM sodium-acetate,
0.8 ~1.2 mM EDTA, 0.8 ~1.2% SDS ；
蛋白沉淀液由浓度为5 M的NaCl溶液和氯仿组成；
DNA沉淀液为无水乙醇；
DNA洗涤液为65~75%乙醇溶液。
[0014]作为优选的，所述裂解缓冲液含有:40 mM Tris-acetate pH 7.8，20 mMsodium-acetate,I mM EDTA,1% SDS。
[0015]本发明的有益效果是:与其他基因组DNA提取方法相比，本发明方法提取获得的鸭疫里默氏杆菌基因组DNA，不仅提取效率高，而且基因组DNA的纯度高，为后续分子生物学的研究奠定了坚实基础，且操作简单可行，实用性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明方法提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的效果图；
图2为本发明DNA提取方法与常规DNA提取方法的比较(Lane 1:常规商品试剂盒提取的基因组DNA; Lane 2:DL15, 000 DNA Marker ; Lane 3:本发明方法提取的基因组DNA)。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。如无特殊说明，以下所有“ ％”均指质量百分比。
[0018]实施例1
一种快速提取鸭疫里 默氏杆菌基因组DNA的方法，具体步骤如下:
(O菌体的收集:取1.5 mL对数生长期的鸭疫里默氏杆菌RAl型菌株过夜培养菌液，加入到于1.5 mL离心管中，室温12000 r/min离心3 min,弃去上清,收集细菌,如需提高细菌基因组DNA浓度，可重复取样；
(2)菌体裂解:向沉淀中加入200PL的裂解缓冲液(40 mM Tris-acetate pH 7.8,20mM sodium-acetate, I mM EDTA, 1% SDS))，轻柔吹打几次，充分重悬细菌，离心管室温静置2 min，充分裂解菌体；
(3)沉淀菌体蛋白:在重悬液中加入70PL的5 M NaCl溶液，并充分混匀，4°C 12000r/min离心10 min ；5 M NaCl的加入有助于菌体蛋白的沉淀；(4)去菌体蛋白:将裂解上清转入一新的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿，上下轻柔地颠倒离心管，至少50次，直至溶液变成牛奶状，室温12000 r/min离心5min ；
(5)上层水相转移至一新的1.5mL离心管，重复步骤(4)；
(6)沉淀基因组DNA:上层水相转入一新的1.5mL离心管中，加入2倍体积无水乙醇，一20°C放置I小时;
(7)去离子:70%无水乙醇洗涤两次；
(8)溶解:置于超净台中5-10min，充分除去乙醇残留后，加入适量的双蒸水溶解沉淀，即为基因组DNA;
(9)紫外分光光度计来检测0D260/280吸收值，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测(见图1)。
[0019]采用常规商品DNA提取试剂盒提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA作为对比，比较结果见图2。
[0020][0020]由图1和图2可见，相对于常规商品试剂盒，本发明方法提取获得的鸭疫里默氏杆菌基因组DNA，不仅提取效率高，而且基因组DNA的纯度高，为后续分子生物学的研究奠定了坚实基础，且操作简单可行，实用性强。
[0021]实施例2
根据实施例1的方法构建一种用于快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的试剂盒，组成如下: (1)裂解缓冲液:40mM Tris-acetate pH 7.8,20 mM sodium-acetate, I mM EDTA, 1%
SDS ；
(2)蛋白沉淀液:5M的NaCl溶液、氯仿；
(3)DNA沉淀液:无水乙醇；
(4)DNA洗涤液:70%乙醇溶液。
[0022]以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【权利要求】
1.一种快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的方法，包括如下步骤: 1)菌体裂解:向收集的鸭疫里默氏杆菌菌体中加入裂解缓冲液，充分重悬细菌，静置裂解，所述裂解缓冲液含有:38~42 mM Tris-acetate pH 7.8,18~22 mM sodium-acetate,0.8 ~1.2 mM EDTA, 0.8 ~1.2% SDS ； 2)沉淀菌体蛋白:在重悬液中加入1/4~1/2倍体积的5M NaCl溶液，充分混匀，离心，取上清； 3)去除菌体蛋白:往步骤2)所得上清液中加入I~1.5倍体积的氯仿，轻柔地颠倒离心管至溶液变成牛奶状，离心，取上层水相，重复本步骤I~3次； 4)沉淀基因组DNA:往步骤3)所得上层水相中加入1.5~2.5倍体积无水乙醇，低温放置.1~2小时； 5)去离子:用65~75%乙醇溶液洗涤沉淀； 6)溶解DNA:待乙醇挥发完全后，加入适量双蒸水溶解沉淀，即为基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的鸭疫里默氏杆菌菌体采用下述方法收集:取对数生长期的鸭疫里默氏杆菌过夜培养菌液于离心管中，室温12000 r/min离心3 min,弃去上清,收集得到菌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述裂解缓冲液含有:40mMTris-acetate pH 7.8,20 mM sodium-acetate,I mM EDTA,1% SDS。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述离心的条件为:4°C，12000r/min 离心 10 min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述离心的条件为:室温12000r/min 离心 5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)是在一20°C放置1~2小时。
7.一种用于快速提取鸭疫里默氏杆菌基因组DNA的试剂盒，其包括:裂解缓冲液、蛋白沉淀液、DNA沉淀液和DNA洗涤液，其中， 裂解缓冲液含有:38 ~42 mM Tris-acetate pH 7.8,18 ~22 mM sodium-acetate,0.8 ~1.2 mM EDTA, 0.8 ~1.2% SDS ； 蛋白沉淀液由浓度为5 M的NaCl溶液和氯仿组成； DNA沉淀液为无水乙醇； DNA洗涤液为65~75%乙醇溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液含有:40mMTris-acetate pH 7.8,20 mM sodium-acetate,I mM EDTA,1% SDS。
【文档编号】C12N15/10GK103614370SQ201310561323
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】袁建丰, 李林林, 孙敏华, 董嘉文, 向蓉, 胡奇林 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所