具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法
【专利摘要】本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过在植物中提高编码铵转运蛋白多肽之核酸序列的表达而提高多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有提高编码AMT多肽之核酸序列表达的植物，所述植物与对照植物相比具有提高的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。
【专利说明】具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法
[0001]本申请为2008年11月21日提交的，发明名称为“具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法”的PCT申请PCT/EP2008/065947的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年05月24日，申请号为200880117394.1。
[0002]本发明一般涉及分子生物学领域，并涉及通过在植物中提高编码铵转运蛋白(型ponium transporter, AMT)多肽之核酸序列的表达而提高多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有表达编码AMT多肽之核酸序列提高的植物，所述植物与对照植物相比具有提高的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。
[0003]持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术来鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，这可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的生殖质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0004]具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为作物产生的可测量的经济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐性和早期活力(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。因此，优化前述因素可以对增加作物产量有贡献。
[0005]种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈谷粒。
[0006]植物生物量为饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草的产量。在谷物作物中使用产量的许多替代参数。其中首要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不同，可以通过许多方法测量植物大小,但是包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座植物直径、叶长、根长、根生物量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的发育阶段维持植物不同部分大小间的保守比。利用这些异速生长关系而对这些有关大小的测量结果进行由此及彼的外推(如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environl05:213)。早期发育阶段的植物大小通常将与晚期发育阶段的植物大小有关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光 和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&TolIenaar2005 Maydica50:39)。除了植物所具有的最初达到较大大小的微环境或遗传优势的潜在延续，此为其附加效应。植物大小和生长速率存在着强遗传组分(如ter Steege等2005PlantPhysiology 139:1078),且迄今为止,种种多样化基因型植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics107:679)。以这种方式，使用标准环境作为田地中作物在不同时间和地点所遭遇的多样化动态环境的替代参数。
[0007]对于众多作物的另一个重要性状是早期活力。改进早期活力是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固着是重要的。在将稻直接播种至涝田的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。人工改造植物内早期活力的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期活力已经限制了基于玉米带生殖质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
[0008]收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在植物大小和谷物产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(如Rebetzke等2002CropScience42:739)。这些方法固有地联系在一起，因为大多数谷物生物量取决于植物叶和茎当前或忙存的光合作用生产力(Gardener等 1985Physiology of Crop Plants.1owa StateUniversity Press, pp68_73)。因此,对植物大小的选择,甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等2005 Agric Ecosys&Environl05:213)。当测试遗传差异对胁迫耐性的影响时，温室或植物培养室与田地相比具有固有的优势:即能够使土壤性能、温度、水和养分的可用性以及光强度标准化。不过，因缺乏风力或昆虫导致不良授粉，或由于空间不足以让成熟根或冠层生长等等，对产量造成的这些人工局限性会限制这些控制环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是提供潜在遗传产量优势指标的标准方法。
[0009]又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50%(Wang等、Planta(2003)218:l-14`)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性、养分(大量元素和/或微量元素)过剩或缺乏、辐射和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民具有极大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
[0010]作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。
[0011]取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
[0012]增加植物中产量相关性状(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。
[0013]现已发现可以通过提高植物中的编码铵转运蛋白(AMT)多肽的核酸序列在植物中表达而改进植物中的多种产量相关性状。所述提高的产量相关性状包括以下一种或多种:提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提高的根生物量、提高的每株植物种子总产量、提闻的种子饱满率、提闻的饱满种子数和提闻的收获指数。
[0014]背景
[0015]铵和硝酸盐是植物生长和发育的主要氮源。植物需要转运蛋白来获得铵和硝酸盐。铵和硝酸盐的转运蛋白不仅存在于植物中，而且存在于几乎所有生物中。铵转运蛋白(AMT)通常在基因组中作为基因家族存在，例如至少在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有 6 种，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii )中有 8 种(Gonzales-Ballester等(2004)Plant Molec Biol56:863-878)，杨中有 14 种(Couturier 等(2007)NewPhytologistl74:137-150),三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)这种娃藻中有 6 种(Allen(2005)J Phycology41)。
[0016]基于系统进化分析，鉴定了铵转运蛋白的3个亚家族(Loqu6&von Wiren(2004) JExp Bot55(401):1293-1305):
[0017]1.AMT亚家族，包括植物AMTl型转运蛋白和蓝细菌铵转运蛋白；
[0018]2.MEP亚家族，包括植物AMT2型转运蛋白、酵母MEP转运蛋白、大肠杆菌AmtB和其他原核同源物；
[0019]3.Rh亚家族，仅包括人和动物RH血型抗原。
[0020]所有AMT多肽都是高度疏水的膜蛋白，具有至少10个(通常11个)推定的跨膜螺旋。许多报道显示AMT多肽能在宽浓度范围内摄入铵，但亲和力在不同生物之间有差异。在某些生物(如植物)中，鉴定了高亲和力和低亲和力铵转运蛋白(Gazzarini等(1999)PlantCell 11:937-47)。除了亲和力特性以外，还鉴定了铵摄取的其他调节机制，例如在转录和转录水平上(Yuan 等(2007) Plant Phys 143:732-744)。
[0021]使用组成型表达的玉米泛素启`动子,在两个稻栽培种(Taipei309和Jarrah)中过表达了来自稻的编码AMTl的核酸序列。与野生型相比，转基因株系的嫩枝和根的生物量在幼苗和早期营养阶段出现下降，特别是在高铵营养下培养时(Hoque等(2006)FunctionalPlant Biol 33:153-163)。作者推断，转基因植物在早期生长阶段的生物量下降可能是因为由于铵同化不能与更高的铵摄取相匹配而导致铵在根中积累。
[0022]美国专利6，620, 610描述了编码来自拟南芥的AMTl多肽的核酸序列、包含所述编码AMTl之核酸序列的用于在酵母和细菌中表达的载体。
[0023]美国专利6，833，492描述了编码来自大豆、玉米、小麦和稻的AMTl多肽的核酸序列。描述了编码AMTl多肽或者与分离的大豆AMTl多肽具有90%氨基酸序列同一性之AMT多肽的核酸序列。描述了包含编码这些多肽序列的重组核酸序列的植物和种子，以及产生这些植物的方法。
[0024]意想不到的是，现在发现提高编码AMT多肽之核酸序列的表达给予植物与对照植物相比提高的产量相关性状。
[0025]根据一个实施方案，提供了在植物中与对照植物相比提高产量相关性状的方法，包括在植物中提高编码本文所述AMT多肽之核酸序列的表达。提高的产量相关性状包括以下一种或多种:提闻的早期活力、提闻的地上部分生物量、提闻的根生物量、提闻的每株植物种子总广量、提闻的种子饱满率、提闻的饱满种子数、提闻的每花序花数和提闻的收获指数。
[0026]定义[0027]多肽/蛋白质
[0028]术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指处于任意长度聚合形式中的通过肽键连接在一起的氨基酸。
[0029]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0030]术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合无分支形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组
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[0031]对照植物
[0032]选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评价植物相同的植物物种或甚至是相同的品种。对照植物也可以是待评价植物的失效合子。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
[0033]同源物
[0034]蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与衍生其的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性 。
[0035]缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0036]插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG -表位、lacZ、CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0037]替换指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域众所周知的(见例如 Creighton (1984) Proteins W.H.Freeman and Company 编辑和下表 I)。
[0038]表1:保守性氨基酸替换的实例
[0039]
~j保守性替换j残基j保守性替换
Ala SerLeu He ；Val
Arg LysLys Arg ；Gln
Asn Gln ；His Met Leu ；Ile
Asp GluPhe Met ；Leu ；Tyr
【权利要求】
1.与对照植物相比在植物中提高产量相关性状的方法，其包括:在植物中提高编码铵转运蛋白(AMT)多肽之核酸序列的表达；以及任选地选择具有提高的产量相关性状的植物，其中所述AMT多肽包含与SEQ ID NO: 33所示保守结构域(⑶)以递增优选顺序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高氨基酸序列同一性的结构域，其中所述AMT多肽与SEQ ID NO:4所示AMT多肽以递增优选顺序具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高氨基酸序列同一性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述编码AMT多肽的核酸序列为SEQID NO: 3所示的核酸序列，或者是能够与SEQ ID NO:3所示的核酸序列杂交的序列。
3.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述提高的表达通过以下任何一种或多种来实现:T-DNA激活标签化、TILLING或同源重组。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述提高的表达通过在植物中引入并表达编码AMT多肽的核酸序列来实现。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述提高的产量相关性状为以下一种或多种:提闻的早期活力、提闻的地上部分生物量、提闻的根生物量、提闻的每株植物种子总广量、提闻的种子饱满率、提闻的饱满种子数或提闻的收获指数。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列与组成型启动子有效连接，优选与植物组成型启动子有效连接，更优选与GOS2启动子有效连接，最优选与如SEQ IDNO: 34所示的来自稻的GOS2启动子有效连接。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码AMT多肽的核酸序列来自不等鞭毛门，优选来自硅藻纲，更优选来自羽纹目，最优选来自三角褐指藻。
8.构建体，其包含: (a)编码权利要求1或2所定义AMT多肽的核酸序列； (b)能驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种控制序列；和任选的 (C)转录终止序列。
9.根据权利要求8的构建体，其中所述控制序列为植物组成型启动子，优选GOS2启动子，更优选如SEQ ID NO:34所示的GOS2启动子。
10.根据权利要求8或9的构建体在用于产生与对照植物相比具有提高的产量相关性状之植物的方法中的用途，其中所述提高的产量相关性状为以下一种或多种:提高的早期活力、提闻的地上部分生物量、提闻的根生物量、提闻的每株植物种子总广量、提闻的种子饱满率、提高的饱满种子数或提高的收获指数。
11.用于产生与对照植物相比具有提高的产量相关性状的转基因植物的方法，其包括: (i)在植物、植物部分或植物细胞中引入并表达编码权利要求1或2所定义AMT多肽的核酸序列，其处于植物组成型启动子的控制之下；和 (ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞、植物部分或植物。
12.编码权利要求1或2所定义AMT多肽的核酸序列在提高植物产量相关性状中的用途，所述提高的产量相关性状包括以下一种或多种:提高的早期活力、提高的地上部分生物量、提闻的根生物量、提闻的每株植物种子总广量、提闻的种子饱满率、提闻的饱满种子数和提闻的收获指数。
【文档编号】C12N15/82GK103773795SQ201310734030
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2008年11月21日 优先权日:2007年11月22日
【发明者】V·弗兰卡德, A·艾伦, C·鲍勒 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司