专利名称：一种用于肝癌药敏检测的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种抗肿瘤药敏测试的装置，具体地说，涉及一种用于肝癌药敏检测的试剂盒。
背景技术：
原发性肝癌(primary liver cancer, PLC,简称肝癌)是常见恶性肿瘤，由于起病隐匿，早期没有症状或症状不明显，进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难，预后很差，如果仅采取支持对症治疗，自然生存时间很短，严重地威胁人民群众的身体健康和生命安全。原发性肝癌主要包括肝细胞癌(HCC)、肝内胆管细胞癌(ICC)和肝细胞癌、肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，在其发病机制、生物学行为、组织学形态、临床表现、治疗方法以及预后等方面均有明显的不同，其中HCC占到90%以上。目前，肝癌的治疗主要有外科治疗、局部治疗、放射治疗和系统治疗(全身治疗)等几种方式。其中系统治疗和局部治疗中的肝动脉介入治疗涉及到化疗。肝动脉介入治疗的适用人群:⑴不能手术切除的中晚期原发性肝癌患者；⑵可以手术切除，但由于其他原因(如高龄、严重肝硬化等)不能或不愿接受手术的患者。对于上述患者，介入治疗可以作为非手术治疗中的首选方法。国内的临床经验表明，肝动脉介入治疗对于包膜比较完整的巨块型肝癌和大肝癌具有一定的效果，但是对于可以手术切除的肝癌，优先选择外科切除。肝动脉介入治疗根据治疗操作的不同，通常分为:(I)肝动脉灌注化疗(TAI);仔细分析造影表现，明确肿瘤的部位、大小、数目以及供血动脉后，超选择插管至肿瘤供血动脉内给予灌注化疗，常用化疗药物有阿霉素(ADM)或表阿霉素(EADM)、顺钼(PDD)、氟尿嘧啶(5-FU)、羟基喜树碱(HCPT)以及丝裂霉素(MMC)等。(2)肝动脉栓塞(TAE):临床上常用，应尽可能采取超选择插管，并且注意选择合适的栓塞剂。一般采用超液化乙碘油与化疗药物充分混合成乳剂，碘油用量应根据肿瘤的大小、血供情况、肿瘤供血动脉的多寡酌情掌握，也可以选用其他栓塞剂，如明胶海棉、永久性颗粒和微球等。(3)肝动脉栓塞化疗(TACE):同时进行肝动脉灌注化疗(TAI)和肝动脉栓塞(TAE)治疗，以提高疗效。TACE作为一线非根治性治疗，国内临床上最常用。TACE治疗HCC主要是基于肝癌和正常肝组织血供的差异，即95% 99%的肝癌血供来自肝动脉，而正常肝组织血供的70% 75%来自门静脉，肝动脉血供仅占20% 25%。TACE能有效阻断肝癌的动脉供血，同时持续释放高浓度的化疗药物打击肿瘤，使其缺血坏死并缩小，而对正常肝组织影响较小。尽管化疗在恶性肿瘤的治疗中占有非常重要的地位，但是在临床实践中，结果往往不尽如人意。其中，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致肿瘤化疗失败的常见因素，也是困扰肿瘤治疗的关键性难题。耐药问题是极为普遍的临床问题，据美国癌症协会估计，90%以上因肿瘤死亡的患者在不同程度上受到耐药影响。
肿瘤细胞耐药分为原发性和获得性耐药两大类。目前临床上通常的做法是，根据国际肿瘤临床试验的循证研究结果，得知不同的化疗药物对不同肿瘤的治疗敏感性不同，即每一种肿瘤有相应有效的化疗药物敏感谱，从而选择疗效最高的化疗单药或多种药物组成的联合方案进行治疗。但在临床上经常碰到这样的情况，经循证研究公认为对某种肿瘤有效的治疗方案，而对有的患者却毫无效果。如阿霉素对浸润性乳腺癌是一种具有里程碑意义的治疗药物，但仍有50%的浸润性乳腺癌病人对这种药不敏感。又如健择，对肝癌公认的疗效明显，但也有60%以上的病人疗效并不明显。肿瘤对各种化疗药物存在着明显的个体差异。即不同的肿瘤类型或同一类型的不同病人，甚至同一病人在不同的发病阶段，对化疗的敏感性并不完全相同，治疗效果差别也很大。至今还没有一种化疗药物或几种化疗药物的联合应用，能对某一种肿瘤100%有效。临床上，用同一种化疗药物或同一种化疗方案治疗不同的肿瘤患者，显然带有一定的盲目性。因此，在化疗前针对不同的患者进行肿瘤药敏试验来选择有效化疗药物进行化疗显得十分必要。为此,建立一种像细菌敏感试验一样,通过相对可靠的敏感试验方法,对不同的病人准确筛选敏感的化疗药物，并确定其剂量，真正实现临床的个体化用药。目前肿瘤药敏试验操作所需的药物以临用现配为主，肿瘤药敏试验需要测试多种抗肿瘤药物，药液配制稀释繁琐，且肿瘤药敏试验所需抗肿瘤药物剂量小，取样不便。部分药物溶液状态下保存时间短，剩余部分只能报废，造成药物的浪费，尤其是价格昂贵的药物。CN93111551.5公开了肿瘤化疗药物敏感预测试剂配制方法及试剂盒，该专利将8种常用抗肿瘤药物按设定剂量预装于标本瓶内。但该方法不便于联合化疗方案的测试，且不便于方案的剂量调整。CN03102260.X采用预制药敏检测板的方法，将抗肿瘤药物按计算剂量加入检测板内，冻干、包装，用于肿瘤药敏试验。该方法同样不便于联合化疗方案的测试，且不便于方案的剂量调整。
临床目前有少量采用抗肿瘤药物临时配制的方法进行抗肿瘤药物药敏测试，但是，该方法存在许多问题:配制药物的准确浓度未知，所配制药液的准确性存疑；临床口服抗肿瘤药物的抗肿瘤药物药敏测试无法进行；个体操作误差大。为了便于肿瘤药敏试验的操作以及节约成本，我们将各种常用的肝癌抗肿瘤药物制备成剂量准确、稳定性好、能够在肿瘤细胞培养液中快速溶解的无菌药膜，并将药膜按使用剂量进行准确的切片，分装。
实用新型内容本实用新型涉及一种抗肿瘤药敏测试的装置，具体地说，涉及一种用于肝癌药敏测试的试剂盒。本实用新型技术方案如下:一种肝癌药敏检测的试剂盒，由盒体、药敏测试件、标示卡和说明书组成，药敏测试件、标示卡和说明书置于盒内，其特征在于所述的药敏测试件包括肝癌药物药膜、空白药膜和细胞培养板。上述所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏测试件还包括药物活化酶包装。上述所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏测试件中，肝癌药物药膜和空白药膜与细胞培养板按设定化疗方案预装形成预装培养板。上述所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏测试件中，肝癌药物药膜和空白药膜分别以独立包装和细胞培养板组成了可调式的套装培养板。上述所述的试剂盒，其特征在于所述的肝癌药物药膜选自氟尿嘧啶膜、阿霉素膜、表阿霉素膜、顺钼膜、羟基喜树碱膜、丝裂霉素膜、索拉非尼膜、亚砷酸膜、奥沙利钼膜中一种或者两种以上。上述所述的试剂盒，其特征在于所述的细胞培养板为24孔细胞培养板。作为优选，上述所述的试剂盒，其特征在于所述的预装培养板是肝癌药敏检测板，其为预装24孔培养板，孔预装药膜如下:2个孔中预装空白药膜2个孔中预装氟尿嘧啶膜2个孔中预装阿霉素膜2个孔中预装表阿霉素膜2个孔中预装顺钼膜2个孔中预装羟基喜树碱膜2个孔中预装丝裂霉素膜2个孔中预装索拉 非尼膜2个孔中预装亚砷酸膜2个孔中预装奥沙利钼膜和氟尿嘧啶膜4个孔中无药膜。本实用新型是一种用于肝癌抗肿瘤药敏测试的试剂盒，试剂盒中药敏测试件包装形式为将肝癌药物药膜与24孔细胞培养板按设定化疗方案预装的预装培养板和独立的药膜包装与空白24孔细胞培养板组合的可调式套装两种。每个可调式套装中含有一个肝癌常用的抗肿瘤药物药膜包装盒、一个细胞培养板。药膜包装上有每一种药膜的代号，每个细胞培养板附带一张标示卡，用于标记各孔内的药物成分。各种抗肿瘤药膜和空白药膜均分别置于独立的无菌有盖小塑料盒内，再将小塑料盒按顺序装入大塑料盒内。各种药物活化酶均分别置于独立的无菌有盖小塑料盒内，再将小塑料盒按顺序装入大塑料盒内。细胞培养板为24孔细胞培养板，标示卡为24格，用于标记各孔内的药物成分。使用时，将空白对照、空白药膜对照和各种化疗方案分别标记于标示卡上，按标示卡内容向细胞培养板内添加药膜，加入肿瘤细胞悬液，振荡使药膜溶解混匀。预装培养板所设定的化疗方案参考最新的诊疗指南的标准化疗方案制订。按设定方案将药膜装入培养板各孔中。本实用新型中所述的药物药膜，通常地，药物药膜按重量百分比含0.0001% 30%抗肿瘤药物、50% 98%成膜材料和I % 20%增塑剂。其中，所述的成膜材料包括但不限于聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯胺类、聚乙烯氨基缩醛衍生物、聚乙烯吡啶衍生物、明胶、阿拉伯胶、虫胶、琼脂、海藻酸及其盐、玉米朊、淀粉、糊精、白芨胶等。优选使用聚乙烯醇04-88和聚乙烯醇05-88。所述的增塑剂选自甘油、聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、山梨醇、柠檬酸三乙酯等。本实用新型中所述的药物药膜，可以用本领域中常规方法制备，例如可以按如下方法制得肝癌药物药膜:(I)将成膜材料加入水中，搅拌溶解或加热溶解；(2)加入增塑剂和抗肿瘤药物，搅拌溶解均匀，采用加热、静置或超声等方式脱气;(3)将上述溶液涂布 于制膜设备，采用热风或冷风等方式干燥；(4)脱膜，测定含量，并按照测定结果进行分剂量分割；(5)将分割后的药膜采用放射线照射灭菌或环氧乙烷灭菌,优选放射线照射灭菌。各种肿瘤化疗药物药膜参考药物在人体内的血浆峰值浓度制备，根据药膜含量测定结果，将每片药膜切割为含Iml血浆峰值浓度的化疗药物，空白药膜切割面积1cm2。为了便于肿瘤药敏测试的操作，药膜需要能快速溶解于肿瘤细胞培养液中。因此成膜材料要易于溶解，膜的厚度和面积要控制在合适的范围，保证溶解速度和机械强度。厚度优选0.04mm 0.15mm。形状可为圆形、正方形或长方形,面积优选为0.5cm2 16cm2,以适应相应规格的细胞培养板。本发明Icm2大小的膜剂可在Iml培养液中于100秒内溶解。所述的空白药膜，是指不含肝癌药物的药膜，可以按照上述肝癌药物药膜方法进行制备，但不加入肝癌药物。本实用新型在进行肝癌药敏测试中，不仅提高肿瘤药敏测试的操作效率，使操作简便，而且大大提高了药敏测试的准确性，大大减少测试药物用量，节约用药成本，提高药敏测试的经济性，特别是，本实用新型特别适用于联合化疗的药敏测试。
图1:实施例1试剂盒中肝癌药敏检测预装24孔培养板俯视图图2:实施例1试剂盒中肝癌药敏检测预装24孔培养板平视图图3:实施例1试剂盒中标示卡其中:图1、2中,A-D为培养板的孔行号，1-6为培养板的孔列号,孔对应的行号和列号的组合即为孔的编号，例如:A6孔表不培养板的第A行第6列的孔。图3中,标不卡中每格编号,对应于培养板的孔编号。培养板各孔中，预装药膜如下:A1-A2空白(无药膜,空白对照)A3-A4空白药膜(药膜不含药物，空白药膜对照)A5-A6氟尿嘧啶膜B1-B2阿霉素膜B3-B4表阿霉素膜B5-B6 顺钼膜C1-C2羟基喜树碱膜C3-C4丝裂霉素膜C5-C6索拉非尼膜[0068]D1-D2亚砷酸膜D3-D4奥沙利钼膜和氟尿嘧啶膜D5-D6空白无药膜。
具体实施方式
实施例1:用于肝癌药物药敏检测试剂盒本实用新型试剂盒，由盒体、肝癌药敏检测预装24孔培养板(图1、2)、标示卡(图3)和说明书组成。肝癌药敏测试预装24孔培养板、标示卡和说明书置于盒中。说明书是解释和介绍试剂盒，便于使用者正确使用本试剂盒。于化疗前取I例患者的肝癌新鲜组织块(0.5 Icm3)，置于无菌生理盐水中(含20万单位/ml青霉素、25万单位/ml链霉素)，在超净工作台上，剪除脂肪、纤维等正常组织，以及坏死和血污组织，用带抗生素的生理盐水冲洗干净组织，加入组织消化酶(胰酶、胶原酶)消2 3h，使组织块成为单个细胞漏过铜网，离心弃上清，加RPMI1640培养液吹打成细胞悬液，计数并调细胞浓度至I X 106/ml。细胞悬液种于预装24孔培养板(图1或2)中(lml`/孔)，振荡使药膜溶解混匀，并在标示卡(图3)中记录。37°C、5%二氧化碳饱和湿度培养24小时。离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。用冷PBS洗涤细胞两次(2000RPM，离心时间5min收集细胞)。用400μ11Χ Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为lX106/ml。在细胞悬浮液中加入5 μ I Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2_8°C避光条件下孵育15分钟。加入10 μ I PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。在I小时内用流式细胞仪检测对照组及药物组细胞凋亡及坏死的数量，计算药物的抑制率，评估药物的敏感度。结果见表
1表I供筛选化疗方案的抑制率
权利要求1.一种用于肝癌药敏检测的试剂盒，由盒体、药敏测试件、标示卡和说明书组成，药敏测试件、标示卡和说明书置于盒内，其特征在于所述的药敏测试件包括肝癌药物药膜、空白药膜和细胞培养板。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，如果需要，所述的药敏测试件还可包括药物活化酶包装。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏测试件中，肝癌药物药膜和空白药膜与细胞培养板按设定化疗方案预装形成预装培养板。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏测试件中，肝癌药物药膜和空白药膜分别以独立包装和细胞培养板组成了可调式的套装培养板。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的肝癌药物药膜选自氟尿嘧啶膜、阿霉素膜、表阿霉素膜、顺钼膜、羟基喜树碱膜、丝裂霉素膜、索拉非尼膜、亚砷酸膜、奥沙利钼膜中一种或者两种以上。
6.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的细胞培养板为24孔细胞培养板。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的预装培养板是肝癌药敏检测板，其为预装24孔培养板，孔预装药膜如下: 2个孔中预装空白药膜 2个孔中预装氟尿嘧啶膜 2个孔中预装阿霉素膜 2个孔中预装表阿霉素膜 2个孔中预装顺钼膜 2个孔中预装羟基喜树碱膜 2个孔中预装丝裂霉素膜` 2个孔中预装索拉非尼膜 2个孔中预装亚砷酸膜 2个孔中预装奥沙利钼膜和氟尿嘧啶膜 4个孔中无药膜。
专利摘要本实用新型提供一种用于肝癌药敏检测的试剂盒，由盒体、药敏测试件、标示卡和说明书组成，其特征在于所述的药敏测试件包括肝癌药物药膜、空白药膜和细胞培养板，其中，肝癌药物药膜和空白药膜与细胞培养板按设定化疗方案预装形成预装培养板，或者肝癌药物药膜和空白药膜分别以独立包装和细胞培养板组成了可调式的套装培养板。本实用新型在进行肝癌抗肿瘤药敏检测中，不仅提高肿瘤药敏测试的操作效率，使操作简便，而且大大提高了药敏测试的准确性，大大减少测试药物用量，节约用药成本，提高药敏测试的经济性，特别是也适用于联合化疗的药敏检测。
文档编号C12M1/34GK203144406SQ2013201606
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者朱美霞, 张发明, 戚文荣, 邱瑞宝, 吴明辉, 邓钢, 陶征宇 申请人:苏州麦克威尔生物医药科技有限公司