Cd3结合多肽的制作方法

Cd3结合多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与CD3特异性结合或相互作用的单特异性和多特异性多肽。这些多肽可以是，但不限于：抗体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体、双链抗体、双可变域结合蛋白和含有抗体或抗体片段的多肽。在一个实施方案中，多特异性多肽结合T细胞上的T细胞受体复合物和肿瘤抗原以诱导靶依赖性T细胞细胞毒性、活化和增殖。
【专利说明】GD3结合多狀
[0001] 相关申请
[0002] 本发明涉及2012年4月20日提交的标题为"Prostate-Specific Membrane Antigen Binding Proteins And Related Compositions And Methods" 的 PCT 申请 PCT/ US12/034575,所述PCT申请要求2011年4月22日提交的美国临时专利申请61/478, 449 的优先权，且还涉及美国申请号61/636, 557,该三个文献全部以全文引用的方式并入。 发明领域
[0003] 本发明涉及结合CD3或与其相互作用的单特异性和多特异性蛋白治疗剂。这包括 抗体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体和含有抗体或抗体片段的多肽。
[0004] 随附序列表
[0005] 与本文一起以电子形式提交的文本文件（名称："2479_113PC03_ SequenceListing_ascii. txt"，大小：459, 722 字节；创建日期：2013 年 4 月 16 日）的内容 以全文引用的方式并入本文中。
[0006] 背景
[0007] 用抗CD3单克隆抗体靶向人T细胞上的TCR复合物已经用于或提议用于治疗自体 免疫疾病和相关病症，诸如用于治疗器官同种异体移植排斥。对人CD3特异性的小鼠单克 隆抗体，诸如〇KT3(Kung等（1979)Science 206:347-9)是所述治疗的第一代。尽管0KT3 具有强免疫抑制效能，但与其免疫原性和促有丝分裂潜力相关的严重副作用妨碍了其临床 使用（Chatenoud (2003) Nature Reviews 3:123-132)。它诱导抗球蛋白反应，从而促进其自 身快速清除和中和（Chatenoud 等（1982)Eur. J. Immunol. 137:830-8)。另外，0KT3 在体外 诱导T细胞增殖和细胞因子产生，且在体内导致细胞因子的大规模释放（Hirsch等（1989) J. Immunol 142:737-43,1989)。细胞因子释放（也称为"细胞因子风暴"又导致以发烧、寒 战、头疼、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、无菌性脑膜炎和血压过低为特征的"流感样"综合征 (Chatenoud，2003)。所述严重副作用限制了 0KT3更广泛地用于移植中以及将其用途扩展 到其它临床领域，诸如自体免疫性（同上）。
[0008] 为了减少第一代抗⑶3单克隆抗体的副作用，已经不仅通过鼠类抗⑶3单克隆抗 体的将互补性决定区（⑶R)移植到人IgG序列中，而且通过将非FcR结合突变引入到Fc中 以减少细胞因子风暴的发生而开发出了第二代经基因工程改造的抗⑶3单克隆抗体（Cole 等（1999) Transplantation 68:563 ;Cole 等（1997) J. Immunol. 159:3613)。还参见 PCT 公 布号W02010/042904,该文献以全文引用的方式并入本文中。
[0009] 除了靶向CD3的单特异性治疗剂以外，选择性地结合T细胞和肿瘤细胞的多特异 性多肽也能提供重定向T细胞细胞毒性以针对肿瘤细胞和治疗癌症的机制。然而，设计双 特异性或多特异性T细胞募集抗体的一个问题在于维持特异性而同时通过多个调整路径 而越过T细胞活化规则。
[0010] 仍然需要改良的抗CD3单特异性和多特异性分子。尽管先前已经对CD3靶向分子 的Fc部分进行了改良以降低细胞因子风暴的可能性，但仍需要与现有技术分子相比具有 增加的半衰期、可以有效地制造、展现改良的T细胞结合和/或改良的重定向T细胞细胞毒 性（在设计用于治疗癌症的多特异性分子的情况下）的抗CD3治疗剂。
[0011] 发明概述
[0012] 在一个方面，本发明包括一种⑶3结合多肽，其包含与具有氨基酸序列SEQ ID N0:41的结合域相比具有降低的等电点的CD3结合域。在某些实施方案中，所述CD3结合 域包含VH和VL区，VH和VL区各自含有构架区。为了降低所述结合域和/或多肽的等电 点（Pl)，可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨 基酸来修饰构架区中的两个或更多个氨基酸。举例来说，可以用S取代R和T，可以用E取 代Q，可以用F取代Y，且可以用V取代T。在一个实施方案中，例如，为了降低免疫原性的风 险，取代到序列中的氨基酸是人生殖细胞系IgG序列中普遍存在的或包含在人生殖细胞系 序列中的相同或邻近的位置，例如在对应的人生殖细胞系IgG序列中。在一些实施方案中， 所述人生殖细胞系IgG序列包含SEQ ID NO:43或44。
[0013] 在本发明的另一个实施方案中，所述CD3结合多肽在前铰链区（prehinge region)中包含能降低所述前铰链区或整个多肽的pi的修饰。所述前铰链区处于所述结合 域与铰链区之间的接合处。举例来说，可以用序列SSS置换具有序列RRT的三氨基酸前铰 链区以降低等电点。在一些实施方案中，前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3结合多肽相 比具有降低的等电点。
[0014] 可以设计CD3结合多肽以便例如通过使VH和/或VL区和/或前铰链区的构架区 突变来降低等电点。等电点可以降低〇. 5到2. 5或更多个单位。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，所述CD3结合多肽是抗体，例如人源化抗体。在另一 个实施方案中，它是一种小模块式免疫药物蛋白（SMIP)。在一些实施方案中，CD3结合多肽 包含单链可变片段（scFv)。
[0016] 在另一个实施方案中，它是多特异性或双特异性多肽。举例来说，所述CD3结合多 肽可以包含CD3结合域和肿瘤抗原结合域。在一个实施方案中，所述双特异性或多特异性 分子重定向T细胞细胞毒性以针对肿瘤细胞。
[0017] 在本发明的另一个实施方案中，所述CD3多肽作为同源二聚体或异源二聚体存 在。
[0018] 附图简述
[0019] 图1是描绘先前产生的人源化Cris-7SMIP多肽的理论pi与约200种其它SMIP 多肽的理论pi相比较的图。
[0020] 图2A和2B说明了包含比本发明的⑶3多肽高的Pl的⑶3结合SMIP多肽的剪接。 图2A是能定量经过纯化的蛋白质的低分子量剪接段含量的SDS毛细管电泳。图2B含有剪 接型CD3SMIP分子的说明。图2B中所示的序列对应于SEQ ID N0:4的氨基酸252-260、SEQ ID NO:4 的 243-252 和 SEQ ID NO:240 的 251-260。
[0021] 图3是Cris-7小鼠 VH与衍生的人源化VH序列的氨基酸序列比对。Cris7VH小鼠、 H1、H2、H3、H4、H5、H6 和共有序列分别对应于 SEQ ID N0:45、22、24、26、28、30、32 和 229。
[0022] 图4是Cris-7小鼠 VL与衍生的人源化VL序列的氨基酸序列比对。Cri s7VL小 鼠、L1、L2、L3、L4和共有序列分别对应于SEQIDN0:46、34、36、38、40和 230。
[0023] 图5是H3与生殖细胞系序列IGHV1-69*01和IGHV3-30*01的氨基酸序列比对。 H3、IGHV1-69*01、IGHV3-30*01 和共有序列分别对应于 SEQ ID N0:26、43、44 和 331。
[0024] 图6是生殖细胞系序列的VL区的J κ区IGKVl-5*01与LI的氨基酸序列比对。所 述VL区的Jk区（IGKVI-5*01)、L1链和共有序列分别对应于SEQ ID NO:232、34和233。 所列出的 IGKJ1*01、IGKJ2*01、IGKJ3*01、IGKJ4*01 和 IGKJ5*01 序列分别对应于 SEQ ID NO:234-238。
[0025] 图7A和7B描绘了与DRA209相比具有降低的理论pi的各种CD3结合多肽SMIP 分子的氨基酸序列比对。针对 DRA209、DRA219、DRA222、DRA221、DRA223、DRA224、DRA225 和 共有序列所列出的序列分别对应于SEQ ID N0:4的氨基酸1-423、SEQ ID N0:6的氨基酸 1-423、SEQ ID N0:8 的氨基酸 1-423、SEQ ID N0:10 的氨基酸 1-423、SEQ ID N0:12 的氨基 酸l-423、SEQIDN0:14的氨基酸l-426、SEQIDN0:16和SEQIDN0:239 的氨基酸l-426。
[0026] 图8是pi变体DRA233和DRA234与DRA161相比的氨基酸序列比对。针对DRA161、 DRA233、DRA234和共有序列所列出的序列分别对应于SEQ ID N0:240、18、20和241。
[0027] 图9是如何确定经验pi值的说明。
[0028] 图10是显示DRA209SMIP和scFv的经验pi的图。
[0029] 图11是显示DRA161SMIP与pi变体DRA233和DRA234相比的经验pi的图。
[0030] 图12是显示用与DRA209和DRA161相同（DRA227除外）的方式结合T细胞的SMIP Pl变体的图。DRA227SMIP用作对照且它不含⑶3或T细胞结合域。各分子名称之后的字 母"a"指示特定分子是在CHO细胞中产生且四位数是批次编号。
[0031] 图13描绘了非还原型SDS-PAGE的图像，显示⑶3结合SMIP构建体DRA233和 DRA234与SMIP DRA161(它与DRA209共享相同的VH和VL)相比不那么倾向于破碎。
[0032] 图14描绘了还原型SDS-PAGE的图像，显示CD3结合SMIP构建体DRA233和DRA234 与SMIP DRA161(它与DRA209共享相同的VH和VL)相比不那么倾向于破碎。
[0033] 图15是显示pi变体DRA233和DRA234主要是完整表达（例如，不进行剪接）的 图和表。
[0034] 图16是显示DRA161 (经过纯化）的非还原型CE-SDS的图像。
[0035] 图17显示了 DRA234和DRA233的PK研宄的数据。
[0036] 图18提供了来自于如实施例14中所描述的DRA233和DRA234的WinNonLin分析 的数据。
[0037] 图19是DRA233和DRA234的PK估计值的表格。
[0038] 图20是DRA161与DRA233 (存在和不存在504小时时间点）和DRA234相比的PK 参数的表格。
[0039] 图21描绘了得自于使用不同的靶向CD19的同源二聚体双特异性多肽分子的靶依 赖性T细胞增殖测定的结果。图21A和21B分别示出了如实施例10中所描述的CD4+T细 胞增殖和CD8+T细胞增殖的结果。
[0040] 图22描绘了得自于使用不同的靶向CD19的异源二聚体双特异性多肽分子的靶依 赖性T细胞增殖测定的结果。图22A和22B分别示出了如实施例10中所描述的CD8+T细 胞增殖和CD4+T细胞增殖的结果。
[0041] 图23描绘了得自于使用不同的靶向CD19的多肽异源二聚体和同源二聚体的重定 向T细胞细胞毒性测定的结果。图23A示出了同源二聚双特异性多肽TSC129a、TSC233和 TSC234的结果。图23B示出了异源二聚双特异性多肽TSC127、TSC227和TSC228的结果。
[0042] 图24描绘了得自于使用靶向RON的不同的双特异性多肽同源二聚体TSC275、 TSC277、TSC278和TSC279的重定向T细胞细胞毒性测定的结果。
[0043] 图25描绘了双特异性多肽异源二聚体和同源二聚体的T细胞结合的结果。图25A 和25B示出了双特异性分子TSC228(异源二聚体）和TSC249(同源二聚体）与Jurkat细 胞的剂量依赖性结合。
[0044] 图26描绘了靶向PSM的多肽同源二聚体的靶依赖性T细胞增殖的结果。图26A示 出了在用TSC249处理后表达靶PSMA抗原的C4-2B细胞的结果。图26B示出了在用TSC249 处理后不表达靶PSMA抗原的DU-145细胞的结果。图26C示出了当用TSC249处理经分离 的T细胞时的结果。
[0045] 图27描绘了得自于使用靶向PSM的同源二聚双特异性多肽TSC194和TSC249的 重定向T细胞细胞毒性测定的结果。
[0046] 发明详述
[0047] 本发明提供了与现有技术CD3结合多肽相比具有改良的特征的CD3结合多肽。已 经通过修饰重链和/或轻链框架区和/或前铰链前铰链区中的氨基酸以降低分子的等电点 而设计了本发明的分子以展现降低的等电点。在一个实施方案中，修饰是在VL区的Jk区 中进行。在一些实施方案中，修饰是通过用具有中性电荷的氨基酸取代具有正电荷的氨基 酸和/或用具有负电荷的氨基酸取代具有中性电荷的氨基酸来进行。
[0048] 在一些实施方案中，本发明的CD3结合多肽的理论pi比抗CD3DRA209SMIP(SEQ ID N0:4)低约0. 5到2. 5个单位。举例来说，DRA209的理论pi是9,而pi变体DRA219(SEQ ID NO:6)的理论 pi 是 8.4，DRA221(SEQ ID N0:10)的理论 pi 是 8.2，DRA222(SEQ ID NO:8) 的理论 pi 是 7. 5, DRA223(SEQ ID NO:12)的理论 pi 是 7. 2,且 DRA224(SEQ ID N0:14)的 理论pi是6. 8。在一些实施方案中，⑶3结合多肽的经验等电点比多肽SEQ ID N0:4低至 少1个pi单位。
[0049] 令人惊讶的是，pi变体展现了改良的半衰期且在CHO细胞中表达得比DRA209更 好，例如，参见以下实施例4,所述实施例描述了用于测量半衰期的方法。此外，与具有诸如 DRA209结合域等其它抗⑶3结合域的类似构建体相比，包含DRA222scFv的多特异性构建体 展现了改良的性质（参见相关PCT公布号W02012/145714)。
[0050] 本文中所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题。本 文中所引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍和专著，都 以全文引用的方式明确并入在此以用于任何目的。在所并入的文献或文献的部分中的一者 或多者的术语定义与本申请中的术语定义相矛盾的情况下，以本申请中出现的定义为准。
[0051] 除非另外指出，否则在本发明描述中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整 数范围都应理解为包括所述范围内的任何整数值，且当适当时，包括其分数（诸如整数的 十分之一和百分之一）。除非另外指出，否则如本文中所使用，"约"意指所指示范围、值或 结构的±20%。应理解，除非另外指出，否则如本文中所使用的术语"一个"和"一种"是指 所枚举的组分中的"一个（种）或多个（种）"。使用代替性用词（例如"或"）应理解为意 指代替物之一、两者或其任何组合。如本文中所使用，术语"包括"和"包含"以同义使用。 另外，应理解，本申请对包含本文中所描述的组分（例如域或区）和取代基的各种组合的多 肽的公开程度就如同个别地阐述各多肽。因而，个别多肽的特定组分的选择在本公开的范 围内。
[0052] 如本文中所使用，术语"结合域"或"结合区"是指能够特异性识别和结合诸如抗 原、配体、受体、底物或抑制剂（例如CD3或肿瘤相关抗原，诸如RON、CD19、CD37或PSMA)等 靶分子的蛋白质、多肽、寡肽或肽的域、区、部分或位点。示例性结合域包括单链抗体可变区 (例如域抗体、sFv、scFv和scFab)、受体胞外域和配体（例如细胞因子、趋化因子）。在某 些实施方案中，结合域包含以下各项或由以下各项组成：抗原结合位点（例如包含来自于 置于交替构架区（FR)(例如任选地包含一个或多个氨基酸取代的人FR)中的抗体的可变重 链序列和可变轻链序列或三个轻链互补决定区（⑶R)和三个重链⑶R)。已知多种用于鉴别 本公开的特异性结合特定靶的结合域的测定，包括Western印迹、ELISA、噬菌体展示文库 筛选和BIACORE?.互相作用分析。如本文中所使用，⑶3结合多肽可以具有"⑶3结合域" 和任选地存在的"第二结合域"。CD3结合域可以位于氨基或羧基末端。在某些实施方案中， CD3结合域包含来源于小鼠单克隆抗体（例如Cris-7或HuM291)的人源化scFv。举例来说， CD3结合域可以由源自于小鼠单克隆抗体的VH区和VL区构成，其中用诸如（Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO:76)连接子等连接子接合VH区与VL区。在其它实施方案中，CD3结合域实质上由或 由源自于小鼠单克隆抗体的人源化scFv组成。在一些实施方案中，本发明的CD3结合域包 含鼠类Cris-7抗体或HuM291的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
[0053] 如果结合域以等于或大于IO5M4的亲和力或Ka(S卩，特定结合相互作用的平衡缔合 常数，单位是1/M)结合靶标而不显著结合测试样品中存在的其它组分，则它"特异性结合" 靶标。结合域可以分类为"高亲和力"结合域和"低亲和力"结合域。"高亲和力"结合域 是指具有至少IO 7M'至少IO8M'至少IO9M'至少IOkiM'至少IO 11M'至少IO12M4或至少 IO13Ml^ Ka的那些结合域。"低亲和力"结合域是指具有最多10 7M'最多IO6M'最多IO5M4 的Ka的那些结合域。或者，亲和力可以定义为特定结合相互作用的平衡解离常数（Kd)，单 位为M(例如KT 5M到I(T13M)。根据本公开的结合域多肽和单链多肽的亲和力可以使用常规 技术容易地测定（参见例如Scatchard等（1949) Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660 ;和美国专利 号 5, 283, 173、5, 468, 614 或等效物）。
[0054] 本领域中已知"CD3"为六个链的多蛋白复合物（参见例如Abbas和 Lichtman, 2003 Janeway等，第172和178页，1999)，所述六个链是T细胞受体复合物的 亚单元。在哺乳动物中，T-细胞受体复合物的⑶3亚单元是⑶3γ链、⑶3 δ链、两个⑶3 ε 链和CD3G链同源二聚体。CD3y、CD3S和CD3e链是含有单个免疫球蛋白域的免疫球蛋 白超家族的高度相关细胞表面蛋白。CD3y、CD3 δ和CD3 ε链的跨膜区带负电，这是允许这 些链与带正电的T细胞受体链缔合的特征。CD3y、CD3S和CD3e链的细胞内尾部各自含 有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基元或ITAM的单个保守基元，而各CD3 ζ链具有三个。 相信ITAM对于TCR复合物的信号传导能力是重要的。如本公开中所使用的CD3可以来自 于不同的动物物种，包括人、猴子、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
[0055] 如本文中所使用，"保守取代"在本领域中被公认为一个氨基酸取代具有相似性质 的另一个氨基酸。示例性保守取代在本领域中是众所周知的（参见例如1997年3月13日 公开的 W097/09433,第 10 页；Lehninger, Biochemistry,第二版；Worth Publishers, Inc. NY:NY(1975),第 71-77 页；Lewin, Genes IV，0xford University Press, NY and Cell PresS，Cambridge，MA(1990)，第8页）。在某些实施方案中，保守取代包括亮氨酸对丝氨酸 取代。
[0056] 如本文中所使用，术语"衍生物"是指在存在或不存在酶的情况下通过化学或生物 学手段，例如通过糖基化、烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成对肽的一个或多个氨基酸残基 的修饰。
[0057] 如本文中所使用，"源自于"指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来 源。在一个实施方案中，源自于特定序列的多肽或氨基酸序列具有实质上与该序列或其一 部分同一的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少 30-50个氨基酸或至少50-150个氨基酸组成；或本领域技术人员可用其它方式鉴别它，因 为在序列中具有其来源。在一个实施方案中，人源化或嵌合结合域源自于由另一个动物产 生的抗体的VH和/或VL。举例来说，人源化结合域或嵌合结合域可能源自于鼠类抗体的 VH和/或VL区。举例来说，可以通过用本领域中已知的方法修饰构架区来进行鼠类抗体的 人源化。
[0058] 源自于另一个多肽的多肽相对于起始多肽可能具有一个或多个突变，例如其一个 或多个氨基酸残基经另一个氨基酸残基取代或其具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。 多肽可能包含非天然存在的氨基酸序列。所述变体与起始多肽必然具有小于100%的序列 同一性或相似性。在一个实施方案中，变体的氨基酸序列与起始多肽的氨基酸序列将具有 约60%到小于100%的氨基酸序列同一性或相似性。在另一个实施方案中，变体的氨基酸 序列与起始多肽的氨基酸序列将具有约75%到小于100%、约80%到小于100%、约85%到 小于100%、约90%到小于100%、约95%到小于100%的氨基酸序列同一性或相似性。
[0059] 如本文中所使用，除非另外规定，否则氨基酸残基在免疫球蛋白分子的可变区 中的位置是根据 Kabat 编号规定（Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Bethesda, MD:Public Health Service, National Institutes of Health(1991))进行编号，且氨基酸残基在免疫球蛋白分子的恒定区中的位置是根据EU命 名法（Ward 等，1995Therap. Immunol. 2:77-94)进行编号。
[0060] 如本文中所使用，术语"二聚体"是指由经由一种或多种形式的分子内力（包括共 价键，例如二硫键；和其它相互作用，例如静电相互作用、盐桥、氢键合和疏水性相互作用） 彼此缔合的两个亚单元组成且在适当条件（例如，在生理条件下，在适合表达、纯化和/或 存储重组蛋白质的水溶液中，或在用于非变性和/或非还原电泳的条件下）下稳定的生物 学实体。如本文中所使用的"异源二聚体"或"异源二聚体蛋白"是指由两个不同的多肽形 成的二聚体。异源二聚体不包括由四个多肽（即，两个轻链和两个重链）形成的抗体。在 本发明的一个实施方案中，使用包含异源二聚域的Emergent的Interceptor平台产生异源 二聚体。如本文中所使用的"同源二聚体"或"同源二聚体蛋白"是指由两个同一的多肽形 成的二聚体。在本发明的某些实施方案中，使用Emergent的SMIP、PIMS或Scorpion平台 产生同源二聚体。
[0061] 如本文中所使用，"铰链区"或"铰链"是指源自于以下的多肽：(a)跨膜蛋白（例 如I型跨膜蛋白）的域间区；或（b) II型C-凝集素的茎部区（stalk region)。举例来说， 铰链区可以源自于免疫球蛋白超家族成员的域间区；这个特定类别内的合适的铰链区包括 (i)免疫球蛋白铰链区（举例来说，由上部区和核心区组成）或其功能变体，包括野生型和 改变的免疫球蛋白铰链；和（ii)连接免疫球蛋白V样或免疫球蛋白C样结构域的区域（或 其功能变体）。
[0062] "野生型免疫球蛋白铰链区"是指在抗体重链中发现的插入在CHl与CH2域之间且 连接CHl与CH2域（对于IgG、IgA和IgD来说）或插入在CHl与CH3域之间且连接CHl与 CH3域（对于IgE和IgM来说）的天然存在的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些实施方 案中，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，且可以包含人IgG铰链区。
[0063] "改变的野生型免疫球蛋白铰链区"或"改变的免疫球蛋白铰链区"是指（a)具有 最多30 %氨基酸变化（例如，最多25 %、20 %、15 %、10 %或5 %氨基酸取代或缺失）的野生 型免疫球蛋白铰链区，或（b)野生型免疫球蛋白铰链区中长度为约5个氨基酸（例如约5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个氨基酸）到最多约 120 个氨基酸（例 如，长度为约10到约40个氨基酸或约15到约30个氨基酸或约15到约20个氨基酸或约 20到约25个氨基酸），具有最多约30%氨基酸变化（例如，最多约25%、20%、15%、10%、 5%、4%、3%、2%或1%氨基酸取代或缺失或其组合）且具有如PCT公布W02011/090762和 W02011/090754中所公开的IgG核心铰链区的部分。
[0064] 如本文中所使用，术语"人源化"是指通过使用基因工程技术使抗体或免疫球蛋白 结合蛋白和源自于非人物种（例如小鼠或大鼠）的多肽对人具有较弱免疫原性，同时仍保 留原始抗体的抗原结合性质的过程。在一些实施方案中，将抗体或免疫球蛋白结合蛋白和 多肽（例如，轻链和重链可变区、Fab、scFv)的结合域人源化。可以使用称为CDR移植的 技术及其变型将非人结合域人源化（Jones等，Nature 321:522 (1986))，所述变型包括"改 型"（Verhoeyen 等，1988Science239:1534-1536 ;Riechmann 等，1988Nature 332:323-337 ; Tempest 等，Bio/Technol 19919:266-271)、"高嵌合"(Queen 等，1989Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033 ;Co 等，1991Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873 ;Co 等，1992J Immunol 148:1149-1154)和"饰面"（Mark 等，"Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti_CD18antibodies.''Metcalf Bff, Dalton BJ 编，Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential.New York: Plenum Press，1994:291-312)。如果源自于非人来源，则抗体或免疫球蛋白结合蛋白和多肽的其它 区，诸如铰链区和恒定区结构域，也可以进行人源化。
[0065] "免疫球蛋白恒定区"或"恒定区"是本文中定义的术语，它是指对应于或源自于部 分或所有的一个或多个恒定区结构域的肽或多肽序列。在一个实施方案中，恒定区含有源 抗体的所有恒定区结构域。在一个实施方案中，恒定区包含IgG CH2和CH3 ±或，例如IgGlCH2 和CH3域。在一些实施方案中，恒定区不包含CHl域。在某些实施方案中，组成恒定亚区的 恒定区结构域是人的。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的恒定区结构域缺乏或具有 极少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)和补体活化和补足依赖性细胞毒性（CDC)的 效应因子功能，而保留结合一些Fc受体（诸如FcRn，即新生儿Fc受体）的能力且在体内保 留相对较长的半衰期。
[0066] 在其它变化方案中，本公开的融合蛋白包括保留ADCC和CDC之一或两者的所述效 应因子功能的恒定域。在某些实施方案中，本公开的结合域与人IgG恒定区（例如IgGl) 融合，其中所述恒定区具有一个或多个以下突变的氨基酸：位置234上的亮氨酸（L234)、位 置235上的亮氨酸（L235)、位置237上的甘氨酸（G237)、位置318上的谷氨酸酯（E318)、 位置320上的赖氨酸（K320)、位置322上的赖氨酸（K322)或其任何组合（根据EU进行编 号）。举例来说，可以将这些氨基酸中的任何一个或多个变成丙氨酸。在另一个实施方案 中，IgG Fc 域（诸如 IgGl)中的 L234、L235、G237、E318、K320 和 K322 (根据 EU 编号）各 自突变成例如丙氨酸（即，分别为L234A、L235A、G237A、E318A、K320A和K322A)和任选地 存在的N297A突变（即，实质上消除CH2域的糖基化）。
[0067] 如这里所使用，术语"小模块式免疫药物蛋白"或"SMIP"用于指总体上如例如美国 专利申请公布号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049中所公开的蛋白质支架，所 述文献以全文引用的方式并入本文中。在本文中，实施例和公开内容全文中所描述的"SMIP 分子"应理解为包含SMIP支架，例如按照从氨基到羧基末端的顺序包含第一结合域、铰链区 和免疫球蛋白恒定区的结合蛋白。"CD3特异性SMIP分子"应理解为包含SMIP支架的CD3 结合蛋白。
[0068] 如这里所使用，术语"PMS"用于指总体上如例如美国专利申请公布号 2009/0148447中所公开的蛋白质支架，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在本文中， 实施例和公开内容全文中所描述的"PMS分子"应理解为包含PMS支架，例如按照从氨基 到羧基末端的顺序包含免疫球蛋白恒定区、铰链区和第一结合域的结合蛋白。"CD3特异性 PMS分子"应理解为包含PMS支架的⑶3结合蛋白。
[0069] "Fc区"或"Fc域"是指对应于或源自于源抗体中负责结合细胞上的抗体受体和 补体上的Clq组分的部分的多肽序列。Fc代表"结晶片段"，即容易形成蛋白质晶体的抗体 片段。最初通过蛋白水解消化描述的独特蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的总体通用结 构。如文献中最初所定义，Fc片段由二硫化物连接的重链铰链区、CH2和CH3域组成。然 而，近来该术语已被应用于由CH3、CH2和足以与第二个这样的链形成二硫化物连接的二聚 体的铰链的至少一部分组成的单链。关于免疫球蛋白结构和功能的回顾，参见Putnam，The Plasma Proteins,第 V 卷（Academic Press, Inc.，1987)，第 49-140 页；和 Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994。如本文中所使用，术语Fe包括天然存在的序列的变体。
[0070] 如本文中所使用，"等电点"或pi是净电荷为零时的pH值。
[0071] 如本文中所使用，术语" Interc印tor"是用于指总体上如PCT公布W02011/090762 和TO2011/090754中所公开的单特异性或多特异性异源二聚蛋白质支架。本文中所描述的 Interc印tor分子应理解为包含两个非同一多肽链的⑶3结合蛋白，各多肽链包含免疫球 蛋白异源二聚域。界面免疫球蛋白异源二聚域是不同的。在一个实施方案中，免疫球蛋白 异源二聚域包含CHl域或其衍生物。在另一个实施方案中，免疫球蛋白异源二聚域包含CL 域或其衍生物。在一个实施方案中，CL域是Ck或CA同种型或其衍生物。
[0072] 如本文中所使用，II型C-凝集素的"茎部区"是指II型C-凝集素的细胞外域 中位于C-型凝集素样结构域（CTLD ;例如，类似于自然杀伤细胞受体的CTLD)与跨膜域之 间的部分。举例来说，在人CD94分子（GenBank登录号AAC50291. 1，PRI，1995年11月30 日）中，细胞外域对应于氨基酸残基34-179,而CTLD对应于氨基酸残基61-176。因此，人 ⑶94分子的茎部区包括氨基酸残基34-60,据发现它处在膜和CTLD之间（参见Boyington 等，Immunity 10:75, 1999 ;关于其它莖部区的描述，也参见Beavil等，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA89:753, 1992 ;和 Figdor 等，Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002)。这些 II 型 C-凝集 素还可以在茎部区与跨膜区或CTLD之间具有6到10个接合氨基酸。在另一个实施例中， 233个氨基酸的人NKG2A蛋白（GenBank登录号P26715. I，PRI，2010年6月15日）具有在氨 基酸71-93范围内的跨膜区和在氨基酸94-233范围内的细胞外域。CTLD由氨基酸119-231 构成，且茎部区包含氨基酸99-116，两侧由五个和两个氨基酸连接。其它II型C-凝集素以 及其细胞外配体结合域、域间或茎部区，和CTLD在本领域中是已知的（关于人CD23、CD69、 CD72、NKG2A 和 NKG2D 和其描述，分别参见例如 GenBank 登录号 NP_001993. 2 ;AAH07037. 1， PRI，2006 年 7 月 15 日；ΝΡ_001773· 1，PRI，2010 年 6 月 20 日；AAL65234. 1，PRI，2002 年 I 月 17 日；和 CAA04925. 1，PRI，2006 年 11 月 14 日）。
[0073] 如本文中所使用，跨膜蛋白（例如I型跨膜蛋白）的"域间区"是指跨膜蛋白的细 胞外域中位于两个相邻结构域之间的部分。域间区的实例包括连接免疫球蛋白超家族成员 的相邻Ig域的区域（例如，来自于IgG、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白铰链区；连接CD2的 IgV域与IgC2域的区域；或连接⑶80或⑶86的IgV域与IgC域的区域）。域间区的另一 个例子是连接⑶22 ( -种结合I型唾液酸的Ig样凝集素）的非Ig域与IgC2域的区域。
[0074] "源自于"11型C-凝集素茎部区或"源自于"跨膜蛋白域间区（例如，免疫球蛋白 铰链区）的多肽区是指约5到约150个氨基酸序列，其整体或一部分包括（i)野生型茎部 区或域间区序列；（ii)野生型茎部区或域间区序列的片段；（iii)与（i)或（ii)具有至少 80%、85%、90%或95%氨基酸序列同一性的多肽；或（iv)其中一、二、三、四或五个氨基酸 具有缺失、插入、取代或其任何组合的（i)或（ii)，例如一个或多个变化是取代，或一个或 多个突变仅包括一个缺失。在一些实施方案中，与野生型茎部区序列，诸如源自于NKG2A、 NKG2D、⑶23、⑶64、⑶72或⑶94的约8到约20、约10到约25或约15到约25个氨基酸的 那些序列相比，茎部区衍生物对蛋白水解裂解更具抗性。
[0075] 如本文中所使用，术语"接合氨基酸"或"接合氨基酸残基"是指多肽的两个相邻区 域或结构域之间，诸如铰链与相邻免疫球蛋白恒定亚区之间，或铰链与相邻结合域之间，或 连接两个免疫球蛋白可变域的肽连接子与相邻免疫球蛋白可变域之间的一个或多个（例 如约2-10个）氨基酸残基。接合氨基酸可以由多肽构建体设计产生（例如，由在构建编 码多肽的核酸分子期间使用限制酶位点产生的氨基酸残基）。结合域与铰链区之间的接 合氨基酸在本文中称为前铰链区，例如，可由添加限制性位点到编码核苷酸序列中而产生。 在一个实施方案中，前铰链区由约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸组成。DRA209 和DRA161的前铰链区序列不是鼠类Cris-7或人免疫球蛋白生殖细胞系序列的一部分。 DRA209和DRA161的前铰链区是氨基酸序列RRT，而对于DRA219、DRA221、DRA222、DRA223、 DRA224、DRA225、DRA228、DRA229、DRA233、DRA234、TSC249、TSC250、TSC25I、TSC252、TSC295、 TSC296、TSC301和TSC302,它是SSS。本发明的结合分子可能包括或可能不包括前铰链区。
[0076] 如本文中所使用，短语"CH3与CHl或CL之间的连接子"是指CH3域（例如野生型 CH3或突变型CH3)的C末端与CHl域或CL域（例如Ck)的N末端之间的一个或多个（例 如约2-12个）氨基酸残基。
[0077] 如本文中所使用，术语"有需要的患者"是指有风险罹患或正罹患能用本文中所提 供的CD3结合蛋白或多肽或其组合物治疗或改善的疾病、病症或病状的患者。
[0078] 如本文中所使用，术语"肽连接子"是指连接重链可变区与轻链可变区且提供与两 个亚结合域的相互作用相容的间隔物功能以使得所得多肽保留对作为包含相同轻链和重 链可变区的抗体的相同靶分子的特异性结合亲和力的氨基酸序列。在某些实施方案中，连 接子由5到约35个氨基酸，例如约15到约25个氨基酸构成。
[0079] 如本文中所使用，术语"药学上可接受的"是指当使用本领域中众所周知的途径施 用时分子实体和组成在大多数受试者中不会产生过敏性或其它严重有害反应。联邦或州政 府的管理机构批准的或美国药典或其它一般公认的药典中登记的供动物且更确切地说供 人使用的分子实体和组成被视为是"药学上可接受的"。
[0080] 如本文中所使用，术语"启动子"是指涉及结合RNA聚合酶以起始转录的DNA区域。
[0081] 如本文中所使用，术语"核酸"、"核酸分子"或"聚核苷酸"是指呈单链或双链形 式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非有具体限制，否则该术语涵盖与参 考核酸具有相似结合性质且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的含有天然核苷酸类 似物的核酸。除非另外指出，否则特定核酸序列还暗含其经保守修饰（例如简并密码子 取代）的变体和互补序列以及明确指示的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过产 生一个或多个选定（或所有）密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的 序列来实现（Batzer 等（1991)Nucleic Acid Res. 19:5081 ;Ohtsuka 等（1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608 ;Cassol 等（1992) ;Rossolini 等（1994)Mol. Cell. Probes8:91-98) 〇 术语核酸与基因、cDNA和由基因编码的mRNA可互换使用。如本文中所使用，术语"核酸"、 "核酸分子"或"聚核苷酸"意在包括DNA分子（例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子（例如 mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物和其衍生物、片段和同源物。
[0082] 术语"表达"是指由核酸编码的产物的生物合成。举例来说，在编码相关多肽的核 酸区段的情况下，表达涉及将核酸区段转录到mRNA中和将mRNA翻译成一种或多种多肽。
[0083] 术语"表达单元"和"表达盒"在本文中可互换使用，且表示编码相关多肽且能够 在宿主细胞中表达核酸区段的核酸区段。表达单元典型地包含转录启动子、编码相关多肽 的开放阅读框和转录终止子，全部呈可操作的构型。除转录启动子和终止子以外，表达单元 可以进一步包括其它核酸区段，诸如增强子或聚腺苷酸化信号。
[0084] 如本文中所使用，术语"表达载体"是指线性或环形核酸分子，其包含一个或多个 表达单元。除一个或多个表达单元以外，表达载体还可以包括其它核酸区段，诸如一个或多 个复制起点或一个或多个可选标记物。表达载体一般源自于质粒或病毒DNA，或可以含有两 者的元件。
[0085] 如本文中所使用，Scorpion是用于指多特异性结合蛋白支架的术语。举例来 说，PCT申请公布号WO 2007/146968、美国专利申请公布号2006/0051844、PCT申请公布 号TO 2010/040105、PCT申请公布号TO2010/003108和美国专利号7, 166, 707中公开了 多特异性结合蛋白和多肽。Scorpion多肽包含两个结合域（所述结构域可以设计用于特 异性结合相同或不同的靶标）、两个连接子和一个免疫球蛋白恒定亚区。PCT申请公布号 W02010/003108中描述了用于Scorpion分子的连接子。在一些实施方案中，连接子序列为 约2-45个氨基酸或2-38个氨基酸或5-45个氨基酸。在一些实施方案中，连接子是抗体铰 链区（例如来自于IgG)或C-凝集素茎部区。Scorpion蛋白是包含两个同一的由二硫化物 键合的Scorpion多肽的同源二聚蛋白。
[0086] 如本文中所使用，术语"序列同一性"是指两个或更多个聚核苷酸序列之间或者两 个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被比较序列的对应位置上的相同核 酸碱基或氨基酸残基占据时，将所述序列称为在那个位置上"同一"。"序列同一性"百分比 是通过确定两个序列中存在同一的核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生"同一的"位置 数来计算。然后将"同一的"位置数除以比较窗中的总位置数并乘以100,以产生"序列同一 性"百分比。通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定"序列同一性"百分比。核酸 序列的比较窗的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 个或更多个核酸。多肽 序列的比较窗的长度可以是例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、300个或更多个氨基酸。为了最佳比对序列以供比较，比较窗中 的聚核苷酸或多肽序列部分可以包含称为空位的添加或缺失，而参考序列保持恒定。最佳 比对是即使有空位的情况下也能在参考序列与比较序列之间产生最大的可能"同一的"位 置数的比对。两个序列之间的"序列同一性"百分比可以使用程序版本"BLAST 2SeqUenCes" 确定，该程序版本可得自国家生物技术信息中心（截止到2004年9月1日），该程序并入 了程序BLASTN(用于核苷酸序列比较）和BLASTP (用于多肽序列比较），这两个程序是基 于 Karlin 和 Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (12) : 5873-5877, 1993)的算法。当利 用"BLAST 2Sequences"时，参数（即，截止到2004年9月1日的缺省参数）可以用于字长 (3)、开放空位罚分（11)、延伸空位罚分（1)、空位下降（50)、期望值（10)和任何其它所需参 数，包括但不限于基质选项。如果两个核苷酸或氨基酸序列相对于彼此具有至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性，则该 两个序列被视为具有"基本上相似的序列同一性"或"基本的序列同一性"。
[0087] 如本文中所使用，"多肽"或"多肽链"是共价连接的氨基酸的单一线性和连续排 列。它不包括以非线性方式，诸如经由链间二硫键连接在一起的两个多肽链（例如，轻链与 重链经由二硫键连接的半免疫球蛋白分子）。多肽可以具有或形成一个或多个链内二硫键。 关于如本文中所描述的多肽，提到对应于由SEQ ID NO说明的那些氨基酸残基的氨基酸残 基包括所述残基的翻译后修饰。
[0088] "蛋白质"是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽组分，诸如 碳水化合物基团。碳水化合物和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞添加到蛋白质， 并且将随细胞类型而变化。蛋白质在本文中是依据其氨基酸主链结构进行定义；一般不说 明诸如碳水化合物基团等取代基，但仍然可能存在。
[0089] 术语"氨基末端"（N末端）和"羧基末端"（C末端）在本文中用于表示多肽内的 位置。在上下文允许的情况下，这些术语是参考特定序列或多肽部分使用以表示邻近或相 对位置。举例来说，多肽内相对于参考序列位于羧基末端的某些序列位于参考序列的羧基 末端附近，但未必在完整多肽的羧基末端上。
[0090] "T细胞受体"(TCR)是在T细胞表面上发现的分子，一般与CD3 -起负责识别与主 要组织相容性复合物（MHC)分子结合的抗原。在大部分T细胞中，它由高度可变α和β 链的二硫化物连接的异源二聚体组成。在其它T细胞中，表达由可变γ和δ链组成的代 替受体。TCR的各链是免疫球蛋白超家族的成员，并且拥有一个N末端免疫球蛋白可变域、 一个免疫球蛋白恒定域、跨膜区和C末端的短胞质尾（参见Abbas和Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (第 5 版），编者:Saunders, Philadelphia, 2003 ； Janeway 等,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第 4 版,Current Biology Publications,第148、149和172页，1999)。如本公开中所使用的TCR可以来自 于各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
[0091] 如本文中所使用的"TCR复合物"是指由CD3链与其它TCR链缔合形成的复合物。 举例来说，TCR复合物可以由⑶3 γ链、⑶3 δ链、两个⑶3 ε链、⑶3 ζ链的同源二聚体、 TCRa链和TCR0链构成。或者，TCR复合物可以由⑶3 γ链、⑶3 δ链、两个⑶3 ε链、⑶3 ζ 链的同源二聚体、TCRy链和TCR δ链构成。
[0092] 如本文中所使用的"TCR复合物的组分"是指TCR链（例如TCRa、TCR|3、TCRy或 TCR δ )、⑶3链（例如⑶3 γ、⑶3 δ、⑶3 ε或⑶3 ζ )或由两个或更多个TCR链或⑶3链形 成的复合物（例如TCR a与TCR β的复合物、TCRy与TCR δ的复合物、⑶3 ε与⑶3 δ的 复合物、⑶3 γ与⑶3 ε的复合物，或TCR a、TCR β、⑶3 γ、⑶3 δ和两个⑶3 ε链的亚TCR 复合物）。
[0093] 如本文中所使用的"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"是指细胞介导的 过程，其中表达Fc γ R的非特异性细胞毒性细胞（例如，单核细胞，诸如自然杀伤（NK)细胞 和巨噬细胞）识别靶细胞上的结合抗体（或能够结合FcyR的其它蛋白质）且随后导致靶 细胞溶解。原则上，具有活化Fc γ R的任何效应细胞都可能被触发而介导ADCC。介导ADCC 的原代细胞是NK细胞，其仅表达Fc γ RIII，而单核细胞取决于它们的活化状态、定位或分 化可以表达Fcy RI、FcyRII和Fcy RIII。关于造血细胞上的Fcy R表达的回顾，参见例 如 Ravetch 等，1991，Annu. Rev. Immunol.，9:457-92。
[0094] 如本文中在提到多肽或蛋白质时使用的术语"具有ADCC活性"意指多肽或蛋白 质（例如，包含具有CH2和CH3域的免疫球蛋白铰链区和免疫球蛋白恒定亚区，诸如源自于 IgG的多肽或蛋白质（例如IgGl))能够通过结合表达Fc受体的细胞溶解型免疫效应细胞 (例如NK细胞）上的细胞溶解型Fc受体（例如Fc γ RIII)来介导抗体依赖性细胞介导的 细胞毒性（ADCC)。
[0095] 如本文中所使用的"补体依赖性细胞毒性"和"CDC"是指正常血清中的组分（"补 体"）与抗体或与靶抗原结合的其它Clq补体结合蛋白一起展现表达靶抗原的靶细胞的溶 解的过程。补体由一组协同作用且有序排列以发挥其作用的血清蛋白组成。
[0096] 如本文中所使用的术语"经典补体路径"和"经典补体系统"是同义的，并且是指 活化补体的特定路径。经典路径需要抗原-抗体复合物以便以有序方式起始和参与九种主 要蛋白质组分（指定为Cl到C9)的活化。对于活化过程中的若干个步骤，产物是能催化后 续步骤的酶。这一级联用相对较小的起始信号扩增并活化了大量补体。
[0097] 如本文中关于多肽或蛋白质使用的术语"具有CDC活性"意指所述多肽或蛋白质 (例如，包含具有CH2和CH3域的免疫球蛋白铰链区和免疫球蛋白恒定亚区，诸如源自于 IgG的多肽或蛋白质（例如IgGl))能够通过结合Clq补体蛋白和活化经典补体系统来介导 补体依赖性细胞毒性（CDC)。
[0098] 如本文中所使用的"重定向T细胞细胞毒性"和"RTCC"是指T细胞介导的过程， 其中使用能够特异性结合细胞毒性T细胞和靶细胞两者，且借此引发针对靶细胞的靶依赖 性细胞毒性T细胞反应的多特异性蛋白将细胞毒性T细胞募集到靶细胞。
[0099] 如本文中所使用，术语"治疗（treatment) "、"治疗（treating) "或"缓解"是指治 疗性治疗或防范性/预防性治疗。若接受治疗的个体中的至少一种疾病症状有改善或治疗 可以延迟个体中的进行性疾病的恶化或防止其它相关疾病发作，则治疗为治疗性的。
[0100] 如本文中所使用，术语"转化"、"转染"和"转导"是指将核酸（例如核苷酸聚合物） 转移到细胞中。如本文中所使用，术语"遗传转化"是指将DNA，尤其是重组DNA转移和并入 到细胞中。转移的核酸可以经由表达载体而引入到细胞中。
[0101] 如本文中所使用，术语"变体"是指不同于参考核酸或多肽，但保留其基本性质的 核酸或多肽。一般来说，变体总体上密切类似于参考核酸或多肽且在许多区域中与参考核 酸或多肽是同一的。举例来说，与活性部分或全长参考核酸或多肽相比，变体可以展现至少 约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98 %或 至少约99%序列同一1性。
[0102] 术语"轻链可变区"（也称为"轻链可变域"或"VL"）和"重链可变区"（也称为 "重链可变域"或"VH"）分别是指来自于抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称 为"互补性决定区"（CDR)和"构架区"（FR)的离散的定义明确的亚区组成。在一个实施方 案中，FR被人源化。术语" CL"是指"免疫球蛋白轻链恒定区"或"轻链恒定区"，即，来自于 抗体轻链的恒定区。术语"CH"是指"免疫球蛋白重链恒定区"或"重链恒定区"，取决于抗 体同种型，它还可以进一步分为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4域 (IgE、IgM)。"Fab"（抗原结合片段）是抗体中结合抗原的部分且包括重链中经由链内二硫 键与轻链连接的可变区和CHl域。
[0103] 本公开尤其提供了包含结合域，确切地说，包含特异性结合CD3的第一结合域的 多肽和蛋白质。本公开的包含结合域的多肽和蛋白质可以包含以下各项中的一个或多个： 免疫球蛋白恒定亚区、连接肽、铰链区、免疫球蛋白异源二聚域、免疫球蛋白二聚域、一个或 多个接合氨基酸、标签等等。本文中进一步详细描述所公开的多肽和蛋白质的这些组分。
[0104] 另外，本文中公开的CD3结合多肽和蛋白质可以呈多种不同形式中任一种的抗 体或融合蛋白的形式（例如，融合蛋白可以呈SMIP蛋白、PMS蛋白、Scorpion蛋白或 Interceptor 蛋白形式）。
[0105] 在一些实施方案中，⑶3结合多肽包含第二结合域。在一些实施方案中，⑶3结合 多肽从氨基到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区和第二结合域。在其它实施方案 中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含第二结合域、铰链区、恒定区和CD3结合域。
[0106] 根据本发明的⑶3结合蛋白一般包括（a)至少一个包含如本文中所述的⑶3结合 域的CD3结合多肽链。在某些变化方案中，CD3结合多肽还包括（b)羧基末端连接到CD3结 合域的铰链区和（c)免疫球蛋白恒定区（例如SMIP多肽）。在其它变化方案中，CD3结合 多肽还包括（d)羧基末端连接到免疫球蛋白恒定亚区的第二铰链区，和（e)羧基末端连接 到第二铰链区的第二结合域（例如Scorpion多肽）。在一些实施方案中，⑶3结合多肽包 含具有构架区、前铰链区和铰链区的 CD3结合域。
[0107] 在一些实施方案中，⑶3结合多肽包含三个或更多个与SEQ ID NO:42相比经修饰 的氨基酸，举例来说，所述修饰是用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨 基酸取代中性氨基酸，例如在构架区和/或前铰链区中。在一些实施方案中，通过用中性氨 基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸在VH和/或VL的构架 区中对至少2个、至少3个、至少4个、3-5个或3-10个氨基酸进行修饰。
[0108] 在本发明的一些实施方案中，CD3结合多肽在前铰链区中包含例如能降低前铰链 区或整个多肽的Pl的修饰。前铰链区处于结合域与铰链区之间的接合处。举例来说，可以 用序列SSS或SST置换具有序列RRT的三个氨基酸的前铰链区以降低等电点。在一些实施 方案中，前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3结合多肽相比具有降低的等电点。
[0109] 在一个实施方案中，为了降低免疫原性的风险，将人生殖细胞系IgG序列中普遍 存在的或人生殖细胞系序列中相同或邻近的位置上，例如在对应的人生殖细胞系IgG序列 中含有的氨基酸取代到序列中。在一些实施方案中，所述人生殖细胞系IgG序列包含SEQ ID NO:43 或 44。
[0110] 在一些实施方案中，与Cris-7VL Jk (Jk)区小鼠序列LQIT(SEQ ID NO:252)相比， 至少一个氨基酸修饰在VL区的Jk区内。在一些实施方案中，Jk区包含氨基酸序列VEIK (SEQ ID NO:253)，例如代替 LQIT(SEQ ID NO:252)。
[0111] 在一些实施方案中，CD3结合多肽包含铰链区和恒定区，举例来说，CD3结合多肽 可以包含（a)氨基末端连接到CD3结合域的铰链区，和（b)氨基末端连接到铰链区的免疫 球蛋白恒定区（例如，PMS多肽）。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包 含CD3结合域、铰链区和恒定区。在一些实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含 恒定区、铰链区和CD3结合域。
[0112] 典型地，上述形式的⑶3结合多肽（SMIP、Scorpion或PMS)能够进行同源二聚， 典型地通过二硫键，经由免疫球蛋白恒定区和/或铰链区（例如，经由包含IgG CH2和CH3 域的免疫球蛋白恒定区和IgG铰链区）。因而，在本发明的某些方面，两个同一的CD3结合 多肽进行同源二聚，以形成二聚CD3结合蛋白。
[0113] 在其它实施方案中，⑶3结合多肽还包括能够与第二非同一多肽链中的不同的异 源二聚域进行异源二聚的异源二聚域。在某些变化方案中，用于异源二聚的第二多肽链包 括第二结合域。因此，在本发明的某些方面，两个非同一多肽链（一个包含CD3结合域且第 二个任选地包含第二结合域）二聚以形成具有1到4个结合域的异源二聚蛋白质。在一些 实施方案中，CD3结合多肽从氨基到羧基末端包含CD3结合域、铰链区、恒定区、异源二聚域 和任选地存在的第二结合域。
[0114] 在一些实施方案中，第二结合域结合靶分子或与其相互作用，且CD3结合多肽诱 导T细胞细胞毒性。这可以呈非二聚体、异源二聚体或同源二聚体形式。在一些实施方案 中，第二结合域结合肿瘤相关抗原或与其相互作用。在一些实施方案中，CD3结合多肽在肿 瘤附近诱导T细胞溶解肿瘤细胞和/或诱导多克隆T细胞活化和扩增。
[0115] 包含本发明的抗CD3结合域的多肽可以是或者包含抗体或包括有保留结合特异 性的功能抗体片段或片段衍生物的抗体衍生物。在一些实施方案中，本发明包括含有可变 重链域和/或轻链域的融合蛋白和其它多肽。
[0116] 在本发明的一些实施方案中，⑶3结合多肽包含了包含有选自SEQ ID N0:28、30、 32、38和40的VH区序列或VL区序列的⑶3结合域。在一些实施方案中，⑶3结合域包含 选自SEQIDN0:22、24、26、28、30和32的VH区和选自SEQIDN0:38和40的VL区。在一 些实施方案中，CD3结合域包含选自SEQ ID NO: 28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO: 34、 36、38和40的VL区。在一些实施方案中，VH区包含SEQ ID N0:28且VL区包含SEQ ID NO: 34;VH 区包含 SEQ ID NO: 28 且 VL 区包含 SEQ ID NO: 38 ;VH 区包含 SEQ ID NO: 26 且 VL 区包含SEQ ID N0:38;或VH区包含SEQ ID N0:26且VL区包含SEQ ID N0:34。在一些实施 方案中，⑶3结合多肽包含有包含重链⑶Rl、⑶R2和⑶R3以及轻链⑶Rl、⑶R2和⑶R3,且 其中重链⑶R3包含SEQ ID N0:51的⑶3结合域。在一些实施方案中，⑶3结合多肽包括有 包含 SEQ ID NO: 49 的重链 CDRl、包含 SEQ ID NO: 50 的 CDR2 和包含 SEQ ID NO: 51 的 CDR3， 以及包含SEQ ID NO: 52的轻链CDRl、包含SEQ ID NO: 53的CDR2和包含SEQ ID NO: 54的 CDR3〇
[0117] 在一些实施方案中，CD3结合多肽包含选自SEQ ID勵:6、8、10、12、14、16、18和20 的氨基酸序列。
[0118] 本发明包括有包含二聚的单链多肽的多特异性结合蛋白，各单链多肽从氨基到羧 基末端包含第一结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和本发明的CD3结 合域。同样，本发明包括有包含二聚的单链多肽的多特异性结合蛋白，各单链多肽从氨基到 羧基末端包含本发明的CD3结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和第一 结合域。在一些实施方案中，N末端连接子可以包含免疫球蛋白铰链区或可能实质上由其 组成。
[0119] 在本发明的另一个方面，多特异性结合蛋白包含单链多肽，所述单链多肽从氨基 到羧基末端包含第一结合域、N末端连接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和CD3结合 域。同样，本发明包括多特异性结合蛋白，其从氨基到羧基末端包含CD3结合域、N末端连 接子、免疫球蛋白恒定区、C末端连接子和第一结合域。
[0120] 本发明包括多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含经由连接子域与第二 结合域连接的第一结合域（例如，经由连接子与另一个scFv连接的scFv)。举例来说，本 发明包括多特异性结合蛋白，其包含经由肽连接子域与CD3结合域（呈V h-连接子或 连接子-Vh取向）连接的第一结合域（呈V H-连接子或V ^连接子-Vh取向）。在一 些实施方案中，呈scFv-连接子-scFv形式的双特异性蛋白质可以包含源自于针对T细胞 抗原（诸如CD3)的抗体的可变重域和可变轻域，包括但不限于本文中所公开的可变域。隔 开scFv域的连接子可以包含（(Gly 4)Ser)n，其中η = 1-5 (SEQ ID NO: 74-78)。在一个实施 方案中，连接子是（(Gly4) Ser) 3(SEQ ID NO: 76)。连接子还可以包含约8-12个氨基酸。在 一些实施方案中，呈这种形式（"双特异性单链抗体"）的本发明蛋白质不包含Fc区，且因 此不具有Fc相关的效应功能。
[0121] 本发明实质上包括任何类型的含有如本文中所描述的结合域的多肽。这包括抗 体、其片段、scFv、Fab、双scFv单域抗体、双链抗体、双可变域结合蛋白和含有抗体或抗体 片段的多肽。本文中描述了本发明中所包括的其它类型多肽。
[0122] 在一些实施方案中，V d或被用作scFv，且以允许scFv和V H/\结合靶标的方 式与其它多肽或氨基酸序列连接/融合。在一些实施方案中，如本文中所描述的％和V j或 用于抗体或其片段中。举例来说，将所述％和V j或并入到V V j或在抗体中的天然位置。 在一些实施方案中，本发明的CD3结合多肽是抗体，例如具有如本文中所描述的 '链和V H 链。
[0123] 在本发明的一个实施方案中，多特异性蛋白质是scFv二聚体或双链抗体，而不是 完整抗体。双链抗体和scFv二聚体可以仅使用可变域构建而不具有Fc区。双链抗体是二价 双特异性抗体，其中％和V J或被表达在单一多肽链上，但所使用的肽连接子过短而无法允 许同一链上的两个结构域配对，从而迫使所述结构域与另一个链的互补域配对且产生两个 抗原结合位点（参见例如Holliger, P.等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ; Poljak，R.J.等（1994)Structure 2:1121-1123)。所述抗体结合部分在本领域中是已 知 的(Kontermann 和 Dubel 编,Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag. New York. 790pp. (ISBN 3-540-41354-5)〇
[0124] 在本发明的一个实施方案中，多特异性蛋白质是经二硫化物稳定的双链抗体。举 例来说，多特异性抗体可以包含两个独特的多肽，它们共表达以产生对2个特异性中的每 一个都具有一个结合位点的共价连接的异源二聚复合物。在这个实施方案中，各Fv是通过 呈Vla-V hb (第一链）和I-Vha(第二链）构型的一个链上的VJ半侣与第二个链上的V H伴侣 缔合而形成。这可以通过两个代替羧基末端异源二聚域中的任一个加以稳定：一个链上的 VEPKSC(SEQ ID N0:254)与另一个链上的FNRGEC(SEQ ID N0:255)配对，或带相反电荷的卷 曲螺旋域的配对。参见例如Moore等，2011，Blood. 117:4542-4551。在这个实施方案中，多 特异性结合蛋白可以包含具有与第一结合域'连接的CD3结合域第一链，且第二链包 含与第一结合域％连接的⑶3结合域V p并且两个链经由二硫键在C末端连接。可以使用 源自于已知抗体的可变重链和轻链，包括例如本文中所公开的可变重链和轻链来设计经二 硫化物稳定的双链抗体。
[0125] 在另一个实施方案中，多特异性结合蛋白是能够特异性结合第一结合位点（例如 肿瘤抗原）和TCR复合物的双可变域结合蛋白。在这个实施方案中，重组蛋白包含多肽链， 其中所述多肽链包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一可变域，VD2是第二可变 域，C是恒定域，Xl是连接子（例如，约10到20个氨基酸长的多肽连接子），X2代表Fc区 且η是0或1。参见例如美国专利号8, 258, 268。
[0126] 在本发明的一个实施方案中，多特异性结合蛋白包含一个、两个、三个或更多 个多肽链。举例来说，本发明包括多特异性蛋白质，其具有包含V m-I2的第一链，包含 012-013-￥^1-￥112的第二链和包含012-013的第三链。在这个实施方案中，￥ 111和￥^1可以对 应于第一结合域的可变域，而Vh2和V u可以对应于抗CD3可变域。或者，V H1和V 11可以对应 于抗CD3可变域，而Vh2和V u可以对应于第一结合域的可变域。
[0127] 在其它实施方案中，多特异性结合蛋白由包含不同的单链多肽的二聚单链多肽链 (异源二聚体）构成。在这种形式（"多特异性异源二聚体"）中，各多肽链包含结合域、N 末端连接子、恒定区、C末端连接子和任选地存在的另一个结合域且还包括异源二聚域。在 某些变化方案中，用于异源二聚的第二多肽链包括其它结合域。因此，在本发明的某些实施 方案中，异源二聚重组蛋白可以含有两个、三个或四个不同的结合域。关于一些例子和相关 方法，参见PCT公布号W02011/090762。
[0128] 如上文所指出，本公开的CD3结合多肽包含特异性结合CD3的结合域。在一些变化 方案中，⑶3结合域能够竞争结合氨基酸序列如SEQ ID N0:41中所示的具有单链Fv(ScFv) 的⑶3。在特定的实施方案中，⑶3结合域包含（i)包含⑶R HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫 球蛋白重链可变区（Vh)，和（ii)包含⑶R IXDR1、IXDR2和IXDR3的免疫球蛋白轻链可变区 (')。合适的⑶3结合域包括具有源自于鼠类单克隆抗体Cris-7的 '和V H区的⑶3结合 ±或（Reinherz，E. L.等（编），Leukocyte typing II.，Springer Verlag，New York, (1986) 〇 在一些这样的实施方案中，IXDR3具有SEQ ID N0:54中所述的氨基酸序列和/或HCDR3具有 SEQ ID NO: 51中所述的氨基酸序列；且IXDRl和IXDR2分别任选地具有如SEQ ID NO: 52和 SEQ ID NO: 53中所述的氨基酸序列，且HCDRl和HCDR2分别任选地具有如SEQ ID NO: 49和 SEQ ID N0:50中所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，举例来说，IXDR1、IXDR2和IXDR3 具有分别如SEQ ID勵:52、53和54中所示的氨基酸序列；和/或!《1?1、!《1?2和!《1?3具 有分别如SEQ ID N0:49、50和51中所示的氨基酸序列。
[0129] 可以得到本公开的结合域的示例性抗CD3抗体包括Cris-7单克隆抗体 (Reinherz, E. L.等（编），Leukocyte typing II. , Springer Verlag1New York, (1986)
[0130] (Vl= qvvltqspaimsafpgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydssklasgvparfsgs GSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSRNPPTFGGGTKLQITR(SEQ ID N0:46)且
[0131] Vh= qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrstmhwvkqrpgqglewigyinpssaytnynq KFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPQVHYDYNGFPYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO :45))； HuM291(Chau 等（2001)Transplantation 71:941-950(Vl= DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSAS SSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKV EIK(SEQ ID NO:72)且
[0132] Vh = QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHffVRQAPGQGLEffMGYINPRSGYTHYN QKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYDGFAYffGQGTLVTVSS(SEQ ID 0:73)； BC3 单克隆抗体（Anasetti 等（1990) J. Exp. Med 172:1691) ;0KT3 单克隆抗体（Ortho muliicenier Transplant Study Group(1985)N.Engl.J.Med.313:337)及其衍生物，诸 如0KT3ala-ala(也称为0KT3AA-FL或0KT3FL)，即在位置234和235上具有丙氨酸取代 的人源化 Fc 变体（Herold 等（2003) J. Clin. Invest. 11:409);维西珠单抗（Carpenter 等 (2002)Blood 99:2712) ;G19-4 单克隆抗体（Ledbetter 等，1986, J. Immunol. 136:3945) 和 145-2C11 单克隆抗体（Hirsch 等（1988) J. Immunol. 140:3766)。示例性抗 TCR 抗体是 BMA031 单克隆抗体（Borst 等（1990)Human Immunology 29:175-188)。
[0133] 在一些实施方案中，结合域是包含相关靶特异性区的单链Fv片段（scFv)。 在某些实施方案中，V#P Vl区是人的。
[0134] 在本发明的一个实施方案中，⑶3结合多肽的经验和/或理论pi比DRA209SMIP 的小至少0. 25、0. 5、0. 75、1、1. 25、1. 5、2、2. 5或更多个单位。在一些实施方案中，本发明的 ⑶3结合多肽的经验和/或理论pi比DRA209SMIP的小约0. 25到约2. 5个、0. 5到约2. 5 个、约0. 5到约2. 0个、约0. 5到约1. 5个、约0. 5到约1. 25个、约0. 5到约1. 0个、约0. 5 到约0. 75个、约0. 75到约1. 0个、约0. 75到约1. 25个、约0. 75到约1. 5个、约0. 75到约 2. 0个、约1. 0到约1. 5个、约1. 0到约2. 0个或约1. 0到约2. 5个单位。在一些实施方案 中，本发明的CD3多肽的经验或理论pi小于约8. 9、8. 8、8. 7、8. 6、8. 5、8. 4、8. 3、8. 2、8. 1、8、 7. 5、7. 25、7. 0或6. 75。在一些实施方案中，本发明的⑶3多肽的经验或理论pi为约8. 9、 8· 8、8· 7、8· 6、8· 5、8· 4、8· 3、8· 2、8· 1、8、7· 5、7· 25、7· 27. 0、6· 8 或 6. 75。在一些实施方案 中，本发明的⑶3多肽的经验或理论pi为约7. 9到约8. 7、7. 9到约8. 6、8. 0到约8. 6、8. 0 到约8. 5、8. 0到约8. 4、8. 0到约8. 3、8. 0到约8. 2、8. 0到约8. 1、约8. 1到约8. 6、约8. 2到 约8. 6、约8. 3到约8. 6、约8. 4到约8. 6、约8. 5到约8. 6、约8. 5到约8. 3、约8. 4到约8. 2 或约8. 3到约8. 1。
[0135] 在某些实施方案中，⑶3结合域包含或是与SEQ ID NO:41的scFv相比pi (经验和 /或理论）降低至少约0. 25、0. 5、1、1.25、1.5、2、2. 5或更多个单位的scFv。在一些实施方 案中，⑶3结合域包含或是pi (经验和/或理论）比SEQ ID NO: 41的降低约0.25到约2. 5、 0. 5到约2. 5、约0. 5到约2. 0、约0. 5到约I. 5、约0. 5到约I. 25、约0. 5到约I. 0、约0. 5到 约0. 75、约0. 75到约1. 0、约0. 75到约1. 25、约0. 75到约1. 5、约0. 75到约2. 0、约I. 0到 约1. 5、约L 0到约2. 0或约L 0到约2. 5个单位的scFv。这样的scFv包括SEQ ID NO:6、 8、10、12、14、16、18 和 20 内所含的 scFv，或与 SEQ ID N0:6、8、10、12、14、16、18 和 20 内所 含的scFv的氨基酸序列具有至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约 94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99. 5%或 100% 同一性的 scFv。
[0136] 在一些实施方案中，本发明的⑶3结合域与SEQ ID N0:41具有约80%到约99%、 约82 %到约99 %、约84 %到约99 %、约86 %到约99 %、约88 %到约99 %、约90 %到约 99 %、约92 %到约99 %、约94 %到约99 %、约96 %到约99 %、约97 %到约99 %、约98 %到约 99%、约80%到约85%、约85%到约90%、约85%到约95%、约90%到约97%、约90%到 约95%、约90%到约93%、约90%到约91%、约95%到约96%、约96%到约97%、约97% 到约98%、约96%到约97%或约96%到约98%的同一性。
[0137] 在一些实施方案中，本发明的⑶3结合域是SEQ ID NO:41的变体，其中已经使氨 基酸序列中的一个或多个氨基酸突变以降低结合域的pi。突变包括用一个氨基酸取代另一 个氨基酸以降低结合域的pi、插入氨基酸以降低结合分子的Pi和/或缺失氨基酸以降低结 合域的pi。在一个实施方案中，突变是取代。在一些实施方案中，突变在可变链的构架区 中。在一些实施方案中，变体中有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸突变。
[0138] 在一个实施方案中，CD3结合域包含或是包含选自SEQ ID NO:28、30、32、38和40 的重链或轻链的scFv。在另一个实施方案中，⑶3结合域包含选自SEQ ID N0:22、24、26、 28、30和32的VH区和选自SEQ ID NO :38和40的VL区。在另一个实施方案中，CD3结合 域包含选自SEQIDN0:28、30和32的VH区和选自SEQIDN0:34、36、38和40的VL区。在 另一个实施方案中，⑶3结合域包含SEQ ID NO: 28和34。在另一个实施方案中，⑶3结合域 包含SEQ ID NO:28和38。在另一个实施方案中，CD3结合域包含SEQ ID NO:26和38。在 另一个实施方案中，⑶3结合域包含SEQ ID N0:26和34。在一些实施方案中，⑶3结合域 包含选自SEQIDN0:38和40的VL区和选自SEQIDN0:22、24、26、28、30和32的VH区。 在其它实施方案中，与来自于特异性结合相关靶标的单克隆抗体或其片段或衍生物（例如 ⑶3)的⑶R相比，各⑶R包含不超过一个、两个或三个取代、插入或缺失。
[0139] 在一些实施方案中，⑶3结合域结合T细胞上的T细胞受体复合物的⑶3 ε亚单 位或与其相互作用。在一些实施方案中，CD3结合域与Cris-7或HuM291单克隆抗体竞争 结合CD3 ε。
[0140] 在一些实施方案中，CD3结合多肽诱导T细胞受体复合物内在化。
[0141] 在一些变化方案中，结合域是包含由肽连接子接合的免疫球蛋白 '区和Vh 区的单链Fv(ScFv)。用于接合'区和Vh区的肽连接子的使用在本领域中是众所周 知的，且这一特定领域内存在许多公布。一种广泛使用的肽连接子是由3个重复的 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID Ν0:74)氨基酸序列（Gly4Ser)3(EQ ID Ν0:76)组成的 15 聚 体。在一些实施方案中，肽连接子包含SEQ ID NO: 74-78中的任一个或由其组成。已经使用 了其它连接子，且已经使用噬菌体展示技术以及选择性感染性噬菌体技术使连接子序列多 样化和选择适当的连接子序列（Tang 等，J. Biol. Chem. 271，15682-15686, 1996 ;Hennecke 等，Protein Eng. 11，405-410, 1998)。在某些实施方案中，Vh区和V1区是通过具有包含式 (Gly4Ser)J^氨基酸序列的肽连接子相连，其中n= 1-5(分别是SEQ ID N0:74-78)。可以 通过随机突变发生优化简单连接子（例如（Gly4Ser)n)来获得其它合适的连接子。
[0142] 在特定的实施方案中，结合域包含人源化免疫球蛋白'和/或VHg。用于使免疫 球蛋白'区和V 1^人源化的技术在本领域中是已知的，且论述于例如美国专利申请公布号 2006/0153837 中。
[0143] 期望"人源化"产生免疫原性较弱、完全保留原始分子的抗原结合性质的抗体。为 了保留原始抗体的所有抗原结合性质，将再产生其抗原结合位点结构的"人源化"型式。这 可以通过在保留或不保留重要构架残基的情况下仅将非人CDR移植到人可变构架域和恒 定区上（Jones 等，Nature 321:522(1986) ;Verhoeyen 等，Science 239:1539 (1988))或通 过重组整个非人可变域（以保留配体结合性质）但通过审慎地置换暴露的残基用人样表面 将其"掩蔽"（以降低抗原性）（Padlan，Molec. Immunol. 28:489(1991))来实现。
[0144] 实质上，通过⑶R移植进行人源化涉及仅将非人抗体的⑶R重组到人可变区构 架和人恒定区上。理论上，这将显著降低或消除免疫原性（除非存在同种异型或个体 基因型差异）。然而，已经报告也可能需要保留原始抗体的一些构架残基（Reichmann 等，Nature, 332:323(1988) ;Queen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10, 029(1989)) 〇
[0145] 需要保留的构架残基适于通过计算机模拟来鉴别。或者，可以通过 比较已知的抗原结合位点结构来潜在地鉴别重要的构架残基（Padlan, Molec. Immunol.，31 (3) : 169-217 (1994)，以引用的方式并入本文中）。
[0146] 潜在地影响抗原结合的残基分为若干组。第一组包含具有抗原位点表面的连续残 基，它们因此可以与抗原直接接触。这些残基包括氨基末端残基和与CDR相邻的残基。第 二组包括可能通过接触抗体中的CDR或另一个肽链而改变CDR的结构或相对排列的残基。 第三组包含具有可能影响可变域的结构完整性的隐藏侧链的氨基酸。这些组中的残基通常 是在相同的位置上发现的（Padlan，1994,同上），但取决于编号系统，它们在鉴别时的位置 可能不同（参见 Kabat 等，〃Sequences of proteins of immunological interest,第 5 版，发行号 91-3242, U. S. Dept. Health&Human Services, NIH, Bethesda, Md.，1991)。
[0147] 尽管本文中描述的一些例子涉及scFv、SMIP、Scorpion和Interceptor分子而不 是抗体的人源化，但本领域中关于人源化抗体的知识适用于根据本发明的多肽。
[0148] 在某些实施方案中，铰链是野生型人免疫球蛋白铰链区。在某些其它实施方案中， 可以在野生型免疫球蛋白铰链区的氨基或羧基末端上添加一个或多个氨基酸残基作为融 合蛋白构建体设计的一部分。举例来说，铰链氨基末端的其它接合氨基酸残基可以是"RT"、 "RSS"、"TG"或"T"，或在铰链羧基末端可以是"SG"，或可将铰链缺失与添加组合，诸如在羧 基末端添加具有"SG"的Λ F。
[0149] 在某些实施方案中，铰链是改变的免疫球蛋白铰链，其中野生型免疫球蛋白铰链 区中的一个或多个半胱氨酸残基经一个或多个其它氨基酸残基（例如丝氨酸或丙氨酸）取 代。
[0150] 示例性改变的免疫球蛋白铰链包括但不限于存在野生型人IgGl铰链中发现的一 个、两个或三个半胱氨酸残基被一个、两个或三个不同的氨基酸残基（例如丝氨酸或丙氨 酸）取代的免疫球蛋白人IgGl铰链区。改变的免疫球蛋白铰链可能另外存在脯氨酸被另 一个氨基酸（例如丝氨酸或丙氨酸）取代。举例来说，上述改变的人IgGl铰链可以另外存 在位于羧基末端的连接到野生型人IgGl铰链区的三个半胱氨酸的脯氨酸被另一个氨基酸 残基（例如丝氨酸、丙氨酸）取代。在一个实施方案中，核心铰链区的脯氨酸未经取代。
[0151] 在某些实施方案中，铰链多肽包含或者是与诸如野生型人IgGl铰链、野生型人 IgG2铰链或野生型人IgG4铰链等野生型免疫球蛋白铰链区具有至少80%、至少81%、至 少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至 少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98 %或至少99%同一性的序列。
[0152] 在其它实施方案中，CD3结合多肽中存在的铰链可以是并非基于或源自于免疫球 蛋白铰链的铰链（即，非野生型免疫球蛋白铰链或改变的免疫球蛋白铰链）。这样的铰链的 例子包括源自于跨膜蛋白的域间区或II型C-凝集素的茎部区的具有约5到约150个氨基 酸的肽，例如具有约8到25个氨基酸的肽和具有约7到18个氨基酸的肽。
[0153] 在某些实施方案中，域间区或茎部区铰链具有7到18个氨基酸，且可以形成 α -螺旋卷曲螺旋结构。在某些实施方案中，域间区或茎部区铰链含有〇、1、2、3或4个半 胱氨酸。示例性域间区或茎部区铰链是域间区或茎部区的肽片段，诸如来自于CD69、CD72、 ⑶94、NKG2A和NKG2D的茎部区的10到150个氨基酸的片段。
[0154] 在某些实施方案中，铰链序列具有约5到150个氨基酸、5到10个氨基酸、10到20 个氨基酸、20到30个氨基酸、30到40个氨基酸、40到50个氨基酸、50到60个氨基酸、5到 60个氨基酸、5到40个氨基酸、8到20个氨基酸或10到15个氨基酸。铰链可以主要地是 挠性的，但也可以提供较多刚性特征，或可以主要含有螺旋结构与极少β-片状结构。 铰链的长度或序列可能影响铰链直接或间接（经由另一个区或域，诸如异源二聚域）连接 的结合域的结合亲和力以及铰链直接或间接连接的Fc区部分的一种或多种活性。
[0155] 在某些实施方案中，铰链序列在血浆和血清中是稳定的且能抵抗蛋白水解裂解。 可以使IgGl上铰链区中的第一赖氨酸突变以将蛋白水解裂解减到最少，举例来说，赖氨酸 可以经甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代或缺失。
[0156] 在本发明的一些实施方案中，⑶3结合多肽能够与第二多肽链形成异源二聚体且 包含如下铰链区：(a)氨基末端紧邻免疫球蛋白恒定区（例如，氨基末端连接到CH2域，其 中免疫球蛋白恒定区包括CH2和CH3域，或氨基末端连接到CH3域，其中免疫球蛋白区包括 CH3和CH4域）；(b)插入在结合域（例如scFv)与免疫球蛋白异源二聚域之间且连接结合 域与免疫球蛋白异源二聚域；（c)插入在免疫球蛋白异源二聚域与免疫球蛋白恒定区（例 如，其中免疫球蛋白恒定区包括CH2和CH3域或CH3和CH4域）之间且连接免疫球蛋白异 源二聚域与免疫球蛋白恒定区；（d)插入在免疫球蛋白恒定区与结合域之间且连接免疫球 蛋白恒定区与结合域；（e)在多肽链的氨基末端；或（f)在多肽链的羧基末端。包含如本文 中所描述的铰链区的多肽链能够与不同的多肽链缔合以形成本文中所提供的同源二聚或 异源二聚蛋白，且所形成的二聚体将含有保留了其靶特异性和/或其特异性靶结合亲和力 的结合域。
[0157] 在某些实施方案中，能与另一个多肽链形成异源二聚体的多肽中存在的铰链可以 是免疫球蛋白铰链，诸如野生型免疫球蛋白铰链区或其改变的免疫球蛋白铰链区。在某些 实施方案中，异源二聚蛋白的一个多肽链的铰链与所述异源二聚体的另一个多肽链的对应 铰链同一。在某些其它实施方案中，一个链的铰链不同于另一个链的铰链（例如，在其长度 和/或序列方面）。不同的链中的不同的铰链允许对铰链所连接的结合域的结合亲和力进 行不同的控制，使得异源二聚体能够结合一个结合域的靶标而略过另一个结合域的靶标。 举例来说，在某些实施方案中，异源二聚蛋白在一个链中具有CD3结合域或TCR结合域，且 在另一个链中具有第二结合域（诸如肿瘤抗原结合域）。在两个链中具有两个不同的铰链 可以允许异源二聚体首先结合肿瘤抗原，然后结合CD3或其它TCR组分。因而，异源二聚体 可以将CD3+T细胞募集到表达肿瘤抗原的细胞（例如，表达PSM的肿瘤细胞），这又可以破 坏或毁坏表达肿瘤抗原的细胞。
[0158] 适合根据本发明使用的示例性铰链区示于以下表1和2中。
[0159] 表1 :示例性铰链区
[0160]
【权利要求】
1. 一种⑶3结合多肽，其包含与具有氨基酸序列SEQ ID NO:41的结合域相比具有降低 的等电点的CD3结合域。
2. 如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述结合域包含VH区和VL区，且其中所述 VH区和所述VL区包含构架区。
3. 如权利要求2所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基 酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸在VH和/或VL的构架区中对两个或更多个氨 基酸进行修饰。
4. 如权利要求3所述的CD3结合多肽，其中所述构架区的经修饰氨基酸被经对应的人 生殖细胞系IgG序列内所含的氨基酸取代。
5. 如权利要求4所述的CD3结合多肽，其中所述人生殖细胞系IgG序列包括SEQ ID NO: 43
6. 如权利要求4所述的CD3结合多肽，其中所述人生殖细胞系IgG序列包括SEQ ID NO :44
7. 如权利要求1到3所述的CD3结合多肽，还包括前铰链区。
8. 如权利要求7所述的CD3结合多肽，其中所述前铰链区与具有RRT前铰链区的CD3 结合多肽相比具有降低的等电点。
9. 一种CD3结合多肽，其包含具有构架区、前铰链区和铰链区的CD3结合域， 其中所述CD3结合多肽与SEQ ID NO: 42相比具有三个或更多个经修饰的氨基酸，所述 修饰是在所述构架区和/或前铰链区中用中性氨基酸取代带正电的氨基酸和/或用带负电 的氨基酸取代中性氨基酸。
10. 如权利要求9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的氨基 酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对至少两个或更 多个氨基酸进行修饰。
11. 如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的 氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对至少四个 或更多个氨基酸进行修饰。
12. 如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的 氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对三到五个 氨基酸进行修饰。
13. 如权利要求3和9所述的CD3结合多肽，其中可以通过用中性氨基酸取代带正电的 氨基酸和/或用带负电的氨基酸取代中性氨基酸而在VH和/或VL的构架区中对三到十个 氨基酸进行修饰。
14. 如权利要求8到9所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽前铰链区包含氨基 酸序列SSS或SST。
15. 如权利要求1到8所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽还包括铰链区和恒 定区。
16. 如权利要求1到15所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽具有比多肽SEQ ID N0:4小至少1个pi单位的经验等电点。
17. 如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽是人源化抗体、单链 Fv(scFv)或 SMIP〇
18. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末 端包含CD3结合域、铰链区和恒定区。
19. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽从氨基末端到羧基末端包 含恒定区、铰链区和CD3结合域。
20. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽还包含第二结合域。
21. 如权利要求20所述的CD3结合多肽，其中所述结合多肽从氨基末端到羧基末端包 含CD3结合域、铰链区、恒定区和第二结合域。
22. 如权利要求20所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末 端包含第二结合域、铰链区、恒定区和CD3结合域。
23. 如权利要求15所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合多肽还包含异源二聚域。
24. 如权利要求23所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽从氨基末端到羧基末 端包含CD3结合域、铰链区、恒定区和异源二聚域。
25. 如权利要求1到24所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽还包含第二结合 域。
26. 如权利要求25所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域结合靶分子或与其相互 作用，且所述CD3结合多肽诱导T细胞细胞毒性。
27. 如权利要求26所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域结合肿瘤相关抗原或与 其相互作用。
28. 如权利要求27所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽诱导T细胞溶解肿瘤 细胞。
29. 如权利要求27所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽在肿瘤附近诱导多克 隆T细胞活化和扩增。
30. 如权利要求27到29所述的CD3结合多肽，其中所述肿瘤相关抗原选自R0N、c-Met、 CEACAM-6、PSMA、EpCAM、CEA、P CTA-1、STEAP-1、STEAP-2、PSCA、PSA、PAP、ALCAM(CD166)、 PECAM-1、EphA2、CD151、CA-125/MUC16、MUC-1、MAGE-1、TR0P2、IGF1R、TGFBR2、GHRHR、GHR、 IL-6R、gpl30、T NFR2、OSMR0 、Patched_l、Frizzled、Robol、LT0 R、CD25、CD26、CD27、CD30、 CD33、CD44、CD44v6、CD63、CD80、CD81、CD86、CD100、CD151、CXCR4、CCR5、HER-2/ErbBl、 HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4、EGFR/ErbBl、EGFRvIII 同种型、MUC2、MUC3、M UC4、MUC5ac、 MUC5b、MUC7、0hCG、Lewis_Y、神经节苷脂 G D3、9-0-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖酰 GMl、Poly SA、⑶2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、音猬因子（Shh)、Wue-l、浆细胞抗原、（膜结合） IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖（MCSP)、CCR8、T NF-a前体、间皮素、A33抗原、Ly-6 ; 桥粒核心糖蛋白4、E-妈粘附蛋白新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CA19-9标记物、苗勒氏抑制 物质（M IS)受体II型、sTn (唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP (成纤维细胞活化抗原）、内 皮唾液酸蛋白、LG、SAS、BCMA、TWEAKR/Fnl4、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、SSX1 和 SSX2。
31. 如权利要求1到30所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域结合T细胞上的T 细胞受体复合物的CD3 e亚单位或与其相互作用。
32. 如权利要求1到31所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽诱导T细胞受体 复合物内在化。
33. 如权利要求1到32所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域是来源于鼠类 Cris-7单克隆抗体或HuM291的人源化⑶3结合域。
34. 如权利要求33所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域包含鼠类Cris-7抗体或 HuM291 的重链 CDR1、CDR2 和 CDR3 以及轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3。
35. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合域包含选自SEQ ID NO: 28、 5￡〇10勵：30、5￡〇10勵：32、5￡〇10勵：38和5￡〇10勵:40的￥11区序列或￥1区序列。
36. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合域包含选自SEQ ID NO: 22、 5￡〇10吣：24、5￡〇10吣：26、5￡〇10吣：28、5￡〇10吣：30和5￡〇10吣32的￥11区和选 自 SEQ ID N0:38 和 SEQ ID N0:40 的 VL 区。
37. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合域包含选自SEQ ID NO: 28、 SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:32 的VH区和选自 SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:38 和 SEQ ID NO:40 的 VL 区。
38. 如权利要求2所述的⑶3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 28且所述VL 区包含 SEQ ID NO:34。
39. 如权利要求2所述的⑶3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 28且所述VL 区包含 SEQ ID NO:38。
40. 如权利要求2所述的⑶3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 26且所述VL 区包含 SEQ ID NO:38。
41. 如权利要求9和14所述的⑶3结合多肽，其中所述VH区包含SEQ ID NO: 26且所 述 VL 区包含 SEQ ID NO: 34。
42. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合多肽包含选自SEQ ID NO: 6、 SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18 和SEQ ID N020的氨基酸序列。
43. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述⑶3结合域包含重链⑶Rl、⑶R2和 CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，且其中所述重链CDR3包含SEQ ID NO: 51。
44. 如权利要求43所述的⑶3结合多肽，其中重链⑶R1包含SEQ ID NO:49,⑶R2包 含5￡〇10勵:50且0?3包含3￡〇10勵:51，并且轻链0)1?1包含3￡〇10勵:52,0)1?2包 含5￡0 10勵：53，且〇?3包含5￡0 10勵：54。
45. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中恒定区包含IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2、IgD 或其任何组合的 CH2 和 CH3 域；IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、 IgE、IgM或其任何组合的免疫球蛋白CH3域；或IgE、IgM或其组合的免疫球蛋白CH3和CH4 域。
46. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区包含CH2和CH3。
47. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区实质上由CH2域和CH3域组 成。
48. 如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以减少或消除效 应因子功能。
49. 如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以便不固定补 体。
50. 如权利要求45到47所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区经修饰以便不结合Fc Y受体。
51. 如权利要求50所述的⑶3结合多肽，其中所述Fey受体选自⑶16、⑶32和⑶64。
52. 如权利要求15所述的CD3结合多肽，其中所述恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO:55〇
53. -种核酸，其编码任一种如权利要求1到52所述的多肽。 54?-种分离的核酸，包括选自 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:37的核酸。
55. -种表达载体，包含如权利要求53或54所述的核酸。
56. -种重组宿主细胞，包含如权利要求32所述的表达载体。
57. -种组合物，包含如权利要求1到52中任一项所述的⑶3结合多肽和药学上可接 受的载剂、稀释剂或赋形剂。
58. -种用于治疗癌症或自体免疫病症的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量 的如权利要求57所述的组合物或如权利要求1到52所述的CD3结合多肽。
59. 如权利要求1到52所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合多肽形成二聚体。
60. 如权利要求59所述的CD3结合多肽，其中所述二聚体是同源二聚体或异源二聚体。
61. 如权利要求3所述的CD3结合多肽，其中与Cris-7VL J k (Jk)区小鼠序列 LQIT(SEQ ID N0:252)相比，至少一个氨基酸修饰是在VL区的Jk区中。
62. 如权利要求61所述的CD3结合多肽，其中所述Jk区包含氨基酸序列VEIK(SEQ ID NO :253)〇
63. 如权利要求25所述的CD3结合多肽，其中所述第二结合域包含与选自以下的氨基 酸序列具有至少90%、至少95%或100%同一性的氨基酸序列：SEQ ID N0:212的氨基酸 1-107 和 124-243 ;SEQ ID NO:226 的氨基酸 1-107 和 124-243 ;SEQ ID NO:216 的氨基酸 1-107 和 124-243 ;和 SEQ ID NO: 196 的 1-111 和 128-251。
64. 如权利要求1所述的⑶3结合多肽，其中所述结合多肽包含与SEQ ID N0:57、59、 61、63、65、67、69、71、186、190、192、194、196、198、200、202、204 或 206 具有至少 90%、至少 95 %或100%同一性的氨基酸序列。
65. 如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述多肽是异源二聚体的一部分。
66. 如权利要求65所述的CD3结合多肽，其中所述异源二聚体包含一对单链多肽，其 中所述单链对包含与选自以下的配对具有至少90%、至少95 %或100 %同一性的氨基酸序 列：SEQ ID NO:210 和 247、SEQ ID NO:210 和 218、SEQ ID NO:210 和 220、SEQ ID NO:208 和 249、SEQ ID NO:208 和 222、或 SEQ ID NO:208 和 224、SEQ ID NO:212 和 218、SEQ ID NO: 216 和 222、SEQ ID NO: 228 和 226,或 SEQ ID NO: 214 和 218。
67. 如权利要求1所述的CD3结合多肽，其中所述CD3结合域与SEQ ID NO:41具有约 90%到约99%同一性。
【文档编号】C12P21/06GK104487587SQ201380027109
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年4月18日 优先权日:2012年4月20日
【发明者】P·H·坦, S·K·纳塔拉詹, C·J·麦克马汉 申请人:新兴产品开发西雅图有限公司