用于合成色胺和色胺类似物的衍生物的生物催化剂和方法
【专利摘要】本公开内容提供了用于产生胺的工程化转氨酶多肽、编码该工程化转氨酶的多核苷酸、能够表达该工程化转氨酶的宿主细胞、以及使用该工程化转氨酶制备在产生活性药物试剂中有用的化合物的方法。本公开内容提供了具有转氨酶活性的工程化多肽、编码该多肽的多核苷酸、制备该多肽的方法、和使用该多肽用于将酮底物生物催化转化为胺产物的方法。本发明的酶已被工程化为具有与河流弧菌(Vibrio fluvialis)的天然存在的转氨酶的氨基酸序列相比的一个或更多个残基差异。特别是，本公开内容的转氨酶已被工程化为从其相应的前手性酮底物有效形成手性色胺衍生物。
【专利说明】用于合成色胺和色胺类似物的衍生物的生物催化剂和方法 1.【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及转氨酶生物催化剂以及使用该生物催化剂制备色胺和色胺类似 物的衍生物的方法。
[0002] 2.对序列表、表格或计算机程序的引用
[0003] 序列表的正式文本作为ASCII格式文本文件与说明书经EFS-Web同时被提交，文 件名为"CX2-105USP1_ST25.txt"，创建日期为2012年3月23日，且大小为457, 542千字 节。经EFS-Web提交的序列表为本说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。
[0004] 3?背景
[0005] 色胺类化合物具有核心通式
【权利要求】
1. 一种具有转氨酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽包括具有与SEQIDN0:4的至 少80 %同一性和与SEQIDNO: 4相比在选自以下的残基位置上的一个或更多个残基差异 的氨基酸序列：X14 ;X26 ;X31 ;X33 ;X41 ;X47 ;X57 ;X70 ;X86 ;X88 ;X107 ;X132 ;X148 ;X163 ; X168 ；X173 ；X203 ；X250 ；X284 ；X314 ；X315 ；X324 ；X346 ；X395 ；X398 ；X400 ；X417 ；X419 ； X423 ;X448 ;和X451，其中在残基位置X31 ;X57 ;X86 ;X163 ;X168 ;X314 ;X324 ;X398 ;和X417 上的残基差异选自：X31S;X57Y;X86D;X163I;X163L;X163R;X163V;X168S;X314N;X324H; X398L;X398V;X398W;和X417M。
2. 如权利要求I所述的工程化多肽，其中在残基位置X14 ;X26 ;X33 ;X41 ;X47 ;X70 ; X88 ；X107 ；X132 ；X148 ；X173 ；X203 ；X250 ；X284 ；X315 ；X346 ；X395 ；X400 ；X419 ；X423 ； X448 ;和X451 上的残基差异选自X14V;X26R;X33T;X41L;X47N;X70A;X88A;X88L;X107P; X132F；X148Q；X148R；X173A；X203S；X250A；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S； X423I;X448E;和X451D。
3. 如权利要求2所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列还包括选自以下的一个或更 多个残基差异：X57F;X113L;X113V;X168K;X420N;和X424V。
4. 如权利要求I所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括选自以下的至少一个 或更多个残基差异：X14V;X26R;X31S/D;X86D;X163I/L/R/V;X284A;X315G;X398L/V/W;和 X400G〇
5. 如权利要求I所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括选自以下的残基差异的 组合： X14V和X163I/L/R/V; X86D和X400G; X57F/Y和X163I/L/R/V; X57F/Y和X398L/V/W; X14V、X113L/V、X163I/L/R/V、X284A、和X424V; X31S、X57F/Y、X163I/L/R/V、X315G、X346L、和X398L/V/W X14V、X113L、X163L、X284A、和X424V; X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G; X14V、X26R、X88L、和X113L; X57F、X163L、X168K、X314N、X315G、X346L、和X398V; X14V、X163L、X173A、X400G、和X420N; X14V、X113L、X163L、和X284A; X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G;以及X14V、X33T、X57F、X113L、和X163L。
6. 如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述转氨酶具有与SEQIDNO:4的多肽相比 至少1.2倍增加的稳定性，其中所述氨基酸序列包括选自以下的一个或更多个残基差异： X14V;X26R;X31S;X33T;X41L;X70A;X86D;X88A/L;X163I/L/R/V;X284A;X324H;X419S;和 X423I。
7. 如权利要求I所述的工程化多肽，其中所述氨基酸序列包括选自以下的序列：6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、 108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、 146、148、150、152、和154。
8. 如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述多肽固定在固体支持物上。
9. 一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的工程化转氨酶多肽。
10. -种表达载体，所述表达载体包含权利要求9所述的多核苷酸，任选地还包含控制 序列。
11. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求9所述的多核苷酸或权利要求10所述 的表达载体。
12. -种制备工程化多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养 权利要求11所述的宿主细胞，任选地还包括分离所述工程化多肽。
13. -种用于制备式（I)的化合物的方法，
其中 R1选自由以下组成的组：氢、羧基、羧基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷基、任选 地取代的（C2-C6)烯基、任选地取代的烷氧基羰基、任选地取代的芳基羰基、任选地取代的 芳基磺酰基、和保护基团； R2选自由以下组成的组：氢、氧代、卤代、羟基、氨基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、 (C「C6)烷基氨基、(C「C6)二烷基氨基、(C「C6)烷基硫代、(C「C6)烷基磺酰基、(C「C6)烷基 亚磺酰基、和任选地取代的（C1-C6)烷氧基； R4、R6和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝 基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、羟基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、任选 地取代的（C1-C6)烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)烷基 硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的（C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基（C1-C6) 烷基、（C1-C6)烷氧基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基（C1-C6) 烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂 芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代 的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳 基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫 代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基 羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基（C1-C6)烷 基、和杂芳基磺酰基（C1-C6)烷基； R5选自由以下组成的组：氢、齒代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任选地取代的 (C「C6)烷基、羟基（C「C6)烷基、任选地取代的（C「C6)烷氧基、任选地取代的（C「C6)烷基 氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)烷基硫代、任选地取代的 (c「c6)烷基磺酰基、任选地取代的（c「c6)烷基亚磺酰基、羧基（c「c6)烷基、（c「c6)烷氧 基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基（C1-C6)烷基、任选地取代 的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代 的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代的芳基磺酰基、任 选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳基羰基氧基、任选 地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫代、任选地取代的 杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基羰基、任选地取代 的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基（C1-C6)烷基、和杂芳基磺酰 基（C1-C6)烷基、或与R4-起形成5至8元任选地取代的环烷基或任选地取代的杂环； R8选自由以下组成的组：任选地取代的（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、任 选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、和任选地取代的杂芳基、 或与R2-起形成任选地取代的5至8元环烷基或杂环；以及 n是1或2 ; 条件是 (a) 当R2是氢时，则以下的至少一个适用： (i)R1不是氢、甲基、4-(甲氧基）苯基羰基-、4-(三氟甲氧基）苯磺酰基_、3_溴苯基 羰基_、3_氨基丙基、或3-(甲基羰基氨基）丙基 (ii) R4和R7各自彼此独立地不是氢或氯； (iii)R5不是氢、羟基、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、或氰基； (iv) R6不是氢、羟基、甲氧基、氟或氯；或 (V)R8不是甲基、乙基、羟甲基、或三氟甲基以及 (b) 当n是1，R2和R8-起形成环己基环，并且R\R4、R6、和R7是氢时，则R5不是氟； 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（II)的底物化合物与 权利要求1至8的任一项所述的工程化转氨酶多肽接触，
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和n如以上所定义。
14.如权利要求13所述的方法，其中式（I)的化合物包括在以*标记的碳原子上具有 指定的立体化学的式（IS)的化合物，
其中， R1选自由以下组成的组：氢、羧基、羧基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷基、任选 地取代的（C2-C6)烯基、任选地取代的烷氧基羰基、任选地取代的芳基羰基、任选地取代的 芳基磺酰基、和保护基团； R2选自由以下组成的组：氢、氧代、卤代、羟基、氨基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、 (c「c6)烷基氨基、(c「c6)二烷基氨基、(c「c6)烷基硫代、(c「c6)烷基磺酰基、(c「c6)烷基 亚磺酰基、和任选地取代的（C1-C6)烷氧基； R4、R5、R6和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、 硝基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、羟基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、 任选地取代的（C1-C6)烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6) 烷基硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的（C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基 (C1-C6)烷基、（C1-C6)烷氧基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰 基（C1-C6)烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地 取代的杂芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任 选地取代的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地 取代的芳基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的 杂芳基硫代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂 芳基氧基羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基 (C1-C6)烷基、和杂芳基磺酰基（C1-C6)烷基；以及 R8选自由以下组成的组：任选地取代的（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、任 选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、和任选地取代的杂芳基； 条件是当R2是氢时，则以下的至少一个适用： (i)R1不是氢、甲基、4-(甲氧基）苯基羰基-、4-(三氟甲氧基）苯磺酰基-、3-溴苯基 羰基_、3_氨基丙基、或3-(甲基羰基氨基）丙基 (ii) R4和R7各自彼此独立地不是氢或氯； (iii)R5不是氢、羟基、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、或氰基； (iv) R6不是氢、羟基、甲氧基、氟或氯；或 (V)R8不是甲基、乙基、羟甲基_、或三氟甲基-; 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（IIa)的底物化合物与 权利要求1至8的任一项的工程化转氨酶多肽接触
其中#、1?2、1?4、1?5、1? 6、1?7、和1?8如以上所定义。
16.如权利要求15所述的方法，其中式（Ia)的化合物包括在以*标记的碳原子上具有 指定的立体化学的式（IaS)的化合物
其中 R1选自由以下组成的组：氢和（C1-C6)烷基； R2选自由以下组成的组：氢、卤代、和（C「C6)烷基； R4、R5、R6、和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、任选地取代的 (C「C6)烷基、羟基（C「C6)烷基、(C「C6)烷基;氨基、(C「C6)烷基氨基、和（C「C6)二烷基氨 基；以及 R9选自由以下组成的组：卤代、羟基、羟基（C1-C6)烷基、氨基、（C1-C6)烷基氨基、和 (C1-C6)二烷基氨基； 条件是当R2是氢时，则以下的至少一个适用： (i)R1不是氢或甲基； (ii) R4和R7各自彼此独立地不是氢或氯； (iii)R5不是氢、羟基、甲基、甲氧基、氟、氯、或三氟甲基； (iv) R6不是氢、羟基、甲氧基、氟或氯；或 (V)R9不是羟基； 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（IIal)的底物化合物 与权利要求1至8的任一项所述的工程化转氨酶多肽接触
其中#、1?2、1?4、1?5、1? 6、1?7、和1?9如以上所定义。
18. -种用于制备式（Ia2)的化合物的方法
其中L是尚去基团； Rltl的每次出现彼此独立地选自由以下组成的组：卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、 硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、羟基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、任选地 取代的（C1-C6)烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)烷基硫 代、任选地取代的（C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的（C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基（C1-C6)烷 基、（C1-C6)烷氧基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基（C1-C6) 烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂 芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代 的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳 基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫 代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基 羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基（C1-C6)烷 基、和杂芳基磺酰基（C1-C6)烷基； k为从3至5的整数； n是1或2 ;以及 w是从O至4的整数； 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（IIa2)的底物化合物 与权利要求1至8的任一项所述的工程化转氨酶多肽接触
其中 L、R1CI、k、n和w如以上所定义。
19. 如权利要求18所述的方法，其中L是Cl或Br且k是3。
20. -种用于制备式（Ib)的化合物的方法
其中 Z选自由以下组成的组：0、S、NH或-(CH2)ni-,其中m是0、1、2或3 ; R1选自由以下组成的组：氢、羧基、羧基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷基、任选 地取代的（C2-C6)烯基、任选地取代的烷氧基羰基、任选地取代的芳基羰基、任选地取代的 芳基磺酰基、和保护基团； R4、R5、R6和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、 硝基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、羟基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、 任选地取代的（C1-C6)烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6) 烷基硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的（C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基 (C1-C6)烷基、（C1-C6)烷氧基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰 基（C1-C6)烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地 取代的杂芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任 选地取代的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地 取代的芳基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的 杂芳基硫代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂 芳基氧基羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基 (C1-C6)烷基、和杂芳基磺酰基（C1-C6)烷基； 条件是当Z为-(CH2)m-,m为1，并且R1、R4、R6和R7为氢时，则R5不是氟； 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（IIb)的底物化合物与 权利要求1至8的任一项所述的工程化转氨酶多肽接触
其中Z、!?1、!?4、!?5、R6、和R7如以上所定义。
21. -种用于制备式（Ibl)的化合物的方法
其中 R1选自由以下组成的组：氢、羧基（C1-C6)烷基、和（C1-C6)烷基； Rn的每次出现彼此独立地选自由以下组成的组：氯、溴、碘、羟基、氨基、羧基、氰基、硝 基、硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基、羟基（C1-C6)烷基、任选地取代的（C1-C6)烷氧基、任选 地取代的（C1-C6)烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的（C1-C6)烷基 硫代、任选地取代的（C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的（C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基（C1-C6) 烷基、（C1-C6)烷氧基羰基、（C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基（C1-C6) 烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂 芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代 的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳 基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫 代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基 羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基（C1-C6)烷基、芳基磺酰基（C1-C6)烷 基、和杂芳基磺酰基（C1-C6)烷基；以及 W为从O至4的整数； 所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式（IIbl)的底物化合物 与权利要求1至8的任一项所述的工程化转氨酶多肽接触
其中 R1、R11和w如以上戶斤述定义。
22. 如权利要求13至21的任一项所述的方法，其中所述底物化合物为以下的载量：约 0? 5 至约 200g/L、l至约 200g/L、5 至约 150g/L、约 10 至约 100g/L、或约 20 至约 100g/L。
23. 如权利要求13至21的任一项所述的方法，其中所述氨基供体为异丙胺（IPM)。
24. 如权利要求13至21的任一项所述的方法，其中所述适当的反应条件包括选自以下 的共溶剂：多元醇、二甲亚砜、DMS0、或低级醇。
25. 如权利要求24所述的方法，其中所述多元醇是聚乙二醇（PEG)，任选地PEG200。
26. 如权利要求13所述的方法，其中所述适当的反应条件包括：（a)以约5g/L至200g/ L的底物载量；(b)约0. 1至50g/L的转氨酶多肽；（c)约0. 1至3M的异丙胺（IPM) ; (d)约 0. 1至10g/L的磷酸吡哆醛（PLP)辅因子；（e)约6至9的pH;以及（f)约30°C至60°C的 温度。
27. 如权利要求13所述的方法，其中所述适当的反应条件包括：（a)约25至约IOOg/ L的底物载量；(b)约0. 5至10g/L的转氨酶多肽；（c)约1至10%v/v的PEG200 ; (d)约 1至2M的异丙胺（IPM) ; (e)约0. 1至lg/L的磷酸吡哆醛（PLP)辅因子；（f)约0. 1至约 0? 5M的三乙醇胺（TEA) ; (g)约6至8的pH;以及（h)约45°C至55°C的温度。
【文档编号】C12N9/10GK104508126SQ201380026594
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年3月22日 优先权日:2012年3月23日
【发明者】约瓦娜·纳佐尔, 德里克·史密斯, 迈克尔·A·克罗, 宋士玮, 史蒂文·J·科利尔 申请人:科德克希思公司