获得和使用内胚层和肝细胞的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供用于产生内胚层细胞和/或来自内胚层细胞的分化细胞(例如，肝细胞、胰前体细胞、胰细胞、肠祖细胞、肠细胞、肺祖细胞、肺细胞等)的群体的有效方法。还提供了内胚层细胞和来自内胚层细胞的分化细胞(例如，肝细胞、胰前体细胞、胰细胞、肠祖细胞、肠细胞、肺祖细胞、肺细胞等)的组合物及使用此类细胞的方法。
【专利说明】获得和使用内胚层和肝细胞的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 该申请要求2012年5月23日提交的美国临时专利申请号61/650, 762的优先权， 其内容以其整体并入本文作为参考。 发明领域
[0003] 本发明是干细胞、内胚层细胞、胰祖细胞、肝细胞和来自内胚层细胞的其他细胞的 领域。一般地，本发明涉及制备和使用内胚层细胞、胰祖细胞、肝细胞和/或来自内胚层细 胞的其他细胞的组合物和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 使得干细胞独特适合于细胞疗法应用的两种性质是多能性和在培养物中长时间 维持这些细胞的能力。多能性由干细胞分化成所有三个原始胚层（内胚层、中胚层、外胚 层）的衍生物的能力定义，所述三个原始胚层的衍生物继而形成除胚外组织（例如胎盘） 和生殖细胞外的成熟生物的所有体细胞类型。然而，干细胞的多能性也为研究和操作这些 细胞及其衍生物提出了独特的挑战。由于可能在分化干细胞培养物中出现的大量细胞类 型，大多数细胞类型以非常低的效率产生。
[0006] 为了使用干细胞作为起始材料产生在细胞中用于研究和治疗的细胞群体，将有利 地克服至想要的最终群体的转化量以及转化速率方面的生产效率问题。例如，鉴定产生细 胞类型，如中内胚层细胞、内胚层细胞和肝细胞的群体（其可以以增加的增殖速率在培养 物中产生和/或维持）的方法将是有用的，由此提供更多并且更廉价的细胞供应。此外，为 了使用多种细胞群体（例如肝细胞）用于治疗目的，拥有具有改善的性质，如成熟的细胞群 体提供更好的治疗潜能将是有用的。因此，需要的是内胚层细胞的活力群体和肝细胞的群 体以及用于实现干细胞有效、定向分化成这些细胞类型的方法。本文公开的组合物和方法 解决了这些需要并且还提供了额外的益处。
[0007] 本文公开的全部参考文献、出版物、专利和专利申请以其整体并入本文作为参考。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明尤其提供用于产生内胚层细胞、胰祖细胞、肝细胞和/或来自内胚层细胞 的具有独特性质的其他细胞的组合物（例如，群体）和方法。这些细胞群体可用于多种筛 选和/或治疗用途。
[0010] 因此，一方面，本发明提供内胚层细胞的分离群体，其中至少83%的细胞表达 30父17，至少77%的细胞表达？〇142，或至少76%的细胞表达0乂0?4。在根据（例如应用于） 上述内胚层细胞的分离群体的一些实施方案中，至少83%的细胞表达S0X17并且至少77% 的细胞表达FoxA2。在根据（例如应用于）上述内胚层细胞的分离群体的一些实施方案中， 至少77%的细胞表达？〇以2并且至少76%的细胞表达0乂〇?4。在根据（例如应用于）上述 内胚层细胞的分离群体的一些实施方案中，至少83%的细胞表达S0X17并且至少76%的细 胞表达CXCR4。在根据（例如应用于）上述内胚层细胞的分离群体的一些实施方案中，至少 83%的细胞表达3(?17，至少77%的细胞表达？〇142，并且至少76%的细胞表达0乂〇?4。在 根据（例如应用于）上述内胚层细胞的分离群体的一些实施方案中，内胚层细胞具有变成 肝细胞、胰细胞、胰祖细胞、肝细胞或肺上皮细胞的能力。
[0011] 另一方面，本发明提供包含一个或多个内胚层细胞群体的稳定内胚层细胞库，其 中至少83 %的细胞表达S0X17,至少77 %的细胞表达FoxA2,和/或至少76 %的细胞表达 CXCR4,其中所述群体维持该表型至少10代。在根据（例如应用于）上述稳定内胚层细胞 库的一些实施方案中，内胚层细胞具有变成肝细胞、胰细胞、胰祖细胞、肝细胞或肺上皮细 胞的能力。
[0012] 另一方面，本发明提供获得内胚层细胞群体的方法，所述方法包括：使干细胞群体 与有效量的PI3K α的选择性抑制剂以及有效量的激活蛋白A接触并在足以获得内胚层细 胞群体的条件下培养所述细胞。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实施方案 中，内胚层细胞群体中至少83%的细胞表达S0X17、内胚层细胞群体中至少77%的细胞表 达FoxA2,或内胚层细胞群体中至少76%的细胞表达CXCR4。在根据（例如应用于）上述 任何一种方法的一些实施方案中，至少83%的细胞表达S0X17并且至少77%的细胞表达 FoxA2。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实施方案中，至少77%的细胞表达 FoxA2并且至少76%的细胞表达CXCR4。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些 实施方案中，83%的细胞表达S0X17并且至少76%的细胞表达CXCR4。在根据（例如应用 于）上述任何一种方法的一些实施方案中，至少83 %的细胞表达S0X17,至少77 %的细胞表 达？〇以2，并且至少76%的细胞表达0乂0?4。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一 些实施方案中，内胚层细胞具有变成肝细胞、胰细胞、胰祖细胞、肝细胞或肺上皮细胞的能 力。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实施方案中，与不曾与PI3Kci的选择 性抑制剂和激活蛋白A接触的干细胞相比，内胚层细胞具有更强的生活力和/或增殖。
[0013] 在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实施方案中，干细胞是成人干细 胞、胚胎干细胞、或诱导型多能干细胞。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实 施方案中，在合格的基质胶中培养干细胞。在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一 些实施方案中，在悬浮液中培养干细胞。
[0014] 在根据（例如应用于）上述任何一种方法的一些实施方案中，ΡΙ3Κα的选择性抑 制剂是这样的化合物，其是式（I)的稠合嘧啶：
[0015]
【权利要求】
1. 内胚层细胞的分离群体，其中至少83%的细胞表达S0X17,至少77%的细胞表达 FoxA2,或至少76%的细胞表达CXCR4。
2. 权利要求1的内胚层细胞的分离群体，其中至少83%的细胞表达S0X17并且至少 77%的细胞表达？(《八2。
3. 权利要求1或2的内胚层细胞的分离群体，其中至少77%的细胞表达FoxA2并且至 少76%的细胞表达CXCR4。
4. 前述权利要求任一项的内胚层细胞的分离群体，其中至少83%的细胞表达S0X17并 且至少76%的细胞表达CXCR4。
5. 前述权利要求任一项的内胚层细胞的分离群体，其中至少83%的细胞表达S0X17， 至少77%的细胞表达FoxA2,并且至少76%的细胞表达CXCR4。
6. 前述权利要求任一项的内胚层细胞的分离群体，其中所述内胚层细胞具有变成肝细 胞、胰细胞、胰祖细胞、肝细胞、肺细胞、呼吸道祖细胞或肺上皮细胞的能力。
7. 包含一个或多个内胚层细胞群体的稳定内胚层细胞库，其中至少83%的细胞表达 S0X17,至少77%的细胞表达FoxA2,和/或至少76%的细胞表达CXCR4,其中所述群体维持 该表型至少10代。
8. 权利要求7的库，其中所述内胚层细胞具有变成肝细胞、胰细胞、胰祖细胞、肝细胞、 肺细胞、呼吸道祖细胞或肺上皮细胞的能力。
9. 获得内胚层细胞群体的方法，所述方法包括：使干细胞群体与有效量的PI3Kci的选 择性抑制剂和有效量的激活蛋白A接触并在足以获得内胚层细胞群体的条件下培养细胞。
10. 权利要求9的方法，其中内胚层细胞群体中至少83%的细胞表达SOX17,内胚层细 胞群体中至少77%的细胞表达FoxA2,或内胚层细胞群体中至少76%的细胞表达CXCR4。
11. 权利要求10的方法，其中至少83 %的细胞表达SOX17并且至少77 %的细胞表达 FoxA2〇
12. 权利要求10或11的方法，其中至少77%的细胞表达FoxA2并且至少76%的细胞 表达CXCR4。
13. 权利要求10-12任一项的方法，其中83%的细胞表达SOX17并且至少76%的细胞 表达CXCR4。
14. 权利要求10-13任一项的方法，其中至少83 %的细胞表达SOX 17，至少77 %的细胞 表达FoxA2,并且至少76%的细胞表达CXCR4。
15. 权利要求9-14任一项的方法，其中所述内胚层细胞具有变成肝细胞、胰细胞、胰祖 细胞、肝细胞或肺上皮细胞的能力。
16. 权利要求9-15任一项的方法，其中与不曾与PI3Ka的选择性抑制剂和激活蛋白A 接触的干细胞相比，所述内胚层细胞具有更强的生活力和/或增殖。
17. 权利要求9-16任一项的方法，其中所述干细胞是成人干细胞、胚胎干细胞或诱导 型多能干细胞。
18. 权利要求9-17任一项的方法，其中在合格的基质胶中培养所述干细胞。
19. 权利要求9-18任一项的方法，其中在悬浮液中培养所述干细胞。
20. 权利要求9-19的方法，其中所述PI3K a的选择性抑制剂是这样的化合物，其是式 (I)的稠合嘧啶：
其中 m是0或1 ; R3°是H或C「C6烷基； R4和R5与其附着的N原子一起形成5-或6元饱和含N杂环基团，其包括选自N、S和 〇的〇或1个额外的杂原子，其可以融合到苯环上并且其是未被取代或被取代的；或R4和 R5之一是烷基，而另一个是如上定义的5-或6元饱和含N杂环基团或被如上定义的5-或 6兀饱和含N杂环基团取代的烧基； R2选自： (a)
其中R6和R7与其附着的氮原子一起形成未被取代或被取代的吗啉、硫吗啉、哌啶、哌 嗪、氧氮杂环戊烷或硫氮杂环戊烷基团；和 (b)
其中Y是C2 - C4亚烷基链，其在链的组成碳原子之间和/或链的一端或两端含有选自 0、N和S的1个或2个杂原子，并且其是未被取代或被取代的； 并且R3是未被取代或取代的吲唑基团； 或其药学上可接受的盐。
21.权利要求20的方法，其中所述稠合的嘧啶是式（la):
其中X是S或0,并且R1、R2、R3和n如权利要求20中所定义。
22. 权利要求20的方法，其中所述稠合的嘧啶是式（lb):
其中X是S或0,并且R1、R2、R3和n如权利要求20中所定义。
23. 权利要求20的方法，其中所述化合物选自： 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (4-甲基-哌嗪-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d] 嘧啶； 4-[2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌嗪-1-磺 酸二甲基酰胺； {4- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基}_吗啉-4-基-甲酮； 4-[2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌嗪-1-甲 酸（2-甲氧基-乙基）_甲基-酰胺； {4- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基} -N，N-二甲基-乙酰胺； 4-[2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌嗪-1-甲 酸二甲基酰胺； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- [4- (3-吗啉-4-基-丙烷-1-磺酰）-哌 嗪-1-基甲基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_(2_甲氧基-乙基）-甲基-胺； (3-{4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-磺酰}_丙基）_二甲基-胺； 2-{4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基}_2_甲基-丙-1-醇； 1' -[2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-[1，4' ] 双哌啶基； 2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6-(4-吗啉-4-基-哌啶-1-基甲基）-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6-(4-嘧啶-2-基-哌嗪-1-基甲基）-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 1- (2-羟基-乙基）-4- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧 啶-6-基甲基]-哌嗪-2-酮； 6-(4-环丙基甲基-哌嗪-1-基甲基）-2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2- (lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-6-(4-吡啶-2-基-哌嗪-1-基甲基）-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- [4- (2, 2, 2-三氟-乙基）-哌嗪-1-基甲 基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-6-(4-噻唑-2-基-哌嗪-1-基甲基）-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2_ (6-氟-1H-吲唑-4-基）-6- (4-甲基-哌嗪-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6-(4-吡啶-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- (4-噻唑-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6-[4- (5-甲基-呋喃-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌啶-4-甲 酸酰胺； 2- (lH-吲唑-4-基）-6-[4-(2_甲氧基-1，1-二甲基-乙基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2-(lH-吲唑-4-基）-6-[(3R, 5S)-4-(2-甲氧基-乙基）-3, 5-二甲基-哌嗪-1-基甲 基]-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 1-[2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌啶-4-甲 酸（2-甲氧基-乙基）_甲基-酰胺； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌啶-4-甲 酸二甲基酰胺； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6-(4-吡啶-3-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌啶-4-甲 酸甲基酰胺； 2- {4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基}-N_甲基-异丁酰胺； 2-{4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基} -2-甲基-1-吡咯烷-1-基-丙-1-酮； 2- (1H-吲唑-4-基）-6-[4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2-(lH-吲唑-4-基）-6-[4-(5-甲基-异坐-3-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 1- {4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基}_2_甲基-丙-2-醇； 环丙基甲基-{1-[2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基 甲基]-哌啶-4-基} - (2-甲氧基-乙基）-胺； 6- [4- (1-乙基-1-甲氧基甲基-丙基）-哌嗪-1-基甲基]-2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- [4- (1-甲氧基甲基-环丙基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_(2_甲氧基-乙基）-(2,2,2_三氟-乙基）-胺； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- [4- (2-甲氧基-乙基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗啉-4-基-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_甲醇； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- (4-吡啶-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- [4- (6-甲基-吡啶-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2-(lH-吲唑-4-基）-6-[4-(4_甲基-噻唑-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}-吡啶-2-基-胺； N-{1-[2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基} -2-甲氧基-N-甲基-乙酰胺； N-{1-[2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基} -N-甲基-甲烷磺酰胺； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_(3_甲氧基-丙基）-甲基-胺； 6-((3S, 5R)-3, 5-二甲基-4-吡啶-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-2-(lH-吲 唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (4-甲氧基甲基-哌啶-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_(2_甲氧基-乙基）-噻唑-2-基甲基-胺； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-4-批 啶-2-基甲基-哌啶-4-醇； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_异丙基-(2-甲氧基-乙基）-胺； 2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6-[4-(批啶-2-基氧）-哌啶-1-基甲基]-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； N-{1-[2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基} -N- (2-甲氧基-乙基）-甲烷磺酰胺； 2-{l-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_丙-2-醇； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- [4- (1-氧-吡啶-3-基甲基）-哌嗪-1-基甲 基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- (4-吗啉-4-基甲基-哌啶-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基甲基}_(2_甲氧基-乙基）-甲基-胺； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基甲基}_二甲基-胺； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-3-基} _ (2-甲氧基-乙基）-甲基-胺； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌啶-3-甲 酸甲基酰胺； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (3-甲氧基甲基-哌啶-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并 [3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- (4-吡啶-2-基甲基-哌啶-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- [4- (2-甲氧基-乙氧基）-哌啶-1-基甲基]-4-吗啉-4-基-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 6-((3R, 5S)-3, 5-二甲基-4-噻唑-2-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-2-(lH-吲 唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- [4- (1-氧-吡啶-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲 基]-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- [4- (2-甲氧基-乙基）-哌啶-1-基甲基]-4-吗啉-4-基-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (4-甲磺酰-哌啶-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d] 嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_ (3-甲磺酰-丙基）-甲基-胺； 2- (1H-吲唑-4-基）-6-[4- (3-甲氧基-丙烷-1-磺酰）-哌啶-1-基甲基]-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； (R) -1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-3-甲酸甲基酰胺； (S) -1-[2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-3-甲酸甲基酰胺； 6-(4_咪唑-1-基甲基-哌啶-1-基甲基）-2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-6-吗啉-4-基甲基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (3-甲基-哌啶-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d] 嘧啶； {1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-3-基}_甲醇； 2-{l-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 啶-4-基}_乙醇； 1- [2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-4-噻 唑-2-基-哌啶-4-醇； 2- (1-甲基-1H-吲唑-4-基）-6-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩 并[3, 2-d]嘧啶； 2- (2-甲基-2H-吲唑-4-基）-6- (4-甲基-哌嗪-1-基甲基）-4-吗啉-4-基-噻吩 并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- (4-噻唑-4-基甲基-哌嗪-1-基甲基）-噻 吩并[3, 2-d]嘧啶； 1- {4-[2-(1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶-6-基甲基]-哌 嗪-1-基} -3-苯氧基-丙-2-醇； 6-[4-(lH-咪唑-2-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 6-[4-(3H-咪唑-4-基甲基）-哌嗪-1-基甲基]-2_(1H-吲唑-4-基）-4_吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶； 2- (1H-吲唑-4-基）-4-吗啉-4-基-6- ((2S, 6R) -2, 4, 6-三甲基-哌嗪-1-基甲 基）_噻吩并[3, 2-d]嘧啶； {4-[2-(lH-吲唑-4-基）-4_吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基甲基]-1-甲磺 酰-哌嗪-2-基}_甲醇；和 2- (1H-吲唑-4-基）-6- (4-甲磺酰-3-甲氧基甲基-哌嗪-1-基甲基）-4-吗 啉-4-基-噻吩并[3, 2-d]嘧啶；和上文提及的游离化合物的药学上可接受的盐。
24.权利要求20的方法，其中所述PI3K a的选择性抑制剂选自以下化合物：
26. 权利要求20的方法，其中所述PI3K a的选择性抑制剂是4-[2-(1H-吲 唑-4-基）-6-[ (4-甲基磺酰哌嗪-1-基）甲基]噻吩并[3, 2-d]嘧啶-4-基]吗啉。
27. 权利要求9-26任一项的方法，其中所述P13K a的选择性抑制剂也是P13KS的抑 制剂。
28. 权利要求9-27任一项的方法，其中所述PI3Ka的选择性抑制剂的有效量是 750nM。
29. 权利要求9-28任一项的方法，其中所述激活蛋白A的有效量是100ng/ml培养基。
30. 权利要求9-29任一项的方法，其中在足以获得内胚层细胞群体的条件下培养细胞 包括在缺少Wnt3a的情况下培养细胞。
31. 权利要求9-30任一项的方法，其中所述方法进一步包括使干细胞群体与有效量的 mTOR抑制剂接触。
32. 权利要求9-31任一项的方法，其中所述方法进一步包括使干细胞群体与PI3KS的 选择性抑制剂接触。
33. 使用权利要求9-32的任何一种方法获得的内胚层细胞群体。
34. 获得内胚层细胞群体的方法，所述方法包括：使干细胞群体与有效量的mTOR的抑 制剂和有效量的激活蛋白A接触并在足以获得内皮细胞群体的条件下培养细胞。
35. 权利要求34的方法，其中所述内胚层细胞群体中至少61 %的细胞表达S0X17或所 述内胚层细胞群体中至少40%的细胞表达FoxA2。
36. 权利要求34或35的方法，其中所述内胚层细胞群体中至少61 %的细胞表达S0X17 并且所述内胚层细胞群体中至少40%的细胞表达FoxA2。
37. 权利要求34-36任一项的方法，其中所述内胚层细胞具有变成肝细胞、胰细胞、胰 祖细胞、肝细胞或肺上皮细胞的能力。
38. 权利要求34-37任一项的方法，其中所述mTOR的抑制剂是siRNA或小分子。
39. 权利要求38的方法，其中所述小分子选自：
41. 使用权利要求34-40的任何一种方法获得的内胚层细胞群体。
42. 用于鉴定促进内胚层细胞分化成目的细胞类型的因子的方法，所述方法包括：使 内胚层细胞群体与因子接触，监测内胚层细胞群体分化成目的细胞类型，由此鉴定促进内 胚层细胞分化成目的细胞类型的因子，其中所述群体中至少83%的细胞表达SOX17,群体 中至少77%的细胞表达？(《42，或群体中至少76%的细胞表达0乂〇?4。
43. 用于鉴定抑制内胚层细胞分化的因子的方法，所述方法包括：使内胚层细胞群体 与因子接触，监测细胞分化，由此鉴定抑制内胚层细胞分化的因子，其中所述群体中至少 83%的细胞表达SOX17,群体中至少77%的细胞表达FoxA2,或群体中至少76%的细胞表达 CXCR4。
44. 用于筛选药物候选物的毒性的方法，所述方法包括：使内胚层细胞群体与药物接 触并监测细胞的毒性，由此鉴定所述药物候选物是否有毒，其中所述群体中至少83%的细 胞表达3(?17，群体中至少77%的细胞表达？(《42，或群体中至少76%的细胞表达0乂〇?4。
45. 向需要治疗的患者提供基于细胞的疗法的方法，其包括向所述患者施用内胚层细 胞群体，其中所述群体中至少83%的细胞表达SOX17,群体中至少77%的细胞表达FoxA2， 或群体中至少76%的细胞表达CXCR4。
46. 权利要求45的方法，其中所述患者患有肝纤维化、肝硬变、肝衰竭、肝和胰癌、胰衰 竭、肠组织替代酶缺陷、克罗恩病、炎性肠综合征和肠癌。
47. 获得肝细胞群体的方法，所述方法包括：在足以获得肝细胞群体的条件下培养 内胚层细胞群体，其中群体中至少83%的细胞表达S0X17,群体中至少77%的细胞表达 FoxA2,或群体中至少76%的细胞表达CXCR4。
48. 权利要求47的方法，其中肝细胞群体中至少56%的肝细胞表达AFP。
49. 权利要求47或48的方法，其中通过使干细胞群体与有效量的PI3K a的选择性抑 制剂和有效量的激活蛋白A接触并在足以获得肝细胞群体的条件下培养细胞来获得所述 内胚层细胞。
50. 获得肝细胞群体的方法，所述方法包括：以有效量的PI3K a的选择性抑制剂和有 效量的激活蛋白A培养干细胞群体并在足以获得肝细胞群体的条件下培养细胞。
51. 权利要求50的方法，其中足以获得肝细胞群体的所述条件包括在含有有效量的激 活蛋白A并缺少其他生长因子的培养基中培养内胚层细胞。
52. 权利要求50或51的方法，其中所述其他生长因子选自：FGF2、FGF4、BMP2和BMP4。
53. 使用权利要求37-52的任何一种方法获得的肝细胞群体。
54. 肝细胞的分离群体，其中所述肝细胞具有以下性质中的一种或多种：肝细胞分泌 白蛋白、A1AT或白蛋白和A1AT ;CYPlAl/2活性是可诱导的；或肝细胞表达AFM、AFP、AGXT、 ALB、CEBPA、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、CABP1、FOXA1、FOXA2、GSTA1、HNF1A、 HNF1B、HNF4a、IL6R、SERPINA1、SERPINA3、SERPINA7、SLC02B1、TAT、VCAM1 或其组合。
55. 向需要治疗的患者提供基于细胞的疗法的方法，其包括向所述患者施用有效量的 权利要求53或54的肝细胞群体。
56. 筛选药物候选物毒性的方法，其包括使通过权利要求47-52的任何一种方法获得 的肝细胞群体与药物候选物接触，监测肝细胞的毒性，由此鉴定所述药物候选物是否有毒。
57. 用于获得胰祖细胞的方法，所述方法包括： A) .以有效量的⑴mTOR抑制剂和有效量的激活蛋白A或⑵PI3K a的选择性抑制剂 和有效量的激活蛋白A或（3)mT0R抑制剂、PI3K a的选择性抑制剂和有效量的激活蛋白A 培养干细胞群体，并在足以获得内胚层细胞群体的条件下培养细胞；并 B) .在足以促进内胚层细胞分化成胰祖细胞的条件下培养所述内胚层细胞。
58. 用于获得胰祖细胞的方法，所述方法包括：在足以促进内胚层细胞分化成胰祖细 胞的条件下培养权利要求1_5、33或41任一项的内胚层细胞的初始群体。
59. 权利要求57或权利要求58的方法，其中所述胰祖细胞可以分化成胰内分泌细胞、 胰外分泌细胞和胰导管细胞。
60. 权利要求59的方法，其中所述胰内分泌细胞选自a细胞、0细胞、S细胞和Y细胞。
61. 权利要求59或60的方法，其中胰内分泌细胞能够产生以下中的一种或多种：胰高 血糖素、胰岛素、生长抑素和胰多肽。
62. 用于获得分化的胰细胞的方法，所述方法包括在足以促进胰祖细胞分化成分化的 胰细胞的条件下培养通过权利要求57或58的任何一种方法产生的胰祖细胞。
63. 权利要求62的方法，其中所述分化的胰细胞选自胰内分泌细胞、胰外分泌细胞和 胰导管细胞。
64. 权利要求62或63的方法，其中所述分化的胰细胞能够产生以下中的一种或多种： 胰高血糖素、胰岛素、生长抑素和胰多肽。
65. 通过权利要求57-61任一项的方法产生的胰祖细胞的分离群体。
66. 胰祖细胞的分离群体，其中所述胰祖细胞表达以下标志物中的一种或多种：Pdxl、 C-肽、ARX、GLIS3、HNFla、HNFlb、HNF4a、KRT19、MNX1、RFX6、SERPINA3、0NECUT1、NKX2-2 或 其任何组合。
67. 通过权利要求62-64任一项的方法产生的分化的胰细胞的分离群体。
68. 分化的胰细胞的分离群体，其中所述胰细胞在悬浮液中形成簇并在悬浮液中有活 力。
69. 向需要治疗的患者提供基于细胞的疗法的方法，其包括向所述患者施用有效量的 权利要求65或66的胰祖细胞群体。
70. 向需要治疗的患者提供基于细胞的疗法的方法，其包括向所述患者施用有效量的 权利要求67或68的分化的胰细胞群体。
71. 筛选药物候选物的毒性的方法，其包括使通过权利要求57、58或62的任何一种方 法获得的胰细胞群体与药物候选物接触，监测胰细胞的毒性，由此鉴定所述药物候选物是 否有毒。
【文档编号】C12N5/074GK104350144SQ201380026250
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2012年5月23日
【发明者】E·杜代蒙特, H·乌帕尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司