改善的脂肪酸衍生物的生产的制作方法

改善的脂肪酸衍生物的生产的制作方法
【专利摘要】本发明公开涉及重组宿主细胞，其包括有效改善了脂肪酸衍生物的效价、产率和/或生产率的菌株修饰。本发明公开进一步涉及包括重组宿主细胞的细胞培养物，其中所述的重组宿主细胞用于发酵生产脂肪酸衍生物及其组合物。
【专利说明】改善的脂肋酸衍生物的生产
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年4月2日提交的美国临时申请号61/619, 324的权益，并且该 申请W引用方式全文并入本文。
[000引 序列表
[0004] 本发明包括序列表，该序列表通过EFS-WebWASCn形式提交，并W引用方式全文 并入本文。在2013年4月2日创建的所述的ASCII拷贝命名为LS00042PCT_^.txt，并且 大小为143, 098字节。

【技术领域】
[0005] 本发明公开涉及包括细胞株修饰的重组宿主细胞，其有效地改善了脂肪酸衍生物 的效价、产率和/或生产率。本发明公开进一步涉及细胞培养物，其包括用于发酵生产脂肪 衍生物及其组合物的重组宿主细胞。

【背景技术】
[0006] 包括脂肪酵、脂肪醇、碳氨化合物（焼姪和帰姪）、脂肪醋（例如蜡、脂肪酸醋或脂 肪醋）和丽在内的脂肪酸衍生物代表了工业化学品和燃料的重要类别。该些分子及其衍生 物具有多种用途，包括但不限于用作表面活性剂、润滑剂、增塑齐U、溶齐U、乳化齐U、软化剂、增 稠剂、风味剂、香料和燃料。原油是目前用于生产石油化学品和燃料的原材料的主要来源。 由石油衍生的两类主要原材料为短链帰姪（例如己帰和丙帰）和芳香族（例如苯和二甲苯 异构体）。该些原材料通过使用多种方法（例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整）W相当 多的花费从原油中的长链碳氨化合物断裂而衍生得到。该些原材料可W用于制造石油化学 品，例如单体、溶剂、洗涂剂和粘合剂，而该些化学品不能W其他方式由原油直接精炼。由 此，石油化学品可W用于制造专口的化学品，例如塑料、树脂、纤维、弹性体、药物、润滑剂、 凝胶等。可W由石油化学品原材料生产的具体的专口化学品包括但不限于脂肪酸、碳氨化 合物、脂肪酵、脂肪醇、醋和丽。
[0007] 碳氨化合物例如具有许多商业用途。依此，短链焼姪和帰姪用于运输燃料。长链 帰姪用于塑料、润滑剂和合成润滑剂。此外，帰姪用作生产醇、醋、增塑剂、表面活性剂、叔 胺、增强型石油采收剂、脂肪酸、硫醇、帰基玻巧酸酢、环氧化物、氯化焼姪、氯化帰姪、蜡、燃 料添加剂和阻流剂的供料。类似地，醋具有多种商业用途。例如生物柴油（备选燃料）由 醋（例如脂肪酸甲基醋、脂肪酸己基醋等）制成。一些低分子量的醋是具有怡人气味的挥 发物，该使它们得W用作香料或风味剂。此外，醋用作漆、涂料和清漆的溶剂。此外，一些天 然形成的物质（例如蜡、脂肪和油）还由醋制成。醋进一步用作树脂和塑料中的软化剂、增 塑剂、阻燃剂W及汽油和油中的添加剂。此外，醋可W用于制造聚合物、膜、纺织品、染料和 药物。
[0008] 酵用于生产多种专口的化学品。例如酵用于生产聚合物、树脂（例如酷酵树脂）、 染料、风味剂、增塑剂、香精、药物和其他化学品，其中一部分可W用作溶剂、防腐剂或消毒 齐u。此外，某些天然和合成的化合物（例如维生素）和用作激素的化合物为酵。此外，许多 糖包括酵基。脂肪酵可W通过化学或酶还原而转化为脂肪醇。相似地，脂肪醇也具有许多 商业用途。更短链的脂肪醇用于化妆品和食品工业，例如乳化剂、软化剂和增稠剂。由于脂 肪醇的两性本性，脂肪醇起到非离子表面活性剂的作用，其用于个人护理和家庭产品，例如 洗涂剂。此外，脂肪醇用于蜡、树胶、树脂、药品软膏和洗剂、润滑油添加剂、纺织品抗静电和 整理剂、增塑剂、化妆品、工业溶剂和用于脂肪的溶剂。脂肪醇（例如脂肪族的醇）包括8 至22个碳原子的链。脂肪醇通常具有偶数的碳原子、W及与末端碳连接的单个醇基（-0H)。 一些脂肪醇是不饱和的，一些脂肪醇是支化的。它们广泛用于工业化学中。大多数天然的 脂肪醇W蜡的形式被发现，其为脂肪酸与脂肪醇形成的醋。它们由细菌、植物和动物产生。 目前，脂肪醇是通过脂肪酸（其由天然来源产生，该天然来源例如挪子油、踪搁油、踪搁坚 果油、牛脂和猪油）的催化氨化或者通过a-帰姪（由石油化学品供料产生）的化学水合 而生产。由天然来源衍生的脂肪醇具有可变的链长。脂肪醇的链长对于具体应用而言是重 要的且特异性的。此外，脂肪醇脱水形成a-帰姪还可W通过化学催化作用来完成。
[0009] 由于勘探、提取、运输和精炼用于化学和燃料产品的石油提出了固有的挑战，本领 域需要备选的来源，其可W经济且高效地产生W用于化学和燃料生产。此外，特别考虑到居 住在该个星球上的人口从过去W来一直在增长，所W燃烧石油基燃料已经成为环境的严重 危害。因此，需要石油替代物，其不能与产生勘探、提取、运输和精炼石油所造成的相同类型 的环境破坏。
[0010] 生产可再生石油的一种选择是通过改造宿主细胞来生产可再生的石油。生物衍 生的燃料和化学品提供了超过石油基燃料的益处。诸如碳氨化合物（例如焼姪、帰姪或快 姪）、脂肪醇、醋、脂肪酸、脂肪酵和丽之类的生物衍生的化学品由生物质直接转化成所需的 化学产品。然而，为了由商业上切实可行的可发酵的糖或生物质得到生物衍生的脂肪酸衍 生物用作用于生产可再生化学品和燃料的来源，必须优化所述的方法W便高效地转化和回 收产品。近年来，在生物衍生的燃料和化学品的研发中，有一个研究和研发的焦点。然而， 所述的相关方法和产品仍非常需要改善，W使得生物衍生的燃料和化学品成为商业上切实 可行的选择。需要改善的领域包括生产方法的能量效率、W及终产品的产率。本发明公开 解决了该需要。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明公开的一个方面提供了具有基因改造的多核巧酸序列的重组宿主细胞， 其中所述的多核巧酸序列编码一种或多种具有特异性酶活性的多肤。所述的多核巧酸 序列对于宿主细胞是外源的或内源的。依此，本发明公开提供了具有基因改造的多核 巧酸序列的重组宿主细胞，其中所述的基因改造的多核巧酸序列编码一种或多种如下多 肤，其中所述的多肤具有选自W下的活性，包括但不限于3-轻基癸醜基-[acp]脱水酶 巧.C. 4. 2. 1. 60)活性；目-丽脂醜基-ACP合酶I巧.C. 2. 3. 1. 41)活性；目-丽脂醜基-ACP 合酶IUE.C. 2. 3. 1. 179)活性；[acp]S-丙二醜基转移酶{丙二醜基-CoA-ACP醜基转 移酶}巧.(：.2. 3. 1.39)活性；3-氧醜基-{目-丽脂醜基}-ACP还原酶巧.C. 1. 1. 1. 100) 活性；目-丽脂醜基-ACP合酶III(E.C. 2. 3. 1. 180)活性；帰醜基-ACP还原酶（NADH) (E.C. 1. 3. 1. 9)活性；帰醜基-ACP还原酶（NADPHHE.C. 1. 3. 1. 10)活性；3-轻基-醜 基-[acp]脱水酶化C. 4. 2. 1. 59)活性；W及反-2,顺-3-癸帰醜基-ACP异构酶 巧.C. 5. 3. 3. 14)活性，其中当在有效表达多核巧酸的条件下在包括碳源的培养基中培养 时，所述的重组宿主细胞W比相应的野生型宿主细胞更高的效价、产率和生产率来生产脂 肪酸衍生物。在相关的方面中，当所述的多肤与至少一种其他的具有酶活性的多肤组合表 达时，重组宿主细胞W更高的效价、产率和/或生产率生产脂肪酸衍生物组合物。在另一 个方面中，当所述的多肤与至少5种其他的具有酶活性的多肤组合表达时，重组宿主细胞 W更高的效价、产率和/或生产率生产脂肪酸衍生物组合物。在另一个方面中，当所述的 多肤与至少2种、3种、4种、5种、6种或更多的具有酶活性的多肤组合表达时，重组宿主细 胞W更高的效价、产率和/或生产率生产脂肪酸衍生物组合物。在另一个相关的方面中， 重组宿主细胞包括进一步编码为醜基载体蛋白质（ACP)的多肤的一种或多种基因改造的 多核巧酸序列。ACP可W与一种或多种如下多肤组合表达，其中所述的多肤编码任一种酶 活性，其中当在合适的条件下培养时，ACP进一步增加重组宿主细胞的效价、产率和/或生 产率。在另一个相关的方面中，基因改造的多核巧酸序列进一步编码具有accABCD活性 (E.C. 6. 4. 1. 2)的多肤。accABCD可W与一种或多种编码任一种酶活性的多肤组合表达， 其中当在合适的条件下培养时，accABCD进一步增加重组宿主细胞的效价、产率和/或生产 率。
[0013] 本发明公开的另一个方面提供了具有基因改造的多核巧酸的重组宿主细胞，其中 所述的基因改造的多核巧酸序列编码一种或多种多肤，其中所述的多肤具有酶活性，包括 但不限于反-2,顺-3-癸帰醜基-ACP异构酶活性（化bA或化bM);目-丽脂醜基-ACP合酶 I(化bB);丙二醜基-CoA-ACP醜基转移酶（化bD);目-丽脂醜基-ACP合酶I(化bF或化bB); 目-丽脂醜基-ACP还原酶（化bG);目-丽脂醜基-ACP合酶III(化bH);帰醜基-ACP还原 酶（f油I、f油L、化bV或f油K) ;3-轻基-醜基-[acp]脱水酶（f油A或f油幻；和反-2-帰 醜基-ACP还原酶II(化bK)。在相关的方面中，多肤选自f油A、f油B、f油D、f油F、f油G、 f油H、f油I、化bL、化bV、化bZ、化bM、化bK和/或它们的组合。在另一个相关的方面中，多 肤选自：鼠伤寒沙口氏杆菌（Salmonellatyphimurium)(NP_460041)的F油A;得自大肠埃 希氏菌巧scherichiacoli) (NP_416826)的F油B;得自鼠伤寒沙口氏杆菌（NP_460164)的 F油D;得自鼠伤寒沙口氏杆菌（NP_46016W的F油G;得自鼠伤寒沙口氏杆菌（NP_46016^ 的F油H;得自鼠伤寒沙口氏杆菌（NP_459232)的化bZ;得自变性链球菌（Str巧tococ州S mutans) (AAN59379)的F油M;得自肺炎链球菌（Streptococ州Spneumoniae) (AAF98273) 的F油K;得自霍乱弧菌（Vibriocholera) (YP_001217283)的F油V;得自丙丽下醇梭菌 (Clostridiumacetobut}di州m) (NP_350156)的F油F;得自枯草芽抱杆菌亚种枯草菌株 168炬acillussubtillissubsp.subtilisstr. 168) (NP_389054)的F油L;得自枯草芽 抱杆菌亚种枯草菌株168(NP_388745)的F油I;得自不动杆菌菌种（Acinetobactersp.) ADP1(YP_047630)的F油I;得自MarinobacteraquaeoliVT8(YP_958813)的F油I;得 自不透明红球菌巧hodococcusopa州s)B4(YP_002784194)的F油I;得自不动杆菌菌种 ADP1(YP_046731)的F油H;得自MarinobacteraquaeoliVT8(YP_958649)的F油H;得自不 透明红球菌B4 (YP_00278448)的F油H或它们的组合。
[0014] 本发明公开进一步考虑了具有基因改造的多核巧酸序列的重组宿主细胞，其中所 述的基因改造的多核巧酸序列编码ACP多肤，其中当在有效表达ACP多肤的条件下在包括 碳源的培养基中培养时，重组宿主细胞W比相应的野生型宿主细胞更高的效价、产率或生 产率生产脂肪酸衍生物。在相关的方面中，基因改造的多核巧酸序列进一步编码具有磯酸 泛醜琉基己胺基转移酶化C. 2. 7. 8. 7)活性的多肤。此处，基因改造的多核巧酸序列包括 编码磯酸泛醜琉基己胺基转移酶化C. 2. 7. 8. 7)的S巧基因。在相关的方面中，基因改造的 多核巧酸序列进一步编码具有accABCD活性化C. 6. 4. 1. 2)的多肤。ACP可W与accABCD 和/或磯酸泛醜琉基己胺基转移酶组合表达，其中在合适的条件下培养时，任何表达多肤 的组合都会进一步使重组宿主细胞的效价、产率和/或生产率增加。在另一个相关的方面 中，ACP作为重组宿主细胞中表达的终末途径的酶由同一有机体衍生得到，其中终末途径的 酶切割任何的醜基-ACP物质，其为脂肪酸生物合成途径的一部分。ACP对于宿主细胞而言 是外源的或内源的。
[0015] 本发明公开进一步涵盖了包括如下基因改造的多核巧酸序列的重组宿主细胞，其 中所述的基因改造的多核巧酸序列包括转座子，其中将转座子插入到yijp基因中影响位 于yijP基因侧翼的第二基因，其中第二基因编码受到上调的或下调的多核巧酸，并且其中 上调的或下调的多核巧酸编码如下多肤，当所述宿主细胞在有效表达所述多肤的条件下 在包括碳源的培养基中培养时，所述上调的或下调的多核巧酸编码的多肤影响脂肪酸衍 生物的生产。yijP基因的任一侧的侧翼上可W具有基因。在相关的方面中，转座子插入 到^jP基因中使得^jP基因或其多核巧酸失活，该影响位于^jP基因侧翼的一个或多 个基因，其中一个或多个侧翼基因编码如下多肤，当所述的宿主细胞在有效表达所述多肤 的条件下在包括碳源的培养基中培养时，所述一个或多个侧翼基因编码的多肤影响脂肪 酸衍生物组合物的生产。在一个相关的方面中，侧翼基因包括多核巧酸，其包括但不限于 ppc,yijO,frwD,pflCpflD或argE。
[0016] 本发明公开的另一个方面提供了包括基因改造的多核巧酸序列的重组宿主细胞， 其中所述的基因改造的多核巧酸序列编码磯酸帰醇式丙丽酸駿化酶（PPC)多肤，其中当在 有效表达PPC多肤的条件下在包括碳源的培养基中培养时，所述的重组宿主细胞W比相应 的野生型宿主细胞更高的效价、产率或生产率产生脂肪酸衍生物组合物。
[0017] 此外，本发明公开的另一个方面提供了细胞培养物，其包括本发明提出的任一种 重组宿主细胞（上文所述）。将重组宿主细胞在培养基中培养，该样根据本发明提出的基因 改造方法，重组宿主细胞生产脂肪酸衍生物组合物（上文所述）。在相关的方面中，由本发 明公开的重组宿主细胞生产的脂肪酸衍生物组合物包括但不限于脂肪酸、脂肪醋、脂肪醇、 脂肪酵、焼姪、端帰姪、内帰姪和丽。在另一个相关的方面中，脂肪酸衍生物为C6、C8、CIO、 C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18脂肪酸衍生物。在另一个相关的方面中，脂肪酸衍生物 为C10:1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:l的不饱和脂肪酸衍生物。在另一个相关的方面中， 脂肪酸衍生物组合物包括C8、CIO、C12、C14、C16和C18脂肪酸衍生物中的一种或多种。由 包括本发明公开的重组宿主细胞的细胞培养物生产的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪酸、月旨 肪酵、脂肪醇、脂肪醋、焼姪、端帰姪、内帰姪和丽。本发明公开进一步涵盖了；包括脂肪酸衍 生物的脂肪酸衍生物组合物，其中在所述的脂肪酸衍生物中，在距脂肪醇的还原末端的C7 和C8之间，在碳链的位置7处具有双键；包括不饱和脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物； 包括饱和脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物组合物；W及包括支链脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生 物组合物。
[0018] 本发明公开进一步考虑了包括任一种本发明提出的重组宿主细胞的细胞培养物， 其中当相应的野生型宿主细胞在与重组宿主细胞相同的培养条件下时，重组宿主细胞的效 价比相应的野生型宿主细胞的效价高至少大约5%。在此，重组宿主细胞具有大约Ig/L至 大约250g/L的效价，更具体而言，大约90g/L至大约120g/L的效价。在相关的方面中，重 组宿主细胞的产率为至少大约10%至大约40%。在一个方面中，重组宿主细胞的产率为大 约25%。此外，本发明还涵盖了包括任一种本发明提出的重组宿主细胞的细胞培养物，其中 细胞培养物的生产率为大约0. 7mg/L/虹至大约3g/L/虹或更高。
[0019]本发明公开的另一个方面提出了制备重组宿主细胞的方法，包括对重组宿主细胞 进行基因改造，使得该细胞在特定的培养条件下表达由一种或多种多核巧酸序列编码的多 肤序列，其中所述的多核巧酸序列编码具有特异酶活性的一种或多种多肤。
[0020] 附图简述
[0021] 当组合附图一起阅读本发明公开时，可W更好地理解，其中所述的附图起到示意 优选的实施方案的作用。此外，应该理解的是本发明公开不限于附图中公开的具体的实施 方案。
[0022] 图1提出了在重组微生物有机体中W醜基CoA作为前体来生产脂肪酸衍生物的示 例性生物合成途径。该循环由丙二醜基-ACP和己醜基-CoA的缩合来引发。
[0023] 图2提出了示例性脂肪酸的生物合成循环，其中通过丙二醜基-CoA的转醜基作用 形成丙二醜基-ACP来生产丙二醜基-ACP(通过丙二醜基-CoA:ACP醜基转移酶（化bD)的 催化）；然后，目-丽脂醜基-ACP合酶III府地）引发丙二醜基-ACP和己醜基-CoA的缩 合。延长循环开始于目-丽脂醜基-ACP合酶I(fabB)和目-丽脂醜基-ACP合酶II(fab巧 催化的丙二醜基-ACP与醜基-ACP的缩合，从而生产目-丽-醜基-ACP，该目-丽-醜 基-ACP接着被目-丽脂醜基-ACP还原酶（化bG)还原，从而生产目-轻基-醜基-ACP，其 通过目-轻基醜基-ACP脱水酶（化bA或f油幻脱水形成反-2-帰醜-醜基-ACP。F油A还 可W使反-2-帰醜基-醜基-ACP异构化形成顺-3-帰醜基-醜基-ACP，其可W绕过化bl， 并可W被化bB利用（脂肪族链长通常至多为C16)，从而生产目-丽-醜基-ACP。各循环 中的最后步骤是由帰醜基-ACP还原酶（化bl)催化的，其将反-2-帰醜基-醜基-ACP转化 为醜基-ACP。在上文所述的方法中，脂肪酸合成的终止是通过硫醋酶将醜基由醜基-ACP上 移除从而释放游离的脂肪酸（FFA)来进行的。硫醋酶（例如tesA)水解硫醋键，该是通过 硫氨基键在醜基链与ACP之间进行的。
[0024] 图3示出了己醜基-CoA駿化酶（accABCD)的酶复合物的结构和功能。BirA使 accB(其为生物素駿基载体蛋白质）生物素化，其为己醜基-CoA駿化酶的酶复合物的一部 分。
[00巧]图4提出了W醜基-ACP为起始来生产脂肪醇的示例性生物合成途径的概况，其中 脂肪酵的生产是由醜基-ACP还原酶（AAR)或硫醋酶（TE)、W及駿酸还原酶（Car)的酶活性 来催化的。脂肪酵通过酵还原酶（也称为醇脱氨酶）转化为脂肪醇。
[0026] 图5提出了W醜基-ACP为起始来生产脂肪醋的示例性生物合成途径的概况，其中 脂肪醋的生产是通过单酶系统或H酶系统来完成的。
[0027] 图6提出了W醜基-ACP为起始来生产碳氨化合物的示例性生物合成途径的概况； 内帰姪的生产是由OleABCD的酶活性来催化的；焼姪的生产是通过酵脱駿基酶（ADC)将脂 肪酵酶转化形成焼姪来催化的；端帰姪的生产是通过駿化酶将脂肪酸酶转化形成端帰姪来 催化的。
[002引图7示出了由具有化祀基因衰减（即，删除）的MG1655大肠杆菌菌株生产的脂 肪酸衍生物（总的脂肪物质）与大肠杆菌MG1655生产的脂肪酸衍生物的比较。图7提出 的数据显示化祀基因衰减不会影响脂肪酸衍生物的生产。
[0029] 图8示出了在对数期的DAMl_i377中的丙二醜基-CoA水平，其中所述的DAM1_ i377表达8种不同的谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum)己醜基-CoA駿化酶（Acc)操纵子构 建体。
[0030] 图9示出了在对数期的大肠杆菌DAMl_i377中的细胞内短链-CoA水平，其中所述 的大肠杆菌DAMl_i377 表达ptrcl/3_accDACB-birA+panK操纵子构建体。accDACB+birA 在本发明中还称为accD+。
[0031] 图10示出了大肠杆菌菌株DV2中的脂肪酸甲基醋（FAME)的生产，其中所述的大 肠杆菌菌株DV2表达由姪海杆菌（M.hy化ocarbonoclasticus)得到的醋合酶9和由谷氨酸 棒状杆菌得到的己醜基-CoA駿化酶复合物的成分。
[0032] 图11示出了大肠杆菌的脂肪醇生产，其中所述的大肠杆菌在P化质粒上表达细长 聚球藻（Synechococ州Selongatus)PCC7942AARW及由谷氨酸棒状杆菌得到的accD+操纵 子。其中显示了accD+菌株的3个重复样品。
[003引图12A和12B示出当质粒p&_Pta_tesA转化至如图所示的各包括iFAB的菌株中 时，由2个重复的平板筛选得到的总脂肪物质的生产数据（mg/L)，并在FA2培养基中发酵 20小时，从而在32C(图12A)和37C(图12B)完成诱导至收获。
[0034]图13示出具有质粒PDS57和整合的化地1操纵子的大肠杆菌DAM1的FAME生 产。f油H/I基因得自MarinobacteraquaeoliVT8或得自贝氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi)ADPl。关于该些菌株的化bH/I操纵子的更多细节参见表7。
[00巧]图14示出具有质粒PDS57、W及不同构造的谷氨酸棒状杆菌acc基因及整合的f油HI操纵子的大肠杆菌DAM1的FAME生产。该菌株包括得自不透明红球菌或贝氏不动杆 菌ADP1的fabH/I基因。关于fabH/I和acc操纵子的更多细节参见表7。
[0036] 图15示出2种大肠杆菌DAMlpDS57菌株与对照菌株大肠杆菌DAMlpDS57相比的 FAME和FFA效价，其中所述的大肠杆菌DAM1 PDS57菌株选自图13中的整合的化bH/I基因 菌株。
[0037] 图16为iFAB138基因座的图示，其包括整合在iFAB138前面的cat-loxF-Pie盒的 示意图（图16A) 及PT5_iFAB138区（图16B)的示意图。
[0038] 图17示出了菌株V668,其具有修复的巧h和ilvG基因，生产比EG149更高水平的 FFA，其中所述的EG149不具有任一修复的巧h和ilvG基因。
[0039] 图18为插入在菌株1X535的^jP基因中的转座子盒（转座子匹配物68F11)的 图示。其中示出位于转座子盒内的启动子，并且该启动子可W影响相邻基因的表达。
[0040] 图19示出表达细长聚球藻醜基-ACP还原酶（AAR)并共表达多种蓝细菌醜基载体 蛋白质（ACP)的大肠杆菌DV2的脂肪醇的生产。关于ACP来源的细节在表12中提供。
[0041] 图20示出表达无前导序列的大肠杆菌硫醋酶'tesA并共表达蓝细菌醜基载体蛋 白质（cAC巧和枯草芽抱杆菌S巧的大肠杆菌DV2的脂肪酸的生产。
[004引发明详述
[0043] 综述
[0044] 本发明公开至少部分基于该样的发现；在重组宿主细胞中，脂肪酸生物合成途径 的多个方面的修饰有利于增强该宿主细胞生产脂肪酸衍生物。本发明公开涉及具有所需特 征的脂肪酸衍生物的组合物及生产该脂肪酸衍生物的方法。此外，本发明公开涉及重组宿 主细胞（例如微生物有机体）、重组宿主细胞的培养物、制备和使用重组宿主细胞的方法， 例如在培养的重组宿主细胞在发酵生产具有所需特性的脂肪酸衍生物中的用途。
[0045] 更具体而言，所需的脂肪酸衍生物组合物（例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短链 和长链的醇、碳氨化合物、脂肪醇、醋（例如蜡、脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、内帰姪和丽） 的生产通过修饰一种或多种基因（与脂肪酸、脂肪醋、焼姪、帰姪、帰姪（olefin)或脂肪醇的 生物合成途径、生产、降解和/或分泌有关）的表达而增强。本发明公开提供了重组宿主 细胞，其经改造，从而提供相对于未改造的或天然的宿主细胞（例如作为对照细胞的野生 型宿主细胞）而言增强的脂肪酸生物合成，该种增强是通过例如菌株的改善来完成的。依 此，本发明公开鉴定用于本发明公开的重组宿主细胞、方法和组合物的多核巧酸。通常公认 的是，与此类多核巧酸绝对一致的序列不是必须的。例如可W对特定多核巧酸序列进行改 变，并针对活性筛选编码的多肤。该种改变通常包括保守突变和沉默突变（例如密码子优 化）。可W使用本领域已知的方法，针对所需的功能筛选基因改造的或修饰的多核巧酸、W 及编码的变体多肤，其中所述的功能包括但不限于增强的催化活性、增强的稳定性或降低 的抑制作用（例如降低的反馈抑制作用）。
[0046] 本发明公开鉴定根据酶分类巧C)号、与本发明所述的脂肪酸生物合成途径的多 个步骤（即，反应）有关的酶活性，并提供通过所述的EC号分类的示例性多肤（例如酶）、 W及编码此类多肤的示例性多核巧酸。此类示例性多肤和多核巧酸（其通过本发明的编号 和/或序列识别号（SEQIDNO)识别）可用于改造亲代宿主细胞中的脂肪酸途径，从而获 得本发明所述的重组宿主细胞。本发明所述的多肤和多核巧酸是示例性的并且是非限定 的。本领域的那些技术人员可W通过多个数据库获得本发明所述的示例性多肤的同源序列 (例女口theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)提供的rhwEntrez 数据库，theSwissInstituteofBioinformatics提供的ExF*asy数据库，theTechnical UniversityofE5raunschweig提供的BRENDA数据库，W及theBioinformaticsCenterof KyotoUniversityandUniversityofTokyo提供的KEGG数据库，所有该些均可在the WorldWideWeb上获得）。
[0047] 定义
[0048] 除非明确地作出另外的指示，如本说明书和所附的权利要求书所用，单数形式 "一"、"一个"和"一种"包括复数指示物。因此，例如"重组宿主细胞"包括两种或更多种此 类重组宿主细胞，"脂肪醇"包括一种或多种脂肪醇或脂肪醇的混合物，"编码序列的核酸" 包括一种或多种编码序列的核酸；"酶"包括一种或多种酶等。
[0049] 编号：在整个说明书中使用的序列编号得自由NCBI(化tionalCenter化r BiotechnologyInformation)提供的数据库（其由the^tionalInstitutes of化al化U.S.A.维护）（该编号在本发明中确认为"NCBI编号"或备选地确认 为"GenBank编号"），W及得自由theSwissInstituteofBioinformatics提供的 UniProtKnowledgebase(UniProt邸)andSwiss-Prot数据库（该编号在本发明中确认为 "化iProt邸编号，，）。
[0050]酶分类巧C)号；EC号由theNomencla1:ureCommitteeoftheInternational UnionofBiochemistryandMolecularBiology(lUBMB)建立，其描述可W在国际互联网 的lUBMBEnzymeNomencla化re网站上获得。EC号是根据酶催化的反应将酶分类。
[0051]如本文所用，术语"核巧酸"是指多核巧酸的单体单元，其由杂环碱基、糖和一个或 多个磯酸基构成。天然形成的碱基（鸟嘿岭佑)、腺嘿岭（A)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼巧（T)和 尿嚼巧扣)）通常为嘿岭或嚼巧的衍生物，但是应该理解的是天然和非天然形成的碱基类 似物也被包括在内。天然形成的糖为戊糖（五碳糖）、脱氧核糖（其形成DNA)或核糖（其 形成RNA)，但是应该理解的是天然和非天然形成的糖类似物也被包括在内。核酸通常通过 磯酸键连接，从而形成核酸或多核巧酸，但是本领域已知许多其他的键（例如磯硫醜键、测 焼磯酸键等）。
[0052] 如本文所用，术语"多核巧酸"是指核巧酸（RNA)和脱氧核巧酸值NA)的聚合物，其 可W是单链的或双链的，并且其可W包括非天然或改变的核巧酸。术语"多核巧酸"、"核酸 序列"和"核巧酸序列"在本发明中可W交换使用，其是指任何长度的核巧酸（RNA或DNA)的 聚合形式。该些术语是指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA、W及双链和单链RNA。 该术语包括由核巧酸类似物和修饰多核巧酸（例如但不限于甲基化的和/或加帽的多核巧 酸）形成的RNA或DNA的类似物作为等价物。多核巧酸可W为任何形式，包括但不限于质 粒、病毒、染色体、EST、cDNA、mRNA和rRNA。
[0053] 如本文所用，术语"多肤"和"蛋白质"可W交换使用，其是指氨基酸残基的聚合物。 术语"重组多肤"是指通过重组技术生产的多肤，其中通常，将编码所表达蛋白质的DNA或 RNA插入到合适的表达载体中，该载体依此转化宿主细胞，从而生产多肤。
[0054] 如本文所用，术语"同源"和"同源的"是指包括如下序列的多核巧酸或多肤，其 中所述的序列与相应的多核巧酸或多肤序列具有至少大约50%的一致性。优选的是，同 源的多核巧酸或多肤具有如下多核巧酸序列或氨基酸序列，该多核巧酸序列或氨基酸序列 与相应的氨基酸序列或核巧酸序列具有至少大约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96% )、97%、98%或者至少大约 99% 的同源性。如本文所用，术语序列"同源性"和序列"一致性"可W交换使用。
[00巧]本领域的任一普通技术人员很好地知道测定两个或多个序列之间的同源性的方 法。简言之，计算两个序列之间的"同源性"可W按W下方式进行。为了达到最佳比较的目 的，将序列进行比对（例如可W在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或二者中引入空位 W达到最佳比对的目的，并且可W忽视非同源的序列W达到比较目的）。在优选的实施方案 中，用于比较目的的、比对的第一序列的长度为第二序列的长度的至少大约30%、优选至少 大约40%、更优选地至少大约50%、甚至更优选地至少大约60%、甚至更优选地至少大约 70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%或者大 约100%。然后，比较在第一和第二序列的相应的氨基酸位置或核巧酸位置处的氨基酸残 基或核巧酸。当第一序列的位置被第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核巧酸占据 时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的百分同源性为序列所共有的相同位置的 数量的函数，其考虑了空位的数量和各空位的长度，必须引入空位的数量和各空位的长度 W达到两个序列的最佳比对的目的。
[0056] 序列的比较W及两个序列之间的百分同源性的确定可W使用数学算法来完成，例 如BLAST(Altschuletal.，J.Mol.Biol, 215(3) :403-410(1990))。此外，两个氨基酸序 列之间的百分同源性还可W使用Needleman和Wunsch算法来确定，其中所述的算法被引 入到GCG软件包的GAP程序中，其中使用了Blossum62矩阵或PAM250矩阵，W及16、14、 12、10、8、6 或 4 的空位权重和 1、2、3、4、5 或 6 的长度权重（NeedlemanandWunsch，J.Mol. Biol.，48:444-453 (1970))。此外，两个核巧酸序列之间的百分同源性还可W使用GCG软件 包中的GAP程序来确定，其中使用了NWSgap化a.CMP矩阵W及40、50、60、70或80的空位权 重和1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域的任一普通技术人员可W进行最初的同源性计算， 并相应地调整算参数。优选的参数组（和如果操作者不确定应当应用哪些参数来确定分子 是否在所要求的同源性限制内而应该使用的参数组）是具有12的空位罚分、4的空位延伸 罚分和5的移码空位罚分的Blossum62评分矩阵。序列比对的其他方法是生物【技术领域】 已知的（例如参见Rosenberg,BMCBioinformatics, 6:278(2005) ;Altschul,etal.,阳BS J. ,272 (20):5101-5109(2005))〇
[0057] 如本文所用，术语"在低严谨性、中严谨性、高严谨性或极高严谨性的条件下杂交" 描述了用于杂交和洗涂的条件。实施杂交反应的指导可W见于化rrentProtocolsin MolecularBiology,JohnWil巧&Sons，N.Y. (1989)，6.3.1-6.3.6。该参考文献中描述了 水性和非水性方法并且可W使用任一种方法。本发明所指的具体的杂交条件如下；1)低严 谨性杂交条件一在大约45C下、在6x氯化轴/巧樣酸轴（SSC)中，然后在至少5(TC下、在 0. 2XSSC、0. 1%SDS中洗涂两次（对于低严谨性条件，洗涂温度可W升至55C) ;2)中严谨 性杂交条件一在大约45C下、在6xSSC中，然后在6(TC的0. 2xSSC、0. 1%SDS中洗涂一次 或多次；3)高严谨性杂交条件一在大约45C的6xSSC中，然后在65C下、在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗涂一次或多次；W及4)极高严谨性杂交条件一在65°C的0. 5M磯酸轴、7%SDS，然 后在65C下、在0. 2xSSC、l%SDS中洗涂一次或多次。除非另外指示，极高的严谨性条件 (4)是优选的条件。
[005引"内源的"多肤是指由宿主细胞（例如亲代微生物细胞）的基因组编码的多化其 中重组细胞由所述的宿主细胞改造或衍生得到。
[0059]"外源的"多肤是指由亲代微生物细胞的基因组编码的多肤。变体（即，突变体） 多肤为外源多肤的实例。
[0060] 术语"异源的"通常是指由不同的物种衍生得到或有不同的有机体衍生得到。如 本文所用，异源的是指并非天然存在于特定的有机体中的核巧酸序列或多肤序列。异源表 达是指将蛋白质或多肤凭经验加入到通常不表达该蛋白质的细胞中。依此，异源的是指该 样的事实：被转移的蛋白质最初由与受体不同类型的细胞或不同的物种衍生得到。例如可 W通过重组方法将与植物细胞异源的多核巧酸序列引入到细菌宿主细胞中，然后该植物多 核巧酸在重组细菌宿主细胞中为异源多核巧酸。
[0061] 如本文所用，术语多肤的"片段"是指全长多肤或蛋白质的较短的部分，其大小为4 个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去1个氨基酸残基。在本发明公开的某些实施方案中， 片段是指多肤或蛋白质的结构域（例如底物结合结构域或催化结构域）的整个氨基酸序 列。
[0062] 如本文所用，术语"诱变"是指一种方法，通过该方法有机体的遗传信息W稳定的 方式被改变。编码蛋白质的核酸序列的诱变产生突变体蛋白质。此外，诱变还指非编码核 酸序列的改变，而该种改变会导致修饰的蛋白质活性。
[0063] 如本文所用，术语"基因"是指编码RNA产物或蛋白质产物的核酸序列；W及影响 RNA或蛋白质的表达的可操作地连接的核酸序列（例如此类序列包括但不限于启动子或增 强子序列）或编码会影响RNA或蛋白质的表达的序列的、可操作地连接的核酸序列（例如 此类序列包括但不限于核糖体结合位点或翻译控制序列）。
[0064] 表达控制序列是本领域已知的，并且包括例如启动子、增强子、多聚腺巧酸信号、 转录终止子、内部核糖体进入位点（IRE巧等，它们提供了多核巧酸序列在宿主细胞中的 表达。表达控制序列特异性地与转录有关的细胞蛋白质相互作用（Maniatisetal.,Sc ience, 236:1237-1245(1987))。示例性的表达控制序列例如Goeddel,GeneExpression Technology:MethodsinEnzymology,Vol. 185,AcademicPress,SanDiego,Calif. (1990) 中所述。
[0065] 在本发明公开的方法中，表达控制序列与多核巧酸序列可操作地连接。"可操作地 连接"是指多核巧酸序列和表达控制序列W该样的方式连接，使得在合适的分子（例如转录 活化蛋白质）与表达控制序列结合时，允许基因表达。根据转录和翻译的方向，可操作地连 接的启动子位于所选的多核巧酸序列的上游。可操作地连接的增强子可W位于所选的多核 巧酸的上游、内部或下游。
[0066] 如本文所用，术语"载体"是指能够运送所连接的另一种核酸（即，多核巧酸序列） 的核酸分子。一种类型的有用的载体为附加体（即，能够在染色体外复制的核酸）。有用 的载体为能够使所连接的核酸自主复制和/或表达的那些。能够使可操作地连接的基因 定向表达的载体在本发明中还称为"表达载体"。总体而言，用于重组DNA技术中的表达载 体通常为"质粒"形式，其通常是指环状双链的DNA环，该DNA环作为载体形式不能与染色 体结合。术语"质粒"和"载体"在本发明中可W交换使用，因为质粒为最常用的载体形式。 然而，还包括此类其他形式的表达载体，该些载体发挥着等价的功能并且到目前为止是本 领域已知的。在一些实施方案中，重组载体进一步包括与多核巧酸序列可操作地连接的启 动子。在一些实施方案中，启动子是发育调节的、细胞器特异性的、组织特异性的、诱导型 的、构成型的或者是细胞特异性的启动子。重组载体通常包括至少一个序列，其包括（a)与 多核巧酸序列可操作地缀合的表达控制序列；化）与多核巧酸序列可操作地缀合的选择标 记；（C)与多核巧酸序列可操作地缀合的标记序列；（d)与多核巧酸序列可操作地缀合的纯 化部分；（e)与多核巧酸序列可操作地缀合的分泌序列；W及（f)与多核巧酸序列可操作地 缀合的祀向序列。在某些实施方案中，核巧酸序列被稳定地引入到宿主细胞的基因组DNA 中，并且核巧酸序列的表达处于受调节的启动子区的控制之下。本发明所述的表达载体包 括适用于在宿主细胞中表达多核巧酸序列的形式的、本发明所述的多核巧酸序列。本领域 的技术人员应该理解的是表达载体的设计可W取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需 多肤的表达水平之类的因素。本发明所述的表达载体可W被引入到宿主细胞中，从而生产 由本发明所述的多核巧酸序列编码的多肤，包括融合多肤。
[0067] 在原核生物（例如大肠杆菌）中表达编码多肤的基因最通常的是使用包括构成型 或诱导型启动子的载体来实施，其中所述的启动子指导融合或非融合多肤的表达。融合载 体将一定数量的氨基酸加入到其中编码的多肤中，通常加入到重组多肤的氨基末端或駿基 末端。该种融合载体通常起到W下3种目的中的一种或多种；（1)增加重组多肤的表达；（2) 增加重组多肤的溶解性；W及（3)通过在亲和纯化中起到配体的作用而有助于重组多肤的 纯化。通常，在融合表达的载体中，在融合部分与重组多肤的连接处引入蛋白水解的切割位 点。该使得在纯化融合多肤后，重组多肤与融合部分分离。在某些实施方案中，本发明公开 的多核巧酸序列与由瞻菌体T5衍生的启动子可操作地连接。
[0068] 在某些实施方案中，宿主细胞为酵母细胞，表达载体为酵母表达载体。用于在 酿酒酵母仅cerevisiae)中表达的载体的实例包括pY巧Seel炬aldarietal.,EMB0 J. ,6:229-234 (1987))、pMFa(Kurjanetal.，细胞，30:933-943 (1982))、pJRY88(Schultz etal.,Gene, 54: 113-123(1987))、pYES2(InvitrogenCo;rp.,SanDiego,CA)和 picZ(InvitrogenCorp. ,SanDiego,CA)。
[0069] 在其他的实施方案中，宿主细胞为昆虫细胞，表达载体为杆状病毒表达载体。可 用于在培养的昆虫细胞（例如S巧细胞）中表达蛋白质的杆状病毒载体包括例如pAc 系列（Smithetal.，Mol.细胞Biol. ,3:2156-2165 (1983))和P化系列（Lucklowet al.，Virology, 170:31-39(1989))。
[0070] 在另一个实施方案中，本发明所述的多核巧酸序列可W使用哺乳动物表达载体在 哺乳动物细胞中表达。用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统是本领域公知的，例如 参见Sambrooketal. ,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"再片反，ColdSpring HarborLaboratory, (1989)。
[0071] 本发明所指的术语"相应的野生型宿主细胞"是指作为对照细胞的细胞。例如如果 重组宿主细胞中的多肤受到上调，则相同的多肤在对照细胞中W更低的水平存在。相反，女口 果重组宿主细胞中的多肤受到下调，则相同的多肤在对照细胞中W更高的水平存在。此外， "重组的或改造的宿主细胞"为用于生产一种或多种脂肪酸衍生物的微生物有机体，其中所 述的脂肪酸衍生物包括例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短链和长链的醇、碳氨化合物、脂肪 醇、醋（例如蜡、脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、内帰姪和丽。在一些实施方案中，重组宿主细 胞包括一种或多种多核巧酸，各种多核巧酸均编码具有脂肪酸生物合成酶活性的多肤。
[0072] 如本文所用，"醜基-CoA"是指在焼基链的撰基碳与辅酶A(CoA)的4' -磯酸泛醜 亚硫醜基部分的硫氨基之间形成醜基硫醋，其具有下式R-C(0)S-C〇A，其中R为具有至少4 个碳原子的任何焼基。
[0073] 如本文所用，"醜基-ACP"是指在焼基链的撰基碳与醜基载体蛋白质（ACP)的磯 酸泛醜琉基己胺基部分的硫氨基之间形成醜基硫醋。磯酸泛醜琉基己胺基部分在翻译后通 过全-醜基载体蛋白质合酶（ACP巧（一种磯酸泛醜琉基己胺基转移酶）的作用与ACP上的 保守丝氨酸残基连接。在一些实施方案中，醜基-ACP为完全饱和的醜基-ACP的合成中的 中间体。在其他的实施方案中，醜基-ACP为不饱和的醜基-ACP的合成中的中间体。在一 些实施方案中，碳链具有大约 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25或26个碳。该些醜基-ACP的每一种都是将它们转化为脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0074] 如本文所用，术语"脂肪酸衍生物"是指"脂肪酸"或"脂肪酸衍生物"，其可W称为 "脂肪酸或其衍生物"。术语"脂肪酸"是指具有式RC00H的駿酸。R表示脂肪族基团，优选为 焼基。R可W包括大约4至大约22各碳原子。脂肪酸可W是饱和的、单不饱和的或多不饱 和的。"脂肪酸衍生物"为部分由生产宿主有机体的脂肪酸生物合成途径形成的产物。"脂 肪酸衍生物"包括部分由醜基-ACP或醜基-ACP衍生物形成的产率。示例性的脂肪酸衍生 物包括例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短链和长链的醇、脂肪醇、碳氨化合物、醋（例如蜡、 脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、内帰姪和丽。
[00巧]本发明所指的"脂肪酸衍生物组合物"是由重组宿主细胞生产的，并且通常包括脂 肪酸衍生物的混合物。在一些情况下，所述的混合物包括多于一种类型的产物（例如脂肪 酸和脂肪醇、脂肪酸和脂肪酸醋、或者焼姪或帰姪）。在其他的情况下，脂肪酸衍生物组合物 可W包括例如具有不同链长、且饱和或支化特征的脂肪醇（或者另一种脂肪酸衍生物）的 混合物。在其他的情况下，脂肪酸衍生物组合物包括多于一种类型的产物、W及具有不同链 长且饱和或支化特征的产物的混合物。
[0076] 如本文所用，术语"脂肪酸生物合成途径"是指生产脂肪酸及其衍生物的生物合成 途径。脂肪酸生物合成途径除了包括本发明所讨论的生产具有所需特征的脂肪酸衍生物的 酶或多肤W外，还可W包括其他的具有酶活性的酶或多肤。
[0077] 如本文所用，"脂肪酵"是指具有式ROTO的酵，其特征在于撰基（C= 0)。在一些 实施方案中，脂肪酵为由脂肪醇形成的任何的酵。在某些实施方案中，R基的长度为至少5、 至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、 至少17、至少18或者至少19个碳。备选地或此外，R基的长度为20或更少、19或更少、18 或更少、17或更少、16或更少、15或更少、14或更少、13或更少、12或更少、11或更少、10或 更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少的碳。因此，R基可W具有上述任何两个端点 限定的R基。例如R基可W为6-16个碳的长度、10-14个碳的长度或者12-18个碳的长度。 在一些实施方案中，脂肪酵为C6、C7、C8、C9、CIO、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、 C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪酵。在某些实施方案中，脂肪酵为C6、C7、C8、 C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17 或C18 脂肪酵。
[0078] 如本文所用，"脂肪醇"是指具有式R0H的醇。在一些实施方案中，R基的长度为至 少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至 少16、至少17、至少18或者至少19个碳。备选地或此外，R基的长度为20或更少、19或更 少、18或更少、17或更少、16或更少、15或更少、14或更少、13或更少、12或更少、11或更少、 10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少的碳。因此，R基可W具有上述任何两个 端点限定的R基。例如R基可W为6-16个碳的长度、10-14个碳的长度或者12-18个碳的 长度。在一些实施方案中，脂肪醇为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、 C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪醇。在某些实施方案中，脂肪醇为C6、C7、 C8、C9、CIO、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17 或C18 脂肪醇。
[0079]脂肪酸衍生物（例如脂肪醇）的R基可W为直连或支链。支链可W具有多于一个 的支化点，并且可W包括环状支。在一些实施方案中，支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化 的脂肪醇为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、 C23、C24、C25或C26的支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇。在具体的实施方案 中，支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇为C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、 C15、C16、C17或C18的支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇。在某些实施方案中， 支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇的轻基在第一位置（C1)处。
[0080] 在某些实施方案中，支化的脂肪酸衍生物为异脂肪酸衍生物，例如异脂肪酵、异脂 肪醇或反异脂肪酸衍生物、反异脂肪酵或反异脂肪醇。在示例性的实施方案中，支化的脂肪 酸衍生物选自异C7:0、异C8:0、异C9:0、异C10:0、异C11:0、异C12:0、异C13:0、异C14:0、异 (：15:0、异(：16:0、异(：17:0、异(：18:0、异(：19:0、反异〔7:0、反异〔8:0、反异〔9:0、反异(：10:0、 反异C11:0、反异C12:0、反异C13:0、反异C14:0、反异C15:0、反异C16:0、反异C17:0、反异 C18:0和反异C19:0的支化的脂肪醇。
[0081] 支化的或非支化的脂肪酸衍生物的R基可W是饱和的或不饱和的。如果是不饱和 的，则R基可W具有多于一个的不饱和点。在一些实施方案中，不饱和的脂肪酸衍生物是单 不饱和的脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，不饱和的脂肪酸衍生物为C6:l、C7:l、C8:l、 C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、 C22:1、C23:1、C24:1、C25:1或C26:l的不饱和的脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，不饱 和的脂肪酸衍生物为CIO: 1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:1的不饱和脂肪酸衍生物。在其 他的实施方案中，不饱和的脂肪酸衍生物在位置处是不饱和的。在某些实施方案中， 不饱和的脂肪酸衍生物包括顺式双键。
[0082] 如本文所用，术语"克隆"通常是指起源于单一的共同祖先并与该祖先基本上是遗 传一致的细胞或一组细胞，例如由单一的细菌细胞形成的克隆细菌菌落的细菌。
[0083] 如本文所用，术语"培养物"通常是指包括活细胞的液体培养基。在一个实施方案 中，培养物包括在受控的条件下在预定的培养物培养基中再生产的细胞，例如在包括所选 的碳源和氮的液体培养基中生长的重组宿主细胞培养物。动词形式的"培养"或名词形式 的"培养"是指使重组细胞细胞群体在液体或固体培养基中在合适的条件下生长。在具体的 实施方案中，培养是指底物W发酵方式生物转化为终产物。培养用的培养基是公知的，并且 此类培养物培养基的单个成分可得自商业来源，例如Difco?和BBL?商标。在一个非限定 性的实例中，水性营养培养基为包括氮、盐和碳的复合来源的"富集培养基"，例如YP培养 基，其包括此类培养基的lOg/L蛋白腺W及lOg/L酵母提取物。根据美国专利5, 000, 000 ; 5, 028, 539 ;5, 424, 202 成 482, 846 ;5, 602, 030 ;W0 2010127318 中所述的方法，培养物的宿 主细胞可W另外改造，从而高效地同化碳并使用纤维素材料作为碳源。此外，在一些实施方 案中，宿主细胞被改造从而表达转化酶，该样藏糖可W被用作碳源。
[0084] 如本文所用，术语"在有效表达基因改造的多核巧酸序列的条件下"是指允许宿主 细胞生产所需的脂肪酸衍生物的任何条件。合适的条件包括例如发酵条件。
[0085] 如本文所用，在重组宿主细胞中，"修饰的"或"改变水平"的蛋白质（例如酶）活 性是指在相对于亲代或天然宿主细胞测定的活性中存在的一个或多个特征的差异。通常， 活性的差异是在重组宿主细胞（具有修饰的活性）与相应的野生型宿主细胞之间测定的 (例如重组宿主细胞培养物相对于相应的野生型宿主细胞的比较）。修饰的活性可W是W 下情况的结果，例如：重组宿主细胞所表达的蛋白质的量改变（例如编码蛋白质的DNA序列 的拷贝数量升高或降低、编码蛋白质的mRNA转录子的数量升高或降低、和/或由mRNA形成 蛋白质的蛋白质翻译的量升高或降低的结果）；蛋白质结构的改变（例如一级结构改变，女口 蛋白质的编码序列的改变，其导致底物特异性的改变、所见的动力学参数改变）及蛋白 质的稳定性改变（例如蛋白质降解的升高或降低）。在一些实施方案中，所述的多肤为本发 明所述的任一种多肤的突变体或变体。在某些情况下，用于本发明所述的多肤的编码序列 为为了在特定的宿主细胞中的表达而优化的密码子。例如就在大肠杆菌中的表达而言，可 W根据例如Grosjeanetal. ,Gene18:199-209 (1982)中所述优化一个或多个密码子。
[0086] 如本文所用，术语"调节序列"通常是指DNA中碱基的序列，该序列与编码蛋白质 的DNA序列可操作地连接，其中所述的碱基序列最终控制蛋白质的表达。调节序列的实例 包括但不限于RNA启动子序列、转录因子结合序列、转录终止序列、转录调控因子（例如增 强子元件）、影响RNA稳定性的核巧酸序列W及翻译调节序列（例如核糖体结合位点（例如 原核生物中的化ine-Dalgarno序列或真核生物中的Kozak序列）、起始密码子、终止密码 子）。
[0087] 术语"改变的表达水平"和"修饰的表达水平"可W交换使用，并且是指在相同的 条件下，与多核巧酸、多肤或碳氨化合物在相应的野生型细胞中的浓度相比，多核巧酸、多 肤或碳氨化合物在改造的宿主细胞中W不同的浓度存在。
[0088]如本文所用，术语"效价"是指每单位体积的宿主细胞培养物生产的脂肪酸衍 生物的量。在本发明所述的组合物和方法的任何方面中，脂肪酸衍生物W大约25mg/L、 大约 50mg/L、大约 75mg/L、大约lOOmg/L、大约 125mg/L、大约 150mg/L、大约 175mg/L、大 约 200mg/L、大约 225mg/L、大约 250mg/L、大约 275mg/L、大约 300mg/L、大约 325mg/L、大 约 350mg/L、大约 375mg/L、大约 400mg/L、大约 425mg/L、大约 450mg/L、大约 475mg/L、大 约 500mg/L、大约 525mg/L、大约 550mg/L、大约 575mg/L、大约 600mg/L、大约 625mg/L、大 约 650mg/L、大约 675mg/L、大约 700mg/L、大约 725mg/L、大约 750mg/L、大约 775mg/L、大 约 800mg/L、大约 825mg/L、大约 850mg/L、大约 875mg/L、大约 900mg/L、大约 925mg/L、大约 950mg/L、大约 975mg/L、大约lOOOmg/L、大约 1050mg/L、大约 1075mg/L、大约llOOmg/L、大 约 1125mg/L、大约 1150mg/L、大约 1175mg/L、大约 1200mg/L、大约 1225mg/L、大约 1250mg/ L、大约 1275mg/L、大约 1300mg/L、大约 1325mg/L、大约 1350mg/L、大约 1375mg/L、大约 1400mg/L、大约 1425mg/L、大约 1450mg/L、大约 1475mg/L、大约 1500mg/L、大约 1525mg/L、大 约 1550mg/L、大约 1575mg/L、大约 1600mg/L、大约 1625mg/L、大约 1650mg/L、大约 1675mg/ L、大约 1700mg/L、大约 1725mg/L、大约 1750mg/L、大约 1775mg/L、大约 1800mg/L、大约 1825mg/L、大约 1850mg/L、大约 1875mg/L、大约 1900mg/L、大约 1925mg/L、大约 1950mg/L、大 约 1975mg/L、大约 2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、lOg/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、 70径/1、8〇3/1、9〇3/1、10〇3/1或上述任意两个值所限定的范围的效价生产。在其他的实施方 案中，脂肪酸衍生物W高于lOOg/U高于200g/L、高于300g/L或更高（例如500g/L、700g/ L、lOOOg/L、1200g/L、1500g/L或2000g/L)的效价生产。根据本发明公开的方法由重组宿主 细胞生产的脂肪酸衍生物的效价为5g/L至200g/L、lOg/L至150g/L、20g/L至120g/L、W及 30g/L至lOOg/L。在一个实施方案中，根据本发明公开的方法由重组宿主细胞生产的脂肪 酸衍生物的效价为大约Ig/L至大约250g/L、并且更具体为90g/L至大约120g/L。所述的 效价可W指由给定的重组宿主细胞培养物生产的特定的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的 组合。
[0089] 如本文所用，"由宿主细胞生产的脂肪酸衍生物的产率"是指输入的碳源在宿主细 胞中被转化为产物（即，脂肪醇或脂肪酵）的效率。根据本发明公开的方法经改造从而生 产脂肪酸衍生物的宿主细胞的产率为至少3 %、至少4 %、至少5 %、至少6 %、至少7 %、至少 8%、至少9%、至少10%、至少11 %、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、 至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21 %、至少22%、至少23%、至少24%、至 少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%或者由上述任意两个值所限 定的范围。在其他的实施方案中，一种或多种脂肪酸衍生物W高于30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或更高的产率生产。备选地或此外，产率为大约30%或更低、大约27%或 更低、大约25%或更低、大约22%或更低。因此，产率可W由上述任意两个端点来限定。例 如根据本发明公开的方法由重组宿主细胞生产的一种或多种脂肪酸衍生物的产率可W为 5%至 15%、10%至 25%、10%至 22%、15%至 27%、18%至 22%、20%至 28%、或 20%至 30%。在具体的实施方案中，由重组宿主细胞生产的一种或多种脂肪酸衍生物的产率为大 约10%至大约40%。在另一个具体的实施方案中，由重组宿主细胞生产的一种或多种脂肪 酸衍生物的产率为大约25%。所述的产率可W指由给定的重组宿主细胞培养物生产的特定 的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合。
[0090] 如本文所用，术语"生产率"是指每单位时间内每单位体积的宿主细胞培养物生 产一种或多种脂肪酸衍生物的量。在本发明所述的组合物和方法的任何方面中，由重组宿 主细胞生产的一种或多种脂肪酸衍生物的生产率为至少lOOmg/L/小时、至少200mg/L/小 时、至少300mg/L/小时、至少400mg/L/小时、至少500mg/L/小时、至少600mg/L/小时、 至少700mg/L/小时、至少800mg/L/小时、至少900mg/L/小时、至少lOOOmg/L/小时、至 少llOOmg/L/小时、至少1200mg/L/小时、至少1300mg/L/小时、至少1400mg/L/小时、至 少1500mg/L/小时、至少1600mg/L/小时、至少1700mg/L/小时、至少1800mg/L/小时、至 少1900mg/L/小时、至少2000mg/L/小时、至少2100mg/L/小时、至少2200mg/L/小时、至 少2300mg/L/小时、至少2400mg/L/小时、或至少2500mg/L/小时。例如根据本发明所述 的方法由重组宿主细胞生产的一种或多种脂肪酸衍生物的生产率可W为500mg/L/小时至 2500mg/L/小时、或700mg/L/小时至2000mg/L/小时。在一个具体的实施方案中，产率为大 约0. 7mg/L/h至大约3g/L/h。所述的生产率可W指由给定的重组宿主细胞培养物生产的特 定的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合。
[0091] 如本文所用，术语"总脂肪物质"和"总脂肪酸产物"在本发明中可W交换使用， 其是指脂肪醇、脂肪酵和脂肪酸的量，其可W通过GC-FID来评价，如国际专利申请公开 W02008/119082中所述。相同的术语用于指脂肪醋分析时，可W用于指脂肪醋和游离脂肪 酸。
[0092] 如本文所用，术语"葡萄糖利用率"是指每单位时间内培养物使用的葡萄糖的量， 其报告为克/升/小时（g/L/虹）。如本文所用，术语"碳源"是指适于用作原核或简单的 真核细胞生长所需的碳源的底物或化合物。碳源可W为多种形式，包括但不限于聚合物、碳 水化合物、酸、醇、酵、丽、氨基酸、肤和气体（例如C0和C〇2)。示例性的碳源包括但不限于： 单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳 糖；多糖，例如淀粉、纤维素、胶质和木聚糖；二糖，例如藏糖、麦芽糖、纤维二糖和松二糖； 纤维素材料和变体，例如半纤维素、甲基纤维素和駿甲基纤维素轴；饱和的或不饱和的脂肪 酸、玻巧酸盐、乳酸盐和醋酸盐；醇，例如己醇、甲醇和甘油；或它们的混合物。此外，碳源还 可W为光合成产物，例如葡萄糖。在某些优选的实施方案中，碳源为生物质。在其他优选的 实施方案中，碳源为葡萄糖。在其他优选的实施方案中，碳源为藏糖。
[0093] 如本文所用，术语"生物质"是指可W衍生得到碳源的任何生物材料。在一些实施 方案中，适于生物转化的生物质被加工成碳源。在其他的实施方案中，生物质不需要进一步 加工成碳源。碳源可w转化为生物燃料。示例性的生物质来源为植物物质或蔬菜，例如谷 物、甘藏或柳枝稷。另一种示例性的生物质来源为代谢废物，例如动物物质（例如牛粪便）。 其他的示例性生物质来源包括藻类和其他海生植物。此外，生物质还包括由工业、农业、林 业和家庭得到的废物，包括但不限于发酵废物、未干的袜草、稻草、木材、污物、垃圾、纤维素 城市废物和食物剩余物。此外，术语"生物质"还指碳源，例如碳水化合物（例如单糖、二糖 或多糖）。
[0094] 如本文所用，对产物（例如脂肪酸及其衍生物）而言的术语"分离的"是指由细胞 成分、细胞培养物培养基、或者化学或合成的前体分离得到的产物。通过本发明所述的方法 生产的脂肪酸及其衍生物在发酵液及细胞质中相对而言可W是不可混合的。因此，所述的 脂肪酸及其衍生物可W在细胞内或细胞外收集于有机相中。
[0095] 如本文所用，术语动词性的"纯化"、形容词性的"纯化的"或名词性的"纯化"是指 通过例如分离或隔离将分子从其环境中移出或分离。"基本上纯化的"分子为至少大约60% 游离于（例如至少大约70%游离于、至少大约75%游离于、至少大约85%游离于、至少大约 90%游离于、至少大约95%游离于、至少大约97游离于、至少大约99%游离于）它们所关 联的其他组分。如本文所用，该些术语还指从样品中去除污染物。例如污染物的去除可W 使样品中脂肪酸衍生物的百分率增加。例如当在重组宿主细胞中产生脂肪酸衍生物时，可 W通过去除宿主细胞蛋白质来纯化脂肪酸衍生物。纯化后，样品中脂肪酸衍生物的百分率 增加。术语动词性的"纯化"、形容词性的"纯化的"或名词性的"纯化"是相对的术语，其不 需要绝对的纯度。因此，例如当在重组宿主细胞中产生脂肪酸衍生物时，纯化的脂肪酸衍生 物是基本与其他细胞成分（例如核酸、多肤、脂质、碳水化合物或其他碳氨化合物）隔离的 脂肪酸衍生物。
[009引 菌株改良
[0097] 为了形成脂肪酸衍生物的高效价、产率和/或生产率，对生产型宿主细胞进行 了多种修饰。化dR是与脂肪酸降解和脂肪酸生物合成途径的重要调节因子（化onanet al,MolMicrobiol, 29 (4) :937-943 (1998))。大肠杆菌ACS酶化曲和脂肪酸运送蛋白 质化化为脂肪酸吸收系统的成分。化化介导了脂肪酸运送至细菌细胞，而化曲介导了 醜基-CoA醋的形成。当没有其他碳源可W利用时，外源脂肪酸被细菌吸收，并转化为醜 基-CoA醋，其可W与运送因子化dR结合，并抑制fad基因的表达，其中所述的fad基因编 码负责脂肪酸运送（Fa化）、激活（Fa曲）和目-氧化的蛋白质（FadA，Fa地，Fa祀和化地）。 当有备选的碳源可W利用时，细菌合成脂肪酸作为醜基-ACP，其用于磯脂的合成，但是不是 目-氧化的底物。因此，醜基-CoA和醜基-ACP为脂肪酸的独立来源，该可W得到不同的终 产物（Cavigliaetal，JBiol.Chem.，279 (12) :1163-1169 (2004))。
[0098] 在本领域中，关于宿主细胞（例如大肠杆菌）中的脂肪酸生物合成的限定因素具 有矛盾的推断。一种建议是对用于脂肪酸生物合成的主要前体的限定，例如己醜基-CoA和 丙二醜基-CoA可W使得脂肪酸衍生物的合成减少。增加通过脂肪酸生物合成的流量的一 种方法是操纵该途径中的多种酶（参见图1和2)。实施例3描述了多个研究，该研究显示 fab操纵子的构建W及向大肠杆菌宿主细胞的染色体中的整合，其中所述的fab操纵子编 码生物合成途径中的酶，该些酶用于将丙二醜基-CoA转化为醜基-ACP。不想被理论所束 缚，该可W增加脂肪酸生物合成的流量。通过己醜基-CoA駿化酶（acc)复合物和脂肪酸生 物合成（化b)途径由己醜基-CoA供应醜基-ACP是限定脂肪酸衍生物的生产速率的另一个 步骤（参见图3)。实施例2显示出优化形式的大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌accABCD(±birA) 过表达的效果，其证明此类基因修饰可W使大肠杆菌中的己醜基-coA和丙二醜基-CoA的 生产增加。
[0099] 在另一个方法中，显示大肠杆菌宿主细胞中的r地和ilvG基因突变使得游离的脂 肪酸（FFA)的产更高，该转化为脂肪醇的生产更高，如实施例4所示。在另一个方法中，获 得转座子诱变和高通量的筛选，从而发现可W增加效价或产率的有利突变。如实施例5所 示，将转座子插入到yijP基因中可W改善脂肪醇中摇瓶和分批供料的发酵中的产率。
[0100] 由重组宿主细胞生成脂肪酸衍生物
[0101] 本发明公开提供了多肤（例如酶）的多个实例，其中所述的多肤（例如酶）具有 适用于本发明所述的脂肪酸生物合成途径的活性。此类多肤在本发明中统称为"脂肪酸生 物合成多肤"或"脂肪酸生物合成酶"。本发明提供了脂肪酸途径的多肤的非限定性实例， 其中所述的多肤适用于本发明公开的重组宿主细胞。在一些实施方案中，本发明公开包括 含有如下多核巧酸序列的重组宿主细胞，其中所述的多核巧酸序列编码脂肪酸生物合成的 多肤。所述的多核巧酸序列可W被整合到重组宿主细胞的染色体中，引入到存在于重组宿 主细胞中的一个或多个质粒表达系统中，或两者，其中所述的多核巧酸序列包括编码脂肪 酸生物合成的多肤的开放阅读框W及可操作地连接的调节序列。在一个实施方案中，脂肪 酸生物合成的多核巧酸序列编码多肤，该多肤对于被改造的重组宿主细胞的亲代宿主细胞 (即，对照细胞）而言是外源的。一些此类的外源多肤在重组宿主细胞中是过表达的。在另 一个实施方案中，脂肪酸生物合成的多核巧酸序列编码外源或异源的多肤。换言之，由多核 巧酸编码的多肤对于亲代宿主细胞而言是外源的。在另一个实施方案中，遗传修饰的宿主 细胞过表达编码如下多肤（蛋白质）的基因，其中所述的多肤（蛋白质）增加宿主细胞生 产脂肪酸生物合成酶的底物（即，脂肪醜基硫醋底物）的速率。在某些实施方案中，由所表 达的基因编码的酶与脂肪酸的生物合成直接有关。此类重组宿主细胞可W被进一步改造， 从而包括编码一种或多种脂肪酸生物合成的多肤（即，与脂肪酸生物合成有关的酶）的多 核巧酸序列。此类多肤的实例为具有硫醋酶活性的多肤或蛋白质，其中所述的重组宿主细 胞合成脂肪酸；或者具有硫醋酶活性和駿酸还原酶（CAR)活性的多肤或蛋白质，其中重组 宿主细胞合成脂肪酵和脂肪醇；或者具有硫醋酶活性、駿酸还原酶活性和醇脱氨酶活性的 多肤或蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪醇；或者具有醜基-CoA还原酶（AAR)活性的多 肤或蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪酵和脂肪醇；或者具有醜基-CoA还原酶（AAR)活 性和醇脱氨酶活性的多肤或蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪醇；或者具有形成脂肪醇 的醜基CoA还原酶（FAR)活性的多肤或蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪醇；或者具有硫 醋酶活性、駿酸还原酶活性和酵脱駿基酶活性的多肤或蛋白质，其中重组宿主细胞合成焼 姪；或者具有醜基-CoA还原酶活性和酵脱駿基酶活性的多肤和蛋白质，其中重组宿主细胞 合成焼姪；或者具有醋合酶活性的多肤和蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪醋（例如单 酶系统；参见图5);或者具有硫醋酶活性、醜基-CoA合酶活性和醋合酶活性的多肤和蛋白 质，其中重组宿主细胞合成脂肪醋（例如H酶系统；参见图5);或者具有OleA活性的多肤 和蛋白质，其中重组宿主细胞合成脂肪族丽；或者具有OleABCD活性的多肤和蛋白质，其中 重组宿主细胞合成内帰姪；或者具有硫醋酶活性和脱駿酶活性的多肤和蛋白质，其中重组 宿主细胞合成端帰姪；或者它们的组合。在一些实施方案中，由脂肪酸生物合成的多核巧酸 编码的一种多肤是外源（或异源）多肤（例如由除了亲代宿主细胞W外的有机体起源的多 肤，或者原产于亲代微生物细胞的多肤的变体），或者内源多肤（即，原产于亲代宿主细胞 的多肤），其中内源多肤在重组宿主细胞中是过表达的。
[0102] 下表1提供了示例性蛋白质的列表，其中所述的蛋白质可W在重组宿主细胞中表 达从而有利于特定脂肪酸衍生物的生产。
[0103] 表1 ;基因名称
[0104]

【权利要求】
1. 一种包括如下基因改造的多核苷酸序列的重组宿主细胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列编码一种或多种多肽，其中所述的多肽具有选自以下的活性：3_羟基癸酰 基-[acp]脱水酶（E. C. 4. 2. 1. 60)活性，0 -酮脂酰基-ACP 合酶 I (E. C. 2. 3. 1. 41)活 性，0 -酮脂酰基-ACP合酶II (E. C. 2. 3. 1. 179)活性，[acp] S-丙二酰基转移酶{丙二酰 基-CoA-ACP酰基转移酶} (E.C. 2. 3. 1.39)活性，3-氧酰基-{0-酮脂酰基}-ACP还原酶 (E. C. 1. 1. 1. 100)活性，@ -酮脂酰基-ACP 合酶 III (E. C. 2. 3. 1. 180)活性，烯酰基-ACP 还 原酶（NADH) (E. C. 1. 3. 1. 9)活性，烯酰基-ACP 还原酶（NADPH) (E. C. 1. 3. 1. 10)活性，3-羟 基-酰基-[acp]脱水酶（E. C. 4. 2. 1. 59)活性，以及反-2,顺-3-癸烯酰基-ACP异构酶 (E. C. 5. 3. 3. 14)活性；并且其中当在有效表达所述的多核苷酸的条件下在包括碳源的培 养基中培养时，所述的重组宿主细胞以比相应的野生型宿主细胞更高的效价、产率或生产 率来生产脂肪酸衍生物组合物。
2. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中当所述的多肽与具有所述的活性的至少一种 其他多肽组合表达时，所述的重组宿主细胞以更高的效价、产率或生产率生产所述的脂肪 酸衍生物。
3. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中当所述的多肽与具有所述的活性的至少5种 其他多肽组合表达时，所述的重组宿主细胞以更高的效价、产率或生产率生产所述的脂肪 酸衍生物。
4. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的反_2,顺-3-癸烯酰基-ACP异构酶活 性为fabA或fabM。
5. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的P -酮脂酰基-ACP合酶II为fabF。
6. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的丙二酰基-CoA-ACP酰基转移酶为 fabD〇
7. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的P -酮脂酰基-ACP合酶I为fabF或 fabB〇
8. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中￠-酮脂酰基-ACP还原酶为fabG。
9. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中P -酮脂酰基-ACP合酶III为fabH。
10. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中烯酰基-ACP还原酶为fabl、fabL、fabV或 fabK〇
11. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中3-羟基-酰基-[acp]脱水酶为fabA或 fabZ〇
12. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中反-2-烯酰基-ACP还原酶II为fabK。
13. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的多肽选自fabA、fabB、fabD、fabF、 fabG、fabH、fabl、fabL、fabV、fabZ、fabM 和 fabK。
14. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述的多肽选自得自鼠伤寒沙门氏杆菌 (Salmonella typhimurium)(NP_460041)的FabA;得自大肠埃希氏菌（Escherichia coli) (NP_416826)的FabB ;得自鼠伤寒沙门氏杆菌（NP_460164)的FabD ;得自鼠伤寒沙门氏 杆菌（NP_460165)的FabG ;得自鼠伤寒沙门氏杆菌（NP_460163)的FabH ;得自鼠伤寒沙 门氏杆菌（NP_459232)的 FabZ;得自变性链球菌（Streptococcus mutans)(AAN59379) 的 FabM ;得自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae) (AAF98273)的 FabK ;得自霍 乱弧菌（Vibrio cholera) (YP_001217283)的 FabV;得自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum) (NP_350156)的FabF ;得自枯草芽抱杆菌亚种枯草菌株168 (Bacillus subtillis subsp. subtilis str. 168) (NP_389054)的 FabI ;得自枯草芽抱杆菌亚种枯草 菌株 168(NP_388745)的 FabI;得自不动杆菌菌种（Acinetobacter sp.)ADPl(YP_047630) 的 FabL ;得自 Marinobacter aquaeoli VT8(YP_958813)的 FabI ;得自不透明红球菌 (Rhodococcus opacus)B4(YP_0〇2784194)的 FabI ;得自不动杆菌菌种 ADP1(YP_046731) 的 FabH ;得自 Marinobacter aquaeoli VT8 (YP_958649)的 FabH ;得自不透明红球菌 B4 (YP_00278448)的FabH或它们的组合。
15. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其中由所述的基因改造的多核苷酸序列编码的 所述的多肽是外源的。
16. 权利要求1所述的重组宿主细胞，其进一步包括编码酰基载体蛋白质（ACP)的基因 改造的多核苷酸序列。
17. 权利要求16所述的重组宿主细胞，其中所述的ACP进一步增加了所述的效价、产率 或生产率。
18. -种包括如下基因改造的多核苷酸序列的重组宿主细胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列编码ACP多肽，其中当在有效表达所述的ACP多肽的条件下在包括碳源的培 养基中培养时，所述的重组宿主细胞以比相应的野生型宿主细胞更高的效价、产率或生产 率来生产脂肪酸衍生物组合物。
19. 权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述的重组宿主细胞进一步包括编码如下 多肽的重组多核苷酸，其中所述的多肽具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（E. C. 2. 7. 8. 7)活 性。
20. 权利要求19所述的重组宿主细胞，其中所述的多核苷酸编码sfp基因。
21. 权利要求1或18所述的重组宿主细胞，其中所述的重组宿主细胞进一步包括编码 多肽的重组多核苷酸，其中所述的多肽具有accAB⑶活性（E. C. 6. 4. 1. 2)。
22. 权利要求1或18所述的重组宿主细胞，其中所述的ACP衍生自在所述的重组宿主 细胞中表达作为终末途径酶的相同的有机体。
23. 权利要求18所述的重组宿主细胞，其中所述的ACP是外源的。
24. -种包括如下基因改造的多核苷酸序列的重组宿主细胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列包括转座子，其中所述的转座子插入到yijP基因中影响位于位于所述yijP 基因的侧翼的第二基因，其中所述的第二基因编码受到上调或下调的多核苷酸，并且其中 所述的上调或下调的多核苷酸编码如下多肽，当所述的宿主细胞在有效表达所述的多肽的 条件下在包括碳源的培养基中培养时，所述的上调或下调的多核苷酸编码的多肽影响脂肪 酸衍生物组合物的生产。
25. 权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述的转座子插入到所述的yijP基因中使 得所述的yijP基因或其多核苷酸失活，而影响位于所述yijP基因的侧翼的第二基因，其中 所述的第二基因编码如下多肽，当所述的宿主细胞在有效表达所述的多肽的条件下在包括 碳源的培养基中培养时，所述的第二基因编码的多肽影响脂肪酸衍生物组合物的生产。
26. 权利要求24所述的重组宿主细胞，其中所述的第二基因或其多核苷酸选自ppc、 yi jO、frwD、pflC、pflD 或 argE〇
27. -种包括如下基因改造的多核苷酸序列的重组宿主细胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)多肽，其中在有效表达所述的ppc多肽 的条件下在包括碳源的培养基中培养时，所述的重组宿主细胞以比相应的野生型宿主细胞 更高的效价、产率或生产率来生产脂肪酸衍生物组合物。
28. -种包括根据权利要求1至27的任意一项所述的重组宿主细胞的细胞培养物。
29. 权利要求28所述的细胞培养物，其中所述的培养基包括脂肪酸衍生物组合物。
30. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括选自脂肪 酸、脂肪酯、脂肪醇、脂肪醛、烷烃、端烯烃、内烯烃、酮中的至少一种的脂肪酸衍生物。
31. 权利要求28所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物为C6、C8、C10、C12、C13、 C14、C15、C16、C17或C18脂肪酸衍生物。
32. 权利要求28所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物为CIO: 1、C12:1、C14:1、 C16:l或C18:l不饱和脂肪酸衍生物。
33. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括C8、C10、 C12、C14、C16和C18脂肪酸衍生物中的一种或多种。
34. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪酸。
35. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪醛。
36. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪醇。
37. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪酯。
38. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括烷烃。
39. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括端烯烃。
40. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括内烯烃。
41. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括酮。
42. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括脂肪酸衍生 物，该脂肪酸衍生物在由所述的脂肪醇的还原末端开始的C7和C8之间，在所述的碳链的位 置7处具有双键。
43. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括不饱和的脂 肪酸衍生物。
44. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括饱和的脂肪 酸衍生物。
45. 权利要求29所述的细胞培养物，其中所述的脂肪酸衍生物组合物包括支链的脂肪 酸衍生物。
46. 权利要求28所述的细胞培养物，其中当在与重组宿主细胞相同的条件下培养时， 所述的重组宿主细胞具有比所述的相应的野生型宿主细胞的效价高至少大约5%的效价。
47. 权利要求46所述的细胞培养物，其中所述的重组宿主细胞具有大约lg/L至大约 250g/L的效价。
48. 权利要求47所述的细胞培养物，其中所述的重组宿主细胞具有大约90g/L至大约 120g/L的效价。
49. 权利要求28所述的细胞培养物，其中所述的重组宿主细胞具有大约10 %至大约 40%的产率。
50. 权利要求49所述的重组宿主细胞，其中所述的重组宿主细胞具有大约25%的产 率。
51. 权利要求28所述的细胞培养物，其中所述的生产率为大约0. Yrng/L/hr至大约3g/ L/hr〇
【文档编号】C12N9/90GK104395464SQ201380026304
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年4月2日 优先权日:2012年4月2日
【发明者】德里克·L·格林菲尔德, 安德烈亚斯·W·席尔默, 伊利莎白·J·克拉克, 伊莱·S·格罗班, 伯纳多·M·达科斯塔, Z·胡, 凯文·霍尔登, 诺厄·赫尔曼 申请人:Reg生命科学有限责任公司, 德里克·L·格林菲尔德, 安德烈亚斯·W·席尔默, 伊利莎白·J·克拉克, 伊莱·S·格罗班, 伯纳多·M·达科斯塔, Z·胡, 凯文·霍尔登, 诺厄·赫尔曼