脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法及用其生产反式4-羟基-l-脯氨酸的高效转化方法
【专利摘要】本发明公开了生物转化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，具体包括重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法和将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化体系中助剂的种类、浓度及转化条件，为建立生物转化法工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸工艺提供了重要科学依据。
【专利说明】脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法及用其生产反式4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于属于酶工程和生物催化领域，具体涉及一种重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法和利用脯氨酸羟化酶将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法。
【背景技术】
[0002]轻脯氨酸(Hydroxy pro line, Hyp)不属于常见20种氨基酸,是脯氨酸羟基化修饰的结果，羟基通常加在第4或是第3位碳上。由于有两个不对称的碳原子，所以羟脯氨酸有4种立体异构体。分别为反式-4-羟基-L-脯氨酸，顺式-4-羟基-L-脯氨酸，反式-3-羟基-L-脯氨酸和顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
[0003]反式-4-羟基-L-脯氨酸在哺乳动物细胞中主要存在于胶原蛋白中，对形成稳定的三股螺旋胶原蛋白具十分重要的作用，可使结缔组织的弹性和韧性得到加强(Shibasaki, T.Mori, H.0zaki, A.2000)。体液羟脯氨酸平衡失调会造成许多疾病，例如营养不良，老年痴呆症，牙齿、骨骼中的软骨和韧带组织的韧性减弱以及组织纤维化疾病等(Rajesh N.Kalaria, Andrea B.Pax.1995)。
[0004]近年来，羟脯氨酸的研究和开发已引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。在医药方面，由于其具有多种生理功能与独特的生物活性，可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，治疗各种皮肤疾病。反式-4-羟基-L-脯氨酸易于衍生化，药理活性多样，近年来逐渐被应用到原料药手性中间体领域，用于合成新一代培南类抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等多种新创制药物的合成。由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，在美容业方面，可以作为化妆品添加剂。目前，世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。
[0005]目前，我国反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程制备，“三废”排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本高。因此，利用节能、污染少的生物催化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸势在必行。
[0006]生物转化法是指利用细菌或真菌细胞中的酶将底物分子转化为功能产物的过程。反式-4-羟基-L-脯氨酸生物转化法是指利用L-脯氨酸为底物，在Fe2+、α -酮戊二酸和L-抗坏血酸存在的条件下，利用L-脯氨酸羟化酶将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸。反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因(GenBank ID:D78338.1)长816核苷酸，编码272个氨基酸残基，GC含量为66.67%，研究发现，该酶蛋白主要以包涵体形式出现(ChristianKleina, Wolfgang Huttela.2011)。
[0007] 2011年，德国科学家Christian Klein对含有伴因子的大肠杆菌工程菌转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化条件进行了优化，在37°C下，140 rpm培养重组工程菌为0D600=1.1 - 1.4时，加入0.2禮IPTG诱导表达，随后，再加入6.25mM L-脯氨酸，0.5 mM硫酸亚铁，8 mM α-酮戊二酸，28°C条件下，140rpm培养72h后，测得的将脯氨酸转化为反式-4-L-脯氨酸的转化率仅为61%，底物投入量和转化效率都比较低，不适合工业化生产反式-4-L-脯氨酸。
[0008]另外，对于工程菌株的酶表达，多采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)做诱导剂，其诱导效果虽好，但价格昂贵，不适合工业化生产。
[0009]在前期研究中，我们发现一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，可用于高效转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。较全长酶，该基因片段编码酶活性高，转化效率高，转化反应时间短，具有较好的工业应用前景(已公布专利号为:CN 103146720A 和 CN 103275998 A)。
[0010]在前期研究中，采用的转化体系为:200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM pH 6.5 MES缓冲液及1% Nonidet P-40。其中NonidetP-40助剂也存在价格昂贵，不适合工业化生产的缺点。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于解决现有技术存在的问题提供一种脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，同时提供用其生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，使该方法具备成本低、转化效率高，转化反应时间短，工业应用前景好的优点。
[0012]为实现上述目的，本发明一方面提供了一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，具体采用下述技术方案为:
一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其为将含重组质粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的单克隆接种至下述发酵培养基直接自诱导培养，所述培养基为:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾I g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L,七水硫酸亚铁0.1 g/L,乳糖6-10 g/L。
[0013]进一步的，所述重组质粒的工程菌株采用如下方法构建:将反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因的截短片段构建到表达载体PET-M-3C中，获得重组质粒PET-M-SC-Pfflyd1^257,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21_CodonPlus (DE3)中，获得了重组大肠杆菌工程菌。
[0014]进一步的，所述自诱导培养条件如下:温度24-37°C，转速为140-220 rpm，培养时间为 20-24h。
[0015]进一步的，还包括离心收集菌体的步骤。
[0016]本发明的另一方面提供了一种利用上述脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其采用如下技术方案:
一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，将菌体悬浮于转化反应液中对L-脯氨酸进行转化,所述菌体与转化液的比例为lg: 8-18mL,转化液包括MES 缓冲液 80-240m M，L-脯氨酸 180_250mM、α -酮戊二酸 180_250mM，FeSO4 6_9mM，L-抗坏血酸l_5mM和助剂，所述助剂选自20-80mg/L的头孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS、
0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或 0.1-1.5mg/mL 溶菌酶中的一种。
[0017]进一步的，所述转化液ρΗ6.3-6.8，反应温度为24-28°C，转速为140-220 rpm，时间为 60-72h。[0018]进一步的，还包括离心去除菌体的步骤。
[0019]与现有技术相比，本发明取得的有益效果为:
本发明通过对重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达条件和将L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化体系中助剂的种类、浓度及转化条件进行了优化，本发明提供的方法不仅成本低、转化效率高，而且转化反应时间短，具有较好的工业应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1自诱导培养基乳糖浓度的优化；
图2转化反应体系中头孢替胺(TTCT)抗生素浓度的优化；
图3转化反应体系中SDS浓度的优化；
图4转化反应体系中TritonX-100浓度的优化；
图5转化反应体系中溶菌酶浓度的优化；
图6转化反应条件优化的响应面实验结果。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合附图1-6和具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。
[0022]实施例1a重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾I g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于28°C、140rpm摇床自诱导培养24小时后，当菌液浓度为OD6c?达到2-2.5时，离心收集菌体。
[0023] 实施例1b重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾I g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于24°C、220rpm摇床自诱导培养20小时后，当菌液浓度为OD6c?达到2-2.5时，离心收集菌体。
[0024]实施例1c重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法
将含重组质粒的工程菌株的单克隆接种至发酵培养基:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾I g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L和乳糖8 g/L，直接于37°C、180rpm摇床自诱导培养22小时后，当菌液浓度为OD6c?达到2-2.5时，离心收集菌体。
[0025]试验例I重组大肠杆菌工程菌中脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达条件的考察
与实施例1不同之处在于培养基中乳糖的浓度不同，分别设计乳糖浓度为4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L(编号为试验例la、试验例lb、实施例la、试验例lc、试验例Id)的五组试验来测量不同自诱导培养基获得菌体L-脯氨酸羟化酶活性。具体测量方法如下:各组分别称取Ig菌体悬浮于IOmL转化反应液中[200mM L-脯氨酸、200mM α -酮戊二酸、6mM 硫酸亚铁、6mM L-抗坏血酸、80mM MES 缓冲液(pH 6.5)、1% Nonidet Ρ-40]，于 28°C、140rpm振荡反应72h，离心去除菌体，通过HPLC检测上清中反式_4_羟基-L-脯氨酸的生成情况来反映不同自诱导培养基获得菌体L-脯氨酸羟化酶活性，具体见表1:
表1不同自诱导培养基获得菌体的L-羟脯氨酸的转化率
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于:其为将含重组质粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株的单克隆接种至下述发酵培养基直接自诱导培养，所述培养基为:葡萄糖20g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾I g/L，氯化钠2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，七水硫酸亚铁0.1 g/L，乳糖6-10 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于:所述重组质粒PET-M-SC-Pfflyc^257的工程菌株采用如下方法构建:将反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因的截短片段(/7也构建到表达载体pET-M-3C中，获得重组质粒PET-M-SC-Pfflyc^257，并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)中，获得了重组大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于:所述自诱导培养条件如下:温度24-37°C，转速为140-220 rpm，培养时间为20-24h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法，其特征在于:还包括离心收集菌体的步骤。
5.一种利用权利要求1-3任一项所述重组大肠杆菌工程菌中L-脯氨酸羟化酶高活性自诱导表达方法得到的脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于:将菌体悬浮于转化反应液中对L-脯氨酸进行转化，所述菌体与转化液的比例为lg: 8-18mL,转化液包括MES缓冲液80_240mM，L-脯氨酸180_250mM、α -酮戊二酸.180-250mM, FeSO4 6_9mM，L-抗坏血酸l_5mM和助剂，所述助剂选自20_80mg/L的头孢替安抗生素、0.1-1.0mg/mL SDS,0.5%_4%(v/v)TritonX-100、或0.1-1.5mg/mL溶菌酶中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于:所述转化液PH6.3-6.8，反应温度为24-28°C，转速为140-220 rpm,时间为60-72h。
7.根据权利要求6所述的一种利用脯氨酸羟化酶生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的高效转化方法，其特征在于:还包括离心去除菌体的步骤。
【文档编号】C12P13/24GK103911355SQ201410029052
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】李玮, 张金秀, 薛张伟, 王立安, 李存会, 鞠建松, 李天云, 张琳琳, 陈娇娇, 张庆 申请人:河北博伦特药业有限公司, 石家庄万尚医药科技有限公司, 河北师范大学