一种提高木糖醇发酵产量的方法
【专利摘要】本发明提供了一种提高木糖醇发酵产量的方法，以热带假丝酵母为发酵菌株，通过添加葡萄糖酸钠，来提高木糖醇发酵产量。本发明方法中，在初始培养基中添加5-10g/L的葡萄糖酸钠，可提高发酵过程中磷酸戊糖途径的通量，增加还原型辅酶II(NADP)的供应量，使以木糖为底物发酵生产木糖醇的转化率达到96.5%，木糖醇产量达到96.5g/L。本发明方法简单易行，成本低、能耗少，可用于工业化大规模生产木糖醇。
【专利说明】一种提高木糖醇发酵产量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种提高木糖醇发酵产量的方法。
【背景技术】
[0002]木糖醇是一种重要的五碳糖醇，是从玉米芯等其他纯天然植物中提取并经过化学加工的甜味剂。据业内人士估算，目前全球木糖醇生产量已达到5 — 6万吨，其中中国占了60%以上，约3 —4万吨。而未来三年内全球木糖醇市场需求量将可能达到10万吨以上，市场潜在需求将高达40%。但是木糖醇产业的竞争也越来越激烈，控制成本和保证质量是获得竞争优势的根本保证。
[0003]木糖母液是木糖结晶后留下的颜色深的粘稠液体，里面含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等杂糖，其中木糖、阿拉伯糖、葡萄糖的比例一般为2:1:1，其它的杂糖(半乳糖甘露糖)含量在8%以下。木糖母液不同生产厂家以及不同批号的含总糖量不同，一般总糖在60-75%之间。木糖占总糖的50-70%之间。木糖母液由于里面的杂糖含量高，导致其中的木糖的溶解度大而无法采用传统的方法结晶出来。如果采用色谱分离的方法则可以将里面不同的糖分离出来。采用色谱分离技术分离各种单糖，包括木糖醇，此工艺生产成本高。
[0004]目前生产木糖醇有化学加氢法和生物发酵法两种。由于木糖母液含多种杂糖，无法利用化学加氢法生产木糖醇。微生物发酵法生产木糖醇可避免剧烈化学反应，发酵条件温和，不需要特殊的耐腐蚀抗高压设备；细胞的抗逆能力可以适应较粗放的原料；生物催化剂的底物专一性保证产物中只有木糖醇，分离纯化步骤简单，可显著降低生产成本，被认为是最有发展潜力的木糖醇生产方法。自然界中能利用木糖产生木糖醇的微生物很多，从转化能力来说，酵母生产木糖醇的能力最为优越，尤其是其中的热带假丝酵母(C.tropicalis)。`
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种在发酵培养基中添加葡萄糖酸钠来提高木糖醇产量的方法。本发明以木糖为发酵底物，使用热带假丝酵母株，在发酵培养液中添加葡萄糖酸钠，通过批式发酵进行木糖醇的生产。
[0006]该方法的原理为葡萄糖酸能够诱导葡萄糖酸激酶的合成，使得葡萄糖酸在葡萄糖酸激酶的作用下合成6-p-葡萄糖酸，6-p-葡萄糖酸又在6-p-葡萄糖酸脱氢酶的作用下生成5-磷酸核糖，增大了磷酸戊糖途径(HMP途径)的通量。而木糖醇发酵中的关键酶木糖还原酶是还原型辅酶II (NADPH)专一依赖型，且NADPH主要是由HMP途径大量生成。HMP途径的增强大大增加了 NADPH的供应量，从而促进了木糖醇的发酵。
[0007]本发明中，发酵培养液的配方为:玉米浆3_6g/L、酵母粉3_6g/L、磷酸二氢钾6-9g/L、MgS047H200.1-0.4g/L、尿素 3_6g/L、木糖 90_120g/L，葡萄糖酸钠 5-lOg/L，以水配制。[0008]进一步地，发酵培养液的配方为:玉米浆3_6g/L、酵母粉3_6g/L、磷酸二氢钾
6-9g/L、MgS047H200.1-0.4g/L、尿素 3_6g/L、木糖 90_120g/L，葡萄糖酸钠 5_8g/L，以水配制。
[0009]优选地，发酵培养液的配方为:玉米浆3.5g/L、酵母粉3.5g/L、磷酸二氢钾6g/L、MgS047H200.2g/L、尿素3g/L、木糖110g/L,葡萄糖酸钠6g/L,以水配制。
[0010]本发明方法中所述的酵母为假丝酵母属中的酵母。
[0011]优选地，所述酵母为热带假丝酵母(C.tropicalis)。
[0012]本发明方法中，发酵温度为30-35°C，初始pH4-5，OD600nm值达到20之前控制溶氧为20%-30%，OD600nm值达到20后降低溶氧至0%-5%，发酵周期为60-70小时。
[0013]优选地，发酵温度为33°C，初始PMUD6tltol值达到20之前控制溶氧为20%_30%，OD600nm值达到20后降低溶氧至0%-5%，发酵周期为60-65小时。
[0014]本发明提供了葡萄糖酸钠在提高木糖醇发酵产量中的应用。
[0015]上述应用是指发酵培养液中葡萄糖酸钠浓度为5-10g/L。
[0016]具体地，可以采用以下方法验证实际发酵中葡萄糖酸钠对木糖醇产量的影响:
[0017]利用50L发酵罐，以热带假丝酵母作为发酵菌株进行发酵实验，在初始培养基中添加葡萄糖酸钠，使其终浓度 分别达到0、3、6、9g/L，其他营养成分相同，在发酵初期用NaOH调pH值为4-5，温度控制为30-35 °C，OD600nm达到20之前通过调整搅拌速度和通气量控制溶氧为20-30%，当OD6tltlnm达到20之后，通过降低搅拌速度和通气量控制溶氧降低至0-5%的低氧状态，并一直维持到发酵结束，发酵周期为60-70小时。
[0018]实验结果表明，不添加葡萄糖酸钠，且在初始木糖含量为100g/L时，最后64h木糖醇含量仅为82.lg/L，糖醇转化率为82.1%。初始培养液中6g/L的葡萄糖酸钠对木糖醇发酵具有最佳效果，使发酵周期缩短至61小时，最后在初始木糖含量为100g/L时，木糖醇产量达到96.5g/L,糖醇转化率达到了 96.5%。此外,如图1所示，进一步增加葡萄糖酸钠的添加量(9g/L)并未对木糖醇产量和转化率有明显提高，却额外增加了生产成本。综上所述，添加6g/L葡萄糖酸钠对木糖醇的发酵具有最佳的效果。
[0019]本发明提供的通过在发酵培养基中添加葡萄糖酸钠来提高木糖醇产量的方法，该方法简单有效，由于工业级葡萄糖酸钠用量较少，对大规模生产成本无明显增加，因此适用于木糖醇的大规模工业化发酵生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为添加不同浓度葡萄糖酸钠对木糖醇发酵产量的影响图。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0022]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例1-4中，加入各原料除特别说明外，均为市售。本发明中使用的热带假丝酵母菌(C.tropicalis)保藏编号为CICC1316，购自中国工业微生物菌种保藏中心。[0023]实施例1葡萄糖酸钠添加量为Og/L
[0024]在50L发酵罐中，初始发酵培养液定容至27L，培养液中不添加葡萄糖酸钠。培养液配方为:玉米浆5g/L、酵母粉4g/L、磷酸二氢钾8g/L、MgS047H200.2g/L、尿素5g/L、木糖100g/L，以水配制。
[0025]将热带假丝酵母种液按照10%的接种量(约3L)，接入灭过菌的初始培养液中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在34°C，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.6，初始搅拌转速为400rpm，初始罐压为0.04Mpa，初始溶氧设置为100%，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD ^OOnm)达到20之前，控制溶氧在27%左右，当菌浓OD (600nm)达到20时，降低搅拌至150rpm,使得溶氧降低至3%左右。经过64小时发酵,木糖醇含量达到82.lg/L，木糖到木糖醇的质量转化率达到82.1%。
[0026]实施例2葡萄糖酸钠添加量为6g/L
[0027]在50L发酵罐中，初始发酵培养基定容至27L，其中添加葡萄糖酸钠使浓度达到6g/L。培养液配方为:玉米衆5g/L、酵母粉4g/L、磷酸二氢钾8g/L、MgS047H200.3g/L、尿素3-6g/L、木糖100g/L,葡萄糖酸钠6g/L,以水配制。
[0028]将热带假丝酵母种液按照10%的接种量(约3L)，接入灭过菌的初始培养基中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在32°C，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.6，初始搅拌转速为400rpm，初始罐压为0.04Mpa，初始溶氧设置为100%，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD ^OOnm)达到20之前，控制溶氧在26%左右，当菌浓OD (600nm)达到20时 ，降低搅拌至150rpm,使得溶氧降低至2%。经过60小时发酵,木糖醇含量达到95.lg/L,由木糖到木糖醇的质量转化率达到95.1%。
[0029]实施例3葡萄糖酸钠添加量为5g/L
[0030]在500L发酵罐中，初始发酵培养基定容至270L，其中添加葡萄糖酸钠使浓度达到5g/L。发酵培养液的配方为:玉米浆3g/L、酵母粉3g/L、磷酸二氢钾6g/L、MgS047H200.lg/L、尿素3g/L、木糖100g/L,葡萄糖酸钠5g/L,以水配制。
[0031]将热带假丝酵母种液按照10%的接种量(约30L)，接入灭过菌的初始培养基中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在35°C，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.4，初始搅拌转速为300rpm，初始罐压为0.04Mpa，初始溶氧设置为100%，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD ^OOnm)达到20之前，控制溶氧在22%左右，当菌浓OD (600nm)达到20后，降低搅拌至IOOrpm,使得溶氧降低至5%。经过62小时发酵,木糖醇含量达到94.5g/L，木糖到木糖醇的质量转化率达到94.5%。
[0032]实施例4葡萄糖酸钠添加量为9g/L
[0033]在60m3发酵罐中，初始发酵培养基定容至27m3，其中添加葡萄糖酸钠使浓度达到9g/L。发酵培养液的配方为:玉米浆6g/L、酵母粉6g/L、磷酸二氢钾9g/L、MgS047H200.4g/L、尿素6g/L、木糖lOOg/L,葡萄糖酸钠9g/L,以水配制。
[0034]将热带假丝酵母种液按照10%的接种量(约30L)，接入灭过菌的初始培养基中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在33°C，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.2，初始搅拌转速为250rpm，初始罐压为0.02Mpa，初始溶氧设置为100%，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD ^OOnm)达到20之前，控制溶氧在20%左右，当菌浓OD (600nm)达到20时，降低搅拌至lOOrpm，使得溶氧降低至3%左右。经过61.5小时发酵，木糖醇含量达到95.5g/L，木糖到木糖醇的质量转化率达到95.5%。
[0035]实施例5葡萄糖酸钠添加量为3g/L
[0036]在500L发酵罐中，初始发酵培养基定容至270L，其中添加葡萄糖酸钠使浓度达到3g/L。发酵培养液的配方为:玉米浆5g/L、酵母粉4g/L、磷酸二氢钾5g/L、MgS047H200.2g/L、尿素4g/L、木糖lOOg/L,葡萄糖酸钠3g/L,以水配制。
[0037]将热带假丝酵母种液按照10%的接种量(约30L)，接入灭过菌的初始培养基中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在30°C，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.4，初始搅拌转速为300rpm，初始罐压为0.04Mpa，初始溶氧设置为100%，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD ^OOnm)达到20之前，控制溶氧在29%左右，当菌浓OD (600nm)达到20时，降低搅拌至IOOrpm,使得溶氧降低至O。经过66小时发酵,木糖醇含量达到86.5g/L，木糖到木糖醇的质量转化率达到86.5%。
[0038]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的`这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种提高木糖醇发酵产量的方法，其特征在于，以木糖为发酵底物，在发酵培养液中添加葡萄糖酸钠，通过酵母发酵生产木糖醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养液的配方为:玉米浆3-6g/L、酵母粉 3-6g/L、磷酸二氢钾 6-9g/L、MgS047H200.1-0.4g/L、尿素 3_6g/L、木糖 90_120g/L，葡萄糖酸钠5-10g/L，以水配制。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养液的配方为:玉米浆3-6g/L、酵母粉 3-6g/L、磷酸二氢钾 6-9g/L、MgS047H200.1-0.4g/L、尿素 3_6g/L、木糖 90_120g/L，葡萄糖酸钠5-8g/L，以水配制。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养液的配方为:玉米浆3.5g/L、酵母粉 3.5g/L、磷酸二氢钾 6g/L、MgS047H200.2g/L、尿素 3g/L、木糖 110g/L,葡萄糖酸钠 6g/L,以水配制。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的酵母为假丝酵母属中的酵母。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母为热带假丝酵母(C.tropicalis)。
7.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，发酵温度为30-35°C，初始pH4-5，OD600nm达到20之前控制溶氧为20%-30%，OD600nm值达到20后降低溶氧至0%_5%，发酵周期为60-70小时。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵温度为33°C，初始pH4-5，OD6tltlnm达到20之前控制溶氧为20%-30%，OD6tltol值达到20后降低溶氧至0%-5%，发酵周期为60-65小时。
9.葡萄糖酸钠在提高木糖醇发酵产量中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵培养液中葡萄糖酸钠浓度为5-10g/L。
【文档编号】C12P19/02GK103820511SQ201410060877
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】李荣杰, 尚海涛, 杨为华, 邓远德, 徐斌, 唐浩, 张雪锋 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司