促进肺癌细胞凋亡的组合药物、药物制剂以及检测方法

促进肺癌细胞凋亡的组合药物、药物制剂以及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物、药物制剂以及检测方法，所述方法包括：采用促进肺癌细胞凋亡的组合药物对所述肺癌细胞进行处理，同时采用所述组合药物中的两种组分分别对所述肺癌细胞进行处理，与未处理的肺癌细胞组成四组对比样品，所述组合药物由3-[2,4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5,6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖两种组分组成；针对所述四组对比样品，进行预处理；对进行预处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测，并比对流式细胞仪的检测结果；对进行预处理后的四组样品分别进行凋亡蛋白表达的检测，并比凋亡蛋白表达的检测结果。
【专利说明】促进肺癌细胞凋亡的组合药物、药物制剂以及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗和医药领域，特别是涉及一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物，一种促进肺癌细胞凋亡的药物制剂以及一种肺癌细胞凋亡的检测方法。
【背景技术】
[0002]肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，恶性肿瘤是危害人类生命健康的细胞性疾病，肿瘤细胞从生物体内正常细胞转化为恶性细胞，其形态、功能、代谢和增殖等都会发生深刻变化，可以看作是细胞的异常分化导致的其具有永生性。
[0003]绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，近年来，随着吸烟和各种环境因素的影响，肺癌的发病率和死亡率逐年增长其死亡率已占癌症死亡率之首，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。在治疗肺癌的方向上，如何促进肺癌细胞的凋亡，就成为肿瘤治疗中一个关键问题。

【发明内容】

[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的促进肺癌细胞凋亡的机制。
[0005]为了解决上述问题，本发明公开了一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549，所述组合药物由3-[2，4_双((3S)_3_甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
[0006]优选地，所述组合药物中所述3_[2，4-双((3S)-3_甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-`甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
[0007]本发明还公开了一种促进肺癌细胞凋亡的药物制剂，以促进肺癌细胞凋亡的组合药物作为活性成分，并辅以可接受的要用载体；
[0008]所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549 ；
[0009]所述组合药物由3- [2，4-双((3S) _3_甲基吗啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
[0010]优选地，所述组合药物中所述3-[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
[0011]优选地，所述制剂为口服液、胶丸、口服混悬液、固体分散体、胶囊、缓释剂、颗粒剂、片剂、注射剂、软膏、贴剂或植入剂。
[0012]本发明还公开了一种肺癌细胞凋亡的检测方法，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549,所述方法包括:
[0013]采用促进肺癌细胞凋亡的组合药物对所述肺癌细胞进行处理，同时采用所述组合药物中的两种组分分别对所述肺癌细胞进行处理，与未处理的肺癌细胞组成四组对比样品，所述组合药物由3-[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖两种组分组成；[0014]针对所述四组对比样品，进行预处理，所述预处理包括:采用胰酶消化所述肺癌细胞，并采用含有胎牛血清的培养基终止对肺癌细胞的消化，将终止消化后的肺癌细胞进行离心，弃除上清液；
[0015]对进行预处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测，并比对流式细胞仪的检测结果;
[0016]对进行预处理后的四组样品分别进行凋亡蛋白表达的检测，并比凋亡蛋白表达的检测结果。
[0017]优选地，所述组合药物中所述3_[2，4-双((3S)-3_甲基吗啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
[0018]优选地，对进行一次处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测的步骤包括:
[0019]采用预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞并转入无菌的离心管中；
[0020]进行细胞计数，提取预设个数的肺癌细胞细胞，离心并弃除上清液；
[0021]采用磷脂结合蛋白与异硫氰酸荧光素的结合液重悬细胞，再加入所述结合液混匀，在室温下避光孵育后离心并弃除上清液；
[0022]再次加入所述结合液重悬细胞，加入碘化丙啶染色液混匀，冰浴避光放置后，进行流式细胞仪检测；
[0023]对进行一次处理后的 四组样品分别进行凋亡相关蛋白的表达的步骤包括:
[0024]收集细胞沉淀，并提取蛋白；
[0025]采用蛋白质印迹法检测所述四组样品凋亡相关蛋白的表达。
[0026]与现有技术相比，本发明包括以下优点:
[0027]依据本发明实施例，采用3-[2，4_双((3S)-3-甲基吗啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成的组合药物作用于选自非小细胞肺癌细胞株A549的肺癌细胞，通过实验验证，本发明创新提出的组合药物可以明显促进肺癌细胞的凋亡。
【专利附图】

【附图说明】
[0028]图1是本发明的一种肺癌细胞凋亡的检测实施例的流程图；
[0029]图2是本发明的一个示例中四组样品的流式细胞仪检测结果的对比图；
[0030]图3是本发明的一个示例中四组样品的凋亡蛋白表达的检测结果的对比图。
【具体实施方式】
[0031]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0032]细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。在治疗肺癌的方向上，如何促进肺癌细胞的凋亡，就成为肿瘤治疗中一个关键问题。
[0033]本发明提供了一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549，所述组合药物由3-[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
[0034]A549细胞系是由D.J.Griad通过肺癌组织移植培养建系，患者为58岁白人男性。A549能通过胞苷二磷酸胆碱途径合成含有高含量不饱和脂肪酸的卵磷脂。24%的细胞是亚三倍体细胞，含有66条染色体，并且，产生64、65、67条染色体细胞的频率也很高，大部分细胞都具有2条X和2条Y染色体。
[0035]其中，3-[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5, 6-e]嘧啶_7_基]-N-甲基苯甲酰胺即AZD2014,是mTOR (ammalian target of rapamycin,哺乳动物雷帕霉素革巴蛋白)的复合体 mTORCl (ammalian target of rapamycin complexl)和 mT0RC2 (ammaliantarget of rapamycin complex2)的双重抑制剂,具有潜在的抗肿瘤活性胺。2-DG即2_脱氧-D-葡萄糖，是葡萄糖类似物，能够短时间一直糖酵解作用。
[0036]与一些mTOR抑制剂相比，AZD2014更有效抑制mTORCl:AZD2014降低P4EBPlThr37/46,抑制翻译起始复合体，和降低全部蛋白合成。AZD2014也抑制mT0RC2生物标记pAKTSer473和pNDRGlThr346。AZD2014作用于多种肿瘤细胞系，具有广谱抗增殖活性。
[0037]2_脱氧-D-匍萄糖(2-Dexoy-D-Glucose，2-DG)为天然抗代谢物类抗生素，具有具有能够抑制病毒感染、酵母发酵、致病菌及肿瘤细胞生长等多种生理药理效应。具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗癫痫等作用，用于预防病毒及病原菌感染等。
[0038]本发明实施例中，优选地，所述组合药物中所述3- [2，4-双((3S) -3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
`[0039]相应的，本发明还提供了一种促进肺癌细胞凋亡的药物制剂，以促进肺癌细胞凋亡的组合药物作为活性成分，并辅以可接受的要用载体。
[0040]其中，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549，所述组合药物由3-[2，4_双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
[0041]本发明实施例中，优选地，所述组合药物中所述3_[2，4-双((3S)-3_甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
[0042]本发明实施例中，优选地，所述制剂可以为口服液、胶丸、口服混悬液、固体分散体、胶囊、缓释剂、颗粒剂、片剂、注射剂、软膏、贴剂或植人剂之中的任意一种。
[0043]相应的，本发明还提供了一种肺癌细胞凋亡的检测方法，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549,所述方法包括:
[0044]步骤101、采用促进肺癌细胞凋亡的组合药物对所述肺癌细胞进行处理，同时采用所述组合药物中的两种组分分别对所述肺癌细胞进行处理，与未处理的肺癌细胞组成四组对比样品，所述组合药物由3-[2，4_双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖两种组分组成。
[0045]本发明实施例中，采用组合药物处理肺癌细胞，并对肺癌细胞的凋亡进行检测，验证组合药物的效果，可以将未处理的肺癌细胞与单一药物组分处理的肺癌细胞，以及组合药物共同处理的肺癌细胞作为四组样品，以对比不同情况下对肺癌细胞凋亡的促进作用。
[0046]在具体的处理时，可以选用指数生长期的A549细胞，然后种板，在细胞贴壁后采用药物处理，例如可以种6孔板，细胞密度约为70%，在细胞贴壁后，分别用这两种药物单独处理及联合处理A549细胞。
[0047]本发明实施例中，优选地，所述组合药物中所述3_[2，4-双((3S)-3_甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
[0048]步骤102、针对所述四组对比样品，进行预处理，所述预处理包括:采用胰酶消化所述肺癌细胞，并采用含有胎牛血清的培养基终止对细胞的消化，将终止消化后的细胞进行离心，弃除上清液。
[0049]得到四组不同的样品后，首先进行预处理，包括采用胰酶消化细胞，并进一步采用含有胎牛血清(FBS)的培养基终止对细胞的消化，终止消化后离心，弃除上清液，得到下层的细胞。
[0050]步骤103、对进行预处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测，并比对流式细胞仪的检测结果。
[0051]本发明实施例中，优选地，步骤103可以包括:
[0052]子步骤S11、采用预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞并转入无菌的离心管中。
[0053]子步骤S12、进行细胞计数，提取预设个数的肺癌细胞，离心并弃除上清液。
[0054]子步骤S13、采用磷脂结合蛋白与异硫氰酸荧光素的结合液重悬细胞，再加入所述结合液混匀，在室温下避光孵育后离心并弃除上清液。
[0055]子步骤S14、再次加入所述结合液重悬细胞，加入碘化丙啶染色液混匀，冰浴避光放置后，进行流式细胞仪检测。
[0056]流式细胞仪可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
[0057]Annexin V (磷脂结合蛋白)是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，因此Annexin V是检测细胞早期调亡的灵敏指标。
[0058]将Annexin V 进行绿色突光 FITC (fluorescein isothiocyanate,异硫氰酸突光素)标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙唳(Propidium 1dide, PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜在嵌入细胞核的双链DNA后释放红色荧光。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
[0059]本发明采用FITC标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。具体的，首先将用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻重悬细胞，并转移无菌的EP管中，并进行细胞计数，取约预设个数的(例如10万)重悬的细胞，然后进行离心，弃上清，加入Annexin V-FITC轻轻重悬细胞,然后再次加入Annexin V-FITC,轻轻混匀。在室温(20-25°C)避光孵育，然后再次离心，弃上清，再次加入Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。最后加入碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置后即可进行流式细胞仪检测，针对四组样品分别进行检测，并将检测的结果进行比对以验证组合药物对肺癌细胞凋亡的影响。
[0060]步骤104、对进行预处理后的四组样品分别进行凋亡蛋白表达的检测，并比凋亡蛋白表达的检测结果。
[0061]细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段:
[0062](I)凋亡信号转导
[0063]当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后，细胞产生复杂的生化反应，并形成与凋亡有关的第二信使:cAMP、Ca2+、神经酰胺等信号分子形成死亡信号。
[0064](2)凋亡基因激活
[0065]调控的凋亡基因在接受死亡信号后 ，开始按预定程序启动，并合成执行凋亡所需的各种酶和相关物质。
[0066](3)凋亡的执行(共同通路)
[0067]凋亡的主要执行者有两类酶:核酸内切酶(endogenous nuclease Dnase) 一彻底破坏细胞的生物命令系统；CaSpaSeS3—细胞的结构全面解体。
[0068](4)凋亡细胞的清除
[0069]凋亡的调节包括一系列复杂的级联反应，目前研究的最多的caspase (含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖的通路主要有两条:其中一条是细胞外死亡信号激活，死亡信号通过细胞外死亡配体与膜上相应的死亡受体结合传递到细胞内部，细胞内的caspase-2, _8、-10被募集并激活；另一条通路则由细胞内应急信号激活，它主要由线粒体中的细胞色素C介导，导致caspase-9的激活。一些多肽通过激活受体(如Fas，TNFRl,DR3 / ffsl-1)而直接诱导细胞凋亡。这些多肽属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，它们与相应的肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员结合，从而在许多的细胞类型中诱导凋亡。其激活途径为:配体与受体结合后，导致受体的三聚体化(trimerization)。使得受体的胞楽:部分与接头蛋白(adapter protein) Fas-相关死亡蛋白(fas-associated protein withdeath domain, FADD)和 procaspase-8 结合，procaspase-8 本身具有成熟的 caspase-8酶的I % -2 %的活性，聚集后的procaspase-8通过自身或相互之间的切割产生成熟的caspase-8 ο caspase-8可激活下游的caspases-3,后者水解ICAD而活化CAD,从而导致细胞凋亡。caspase-8同时也激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid (binding interfacedatabase)。正常状态下，Bid以非活性方式存在于胞衆内，当被caspase-8激活后，形成一种截短的Bid(truncated Bid, tBid),后者转移到线粒体,破坏线粒体膜的稳定性，导致细胞色素C等释放入胞质,激活caspase-9,进一步强化了 caspases级联反应。一些凋亡刺激因素如射线、化疗药物等，促使线粒体释放凋亡启动因子(Cyto-C、AIF、Apaf-1)、Smac / Diablo(second mitochondria—derived activator of caspase / direct IAP—binding protein with low pi)、HtrA2(high—temperature requirement factor A2)和pro-caspase-3 入胞质。[0070]上述因子通过下述多种机制导致细胞凋亡:①Cyto-C在dATP存在的情况下，与Apaf—I结合，使Apaf-1暴露其上的CARD结构域(caspase activation andrecruitment domain),并与 procaspase-9 的 CARD 结合形成凋亡复合体(apoptosome),导致procaspase-9激活,后者进一步激活caspase-3,6等,从而诱导细胞凋亡！②AIF通过促进线粒体释放细胞色素C而增强凋亡信号，并可快速激活核酸内切酶；?Smac / Diablo和HtrA2可能通过阻断凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein, IAPs)的作用参与细胞凋亡的调控。
[0071]本发明实施例中，优选地，步骤104可以包括:
[0072]子步骤S21、收集细胞沉淀，并提取蛋白。
[0073]子步骤S22、采用蛋白质印迹法检测所述四组样品凋亡相关蛋白的表达。
[0074]蛋白质印迹法即Western Blot,通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并进一步通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
[0075]本发明实施例中，在离心后去除上清液并收集细胞沉淀，提取其中的蛋白，通过蛋白质印迹法来可以检测凋亡过程中相关蛋白的表达。其中，针对四组样品分别进行检测，并对比检测结果。
[0076]为了使本领域技术人员更好地理解本发明，通过具体的示例对本发明的肺癌细胞凋亡的检测方法进行说明。
[0077]用AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5 μ mol/L)分别处理肺癌细胞。选用指数生长期的A549细胞，种6孔板，细胞密度约为70%，细胞贴壁后，分别用这两种药物单独处理及联合处理A549细胞，处理48h后，用0.25%的胰酶消化细胞，用含10%FBS的1640培养基终止消化，1000rpm/min离心5min,弃上清。
[0078]用Iml预冷的PBS轻轻重悬细胞，并转移至1.5ml无菌的EP管中，并进行细胞计数，取约10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195 μ I Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μ I Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温(20_25°C )避光孵育10分钟。1000g离心5分钟，弃上清，加入190 μ I Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
[0079]加入10μ I碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测。
[0080]收集细胞沉淀，提取蛋白，Western blot检测药物处理后凋亡相关蛋白的表达。
[0081]图2是本发明的示例中四组样品的流式细胞仪检测结果的对比图，从图中可以看出，横坐标和纵坐标显示的是用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后的细胞数，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和碘化丙唳染色(每个处理的左下角)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈阴性(每个处理的右下角)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(每个处理的右上角)。每个处理的左上角出现的是许可范围内的检测误差。图2中可以看出，相比对照组，分别用AZD2014(5 μ mol/L)和2-DG (5 μ mol/L)处理A54948h后，可促进凋亡(对照组凋亡早期的细胞占1.1%，坏死和凋亡晚期的细胞占0.2%，AZD2014处理组两者所占的比例分别为:2.7%和5.2%，2-DG处理组的两者所占比例分别为:1.4%和1.2%)，而相比AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5 μ 11101/1)单独处理4549，两者协同处理Α549细胞48h后凋亡早期的细胞占15.5%，坏死和凋亡晚期的细胞占16.2%，有显著的协同促凋亡作用。
[0082]图3是本发明的示例中四组样品的凋亡蛋白表达的检测结果的对比图，图中可以看出:BCL-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质.在线粒体上，BCL-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用，调控线粒体结构与功能的稳定性，发挥着细胞凋亡〃主开关〃的作用.BCL-2家族包括两类蛋白质:一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白.在细胞凋亡时，BCL-2家族中的促凋亡蛋白成员发生蛋白质的加工修饰，易位到线粒体的外膜上，引起细胞色素C、凋亡诱导因子等其他促凋亡因子的释放，导致细胞凋亡；而平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抗凋亡蛋白成员则抑制细胞色素c和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放，具有抑制细胞凋亡的功能。BAX是BCL-2基因家族的一员，其产物是一种与BCL-2同源的相关蛋白，能拮抗后者的生物学活性。BAX的主要作用是加速细胞凋亡，BCL-2是抗凋亡蛋白。Caspase-3是caspase_3亚家族的主要成员之一，可介导细胞凋亡。在线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路中，caspase-3被活化为cleaved-caspase3,并伴随着其他成员被激活,从而启动了 caspase级联反应,导致凋亡发生。PARP是细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶(caspase)的切割底物，cleaved-PARP是细胞发生凋亡的标志蛋白。图3中显示AZD2014 (5ymol/L)和2-DG (5 μ mol/L)协同处理较之AZD2014 (5 μ mol/L)和 2-DG (5 μ mol/L)单独处理 BAX、cleaved-caspase3、cleaved_PARP蛋白水平显著升高，BCL-2显著下调，表示AZD2014 (5 μ mol/L)和2-DG (5ymol/L)联合用药后可协同促进A549细胞株的凋亡。
[0083]综上所述,上述流式结果及Western blot的结果显示,2-DG和AZD2014联合用药后对A549细胞株的凋亡具有显著协同促进效应。
[0084]依据本发明实施例，采用3_[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉_4_基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成的组合药物作用于选自非小细胞肺癌细胞株A549的肺癌细胞，通过实验验证，本发明创新提出的组合药物可以明显促进肺癌细胞`的凋亡。
[0085]对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
[0086]以上对本发明所提供的一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物，一种促进肺癌细胞凋亡的药物制剂以及一种肺癌细胞凋亡的检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【权利要求】
1.一种促进肺癌细胞凋亡的组合药物，其特征在于，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549，所述组合药物由3-[2，4-双((3S)_3_甲基吗啉_4_基)吡啶并[5，6_e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
2.如权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述组合药物中所述3-[2，4-双((3S) -3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
3.一种促进肺癌细胞凋亡的药物制剂，其特征在于，以促进肺癌细胞凋亡的组合药物作为活性成分，并辅以可接受的要用载体； 所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549 ； 所述组合药物由3-[2，4-双((3S) -3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖组成。
4.如权利要求3所述的药物制剂，其特征在于，所述组合药物中所述3-[2，4-双((3S) -3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
5.如权利要求3所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为口服液、胶丸、口服混悬液、固体分散体、胶囊、缓释剂、颗粒剂、片剂、注射剂、软膏、贴剂或植入剂。
6.一种肺癌细胞凋亡的检测方法，其特征在于，所述肺癌细胞选自非小细胞肺癌细胞株A549,所述方法包括: 采用促进肺癌细胞凋亡的组合药物对所述肺癌细胞进行处理，同时采用所述组合药物中的两种组分分别对所述肺癌细胞进行处理，与未处理的肺癌细胞组成四组对比样品，所述组合药物由3-[2，4-双((3S)-3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺以及产生糖酵解作用的2-脱氧-D-葡萄糖两种组分组成； 针对所述四组对比样品，进行预处理，所述预处理包括:采用胰酶消化所述肺癌细胞，并采用含有胎牛血清的培养基终止对肺癌细胞的消化，将终止消化后的肺癌细胞进行离心,弃除上清液； 对进行预处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测，并比对流式细胞仪的检测结果; 对进行预处理后的四组样品分别进行凋亡蛋白表达的检测，并比凋亡蛋白表达的检测结果。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组合药物中所述3-[2，4_双((3S) -3-甲基吗啉-4-基)吡啶并[5，6-e]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲酰胺与所述2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔浓度比为1:1。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，对进行一次处理后的四组样品分别进行流式细胞仪检测的步骤包括: 采用预冷的磷酸盐缓冲液重悬细胞并转入无菌的离心管中； 进行细胞计数，提取预设个数的肺癌细胞细胞，离心并弃除上清液； 采用磷脂结合蛋白与异硫氰酸荧光素的结合液重悬细胞，再加入所述结合液混匀，在室温下避光孵育后离心并弃除上清液； 再次加入所述结合液重悬细胞，加入碘化丙啶染色液混匀，冰浴避光放置后，进行流式细胞仪检测； 对进行一次处理后的四组样品分别进行凋亡相关蛋白的表达的步骤包括: 收集细胞沉淀，并提取蛋白； 采用蛋白质印`迹法检测所述四组样品凋亡相关蛋白的表达。
【文档编号】C12Q1/02GK103768077SQ201410060361
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】汤郡, 聂培培, 邹争志, 陈颖, 庄元元, 彭碧玲, 何娟 申请人:广州金域医学检验中心有限公司