丝腺特异表达转录调控因子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丝腺特异表达转录调控因子及其应用，其序列为SEQIDNO.1。该调控因子的表达量与丝素蛋白重链及茧层量成正相关，且参与了丝素重链基因的表达调控，对于家蚕丝腺的理论研究和提高茧丝合成量的产业应用具有一定的价值。
【专利说明】丝腺特异表达转录调控因子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种丝腺特异表达转录调控因子及其应用。
【背景技术】
[0002]丝腺是家蚕唯一能生产茧丝的器官，是整个蚕丝业的生物学基础，一头家蚕一般经过25d左右的生长发育，在幼虫期食下鲜桑叶约22g，合成并分泌0.5~Ig的丝蛋白，特别是在5龄中、后期，家蚕能够以惊人的效率将桑叶蛋白转变成丝蛋白。它合成蛋白质的能力和效率，是迄今为止发现的所有生物组织器官中最强最高的一种。根据合成蛋白质的初步推测，这种高效率的蛋白质合成，不但需要众多基因的相互协调，而且基因的表达，大多数都具有高度的组织和时期特异性。家蚕只在其5龄中期后期，丝胶基因于中部丝腺大量表达合成丝胶蛋白，丝素基因(Fib-H，Fib-L，P25)在后部丝腺特异表达合成表达丝素蛋白。丝素蛋白主要由丝素重链蛋白(Fib-H)、丝素轻链蛋白(Fib-L)及P25蛋白以分子量6:6:1的比例组成。其中，Fib-H的含量高达70%以上，是丝蛋白的主要成分。家蚕茧丝合成量的多少及茧丝性能与Fib-H的表达量及蛋白结构密切相关，从野蚕驯化来的家蚕茧与现在的野蚕茧相比，其茧重比野蚕的要重10-20倍；而丝素重链基因的表达也相差上100倍以上。因此，提高丝素重链基因的表达有望提高茧的重量。研究发现，丝蛋白基因的特异表达是受丝腺组织一些特异的转录调控因子调控，同时一些泛在的转录调控因子也协作参与这一过程。根据丝腺中与蚕丝基因转录有关的转录因子的特性、将蚕丝基因表达调节中的转录因子分为两类，一种是组织特异因子，如SGF-1、SGF-2、SGF-B和PSGF。另一种是泛在的共同因子，包括SGF-3、SGF -4、TR10、UB2a、UB2b及BMFA、FBF-Al。因此，如何获得丝腺特异表达转录调控因子的显得特别重要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种丝腺特异表达转录调控因子及其应用。
[0004]本发明提供的丝腺特异表达转录调控因子，其特征在于具有SEQIDN0.1的核苷酸序列或者与SEQIDN0.1具有99%以上同源性的核苷酸序列。
[0005]本发明另一方面还涉及丝腺特异表达转录调控因子表达蛋白，其特征在于含有SEQIDN0.2的氨基酸序列.[0006]本发明另一方面涉及上述丝腺特异表达转录调控因子在增加丝素重链基因的表达中的应用。
[0007]本发明另一方面还涉及上述丝腺特异表达转录调控因子在作为提高家蚕茧丝量的合成的靶标基因中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1:pET-28a/Bmsage载体构建及原核表达纯化[0009]图2:pGEX-4T-l/Bmsage载体构建及原核表达纯化
[0010]图3:Bmsage 与 SGF-1 相互结合
[0011]图4 =Bmsage与SGF-1复合物结合于Fib-H启动子的A和B位点并调控丝素重链基因的表达
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的内容不限于此。
[0013]实施例1
[0014]设计引物进行RT-PCR，引物序列为，
[0015]F: 5 ’ -CGCGGATCCATGTACAATCAAACATAC-3，，
[0016]R:5’ -CCCAAGCTTAGTATCTCTGTTGACGC-3’，两端分别包括酶切位点 BamHI 和HindIII。以家蚕5龄3天丝腺cDNA为模板进行PCR，产物经纯化后克隆到pMD-19-Tsimple(Takara)载体上，得到pMD-Bmsage载体，序列测定表明，扩增的片段为编码这个基因的全长cDNA序列，其编码序列为SEQIDN0.1。
[0017]为了分离纯化Bmsage蛋白及制备多克隆抗体,构建Bmsage的重组蛋白表达载体。pMD-Bmsage质粒经BamHI/Hindlll酶切克隆进pET28a载体中，得到pET_28a/Bmsage载体，转化大肠杆菌BL21，37°C下经0.2mMIPTG.诱导表达获得以包涵体形式存在的重组蛋白，经Ni柱分离纯化获得重组蛋白，重组蛋白用于抗体制备(图1)。为了获得可溶的Bmsage蛋白，构建带GST标签的pGEX-4T-1/Bmsage载体，酶切位点为BamHI/Notl，16°C下经0.2mMIPTG.诱导表达，获得可溶的Bmsage蛋白。经GST柱亲和纯化,获得较纯的可溶的Bmsage融合蛋白(分子量约55KDa)，用于后期蛋白相互作用和蛋白与DNA探针的结合实验(图2)。
[0018]Bmsage与SGF-1相互结合实验
[0019]在果蚬唾液腺中，果蚬的Sage蛋白能与Forkead转录因子相互结合调控分泌蛋白的转录。家蚕的丝腺与果蝇的唾液腺是同源器官，家蚕丝腺也有一个具有forkead的转录因子SGF-1,而且,它是家蚕丝胶I基因和几个丝素基因重要的调控因子。为了证明Bmsage能与SGF-1结合，进行了蛋白与蛋白相互结合的实验。结果表明，这两种蛋白能相互结合(图 3)。
[0020]Bmsage与SGF-1通过丝素重链基因的A和B位点参与丝素重链基因的调控
[0021]由于SGF-1已经被证明能结合到丝素重链基因的A和B参与调控,而Bmsage能否结合到同一位点参与调控呢？为了证明这一点，进行了 Bmsage与A、B位点的结合实验。通过EMSA实验结果证明，Bmsage不能与A、B位点的结合。这就表明，Bmsage是与SGF-1结合,而SGF-1结合到A和B位点(图4A-C)。为了证明Bmsage参与了丝素重链基因的调控，构建了在细胞水平表达Bmsage的载体和以Fib-H上游1000bp为启动子的表达荧光素酶的载体。细胞实验结果表明，细胞水平表达Bmsage蛋白能提高荧光素酶的表达活性(图4D)。
[0022]以上实验结果表明转录因子Bmsage能够上调表达丝素重链基因的，该转录因子在丝腺中特异表达，可以作为提高丝蛋白合成和茧丝量的基因。
[0023]上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术 人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、
【权利要求】
1.丝腺特异表达转录调控因子，其特征在于具有SEQIDN0.1的核苷酸序列或者与SEQIDN0.1具有99%以上同源性的核苷酸序列。
2.丝腺特异表达转录调控因子表达蛋白，其特征在于含有SEQIDN0.2的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的丝腺特异表达转录调控因子在增加丝素重链基因的表达中的应用。
4.权利要求1所述的丝腺特异表达转录调控因子在作为提高家蚕茧丝量的合成的靶标基因中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK103805608SQ201410060356
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】刘春 , 赵小明, 夏庆友, 赵萍 申请人:西南大学