纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，属于酶工程领域。纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，包括如下步骤：将硅胶板用水浸泡、清洗后干燥；将纤维素酶溶液与沉淀剂混合均匀，将预处理的硅胶板置于混合液中使纤维素吸附到硅胶板上；再加入交联剂交联形成纤维素酶交联晶体，并固定在硅胶板上。本发明把纤维素酶交联晶体固定在硅胶板上，提高了纤维素酶的活性和稳定性，不需要回收就能反复利用，大幅度提高了纤维素酶的利用效率。
【专利说明】纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于酶工程领域，具体涉及一种纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法。
【背景技术】
[0003]纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。
[0004]纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的酶解成本成为纤维素酶工业化降解纤维素的瓶颈。
[0005]降低纤维素酶成本一个有效的方法是提高酶的利用效率。提高纤维素酶利用效率的方法有获得催化性能高的纤维素酶，提高纤维素酶的稳定性，对催化的纤维素采用廉价地处理方法提高催化效果。通过固定技术来固定纤维素酶，让纤维素酶反复利用，从而降低纤维素酶解的成本。
[0006]纤维素酶通过与固定介质形成共价键来固定，虽然固定的纤维素酶被固定的非常牢固，但是其酶活大幅度降低，有效酶活仅仅为固定前酶活的I~10%。吸附或包埋固定能减少酶活的损失。纤维素酶吸附或包埋固定的方法有海藻糖硫酸钙固定，磁性海藻硫酸钙固定等，这些固定方法都是把纤维素酶固定在微球上。已有的通过吸附或固定纤维酶的方法虽然能实现纤维素酶的反复利用，但是由于固定的载体是球体，球体内部的纤维素酶不能有效和纤维素接触，从而大幅度降低了纤维素酶的催化活性。而且由于纤维素酶固定在微球上，还有另外一个不利的地方微球密度虽然与其反应溶液密度有差异，能自己沉淀，但是在实际降解纤维素时，由于大量的微球会吸附在纤维素碎片如稻草杆碎片表面，其一旦吸附，就不会沉淀下去，给纤维素酶的回收带来很大困难。
[0007]把酶形成晶体，用微晶体进行催化能提高催化效率，增强酶的稳定性。同样微晶体的回收也需要离心等工艺，步骤繁琐，而且回收的过程中微晶体有损失。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法。
[0009]本发明的目的 通过下述技术方案实现:
一种纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，包括如下步骤:将硅胶板用水清洗干净，纤维素酶吸附后加入沉淀剂沉淀，加入交联剂交联，纤维素酶交联晶体被固定在硅胶板上。
[0010]优选的，所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，包括如下步骤:(1)硅胶板预处理:将硅胶板用水浸泡、清洗后干燥；
(2)纤维素的吸附:将纤维素酶溶液与沉淀剂混合均匀，将预处理的硅胶板置于混合液中使纤维素吸附到硅胶板上；
(3)纤维素酶交联晶体的固定:再加入交联剂交联形成纤维素酶交联晶体，并固定在硅胶板上。
[0011]步骤(2)中所述的沉淀剂优选为乙腈。
[0012]步骤(3)中所述的交联剂优选为戊二醛。
[0013]更优选的，步骤(1)硅胶板预处理为:将硅胶板在去离子水中浸泡4 h，然后用去离子水冲洗3次，在25 °C干燥24 h。
[0014]步骤(2)纤维素的吸附为:将纤维素酶溶解在的柠檬酸缓冲液中，再加入冷却到4°〇的乙腈混合均匀，预处理的硅胶板置于混合液中摇晃5 min，然后静止20 min。纤维素酶与柠檬酸缓冲液的质量体积比优选为1:50 (g:mL)，柠檬酸缓冲液与乙腈的体积比优选为1:2。
[0015]步骤(3)纤维素酶交联晶体的固定为:加入戊二醛溶液，于摇床中350 r/m摇动12h0
[0016]一种固定有纤维素酶交联晶体的硅胶板，通过上述方法得到。该硅胶板通过用去离子水冲洗后可重复利用；优选的，用30 °C去离子水冲洗3次。
[0017]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明把纤维素酶固定在硅胶板上，纤维素酶都固定在硅胶板的表面，这样纤维素酶都能够有效和纤维素接触，从而有效减少纤维素酶活的损失。本发明把纤维素酶本身牢地固定在纤维素薄板上，避免了用微球固定纤维素酶及微晶体回收困难的不利因素。
[0018]本发明把纤维素酶交联晶体固定在硅胶板上，提高了纤维素酶的活性和稳定性，不需要回收就能反复利用，大幅度提高了纤维素酶的利用效率。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0020]实施例1
A硅胶板预处理
薄层层析硅胶板(薄层层析硅胶板G，上海研拓生物科技有限公司)在去离子水中浸泡4h，然后用去离子水冲洗3次，在25 °C干燥24 h。薄层层析硅胶板G被切割成10 cmXIOOcm的板子。把薄层层析硅胶板G放置于10 cmX 40 cmX 10 cm玻璃箱。把硅胶板放入到玻璃箱内，硅胶板紧贴底部的玻璃板。
[0021]B纤维素的吸附
1g纤维素酶(Sigma购买)溶解在50 mL的柠檬酸缓冲液(pH 5.0，0.1M)中，再加入100 mL冷却到4 1:的乙腈混合均匀，把混合液体倒入到玻璃箱内。端起玻璃箱的底部，轻轻摇晃5 min,然后静止20 min。
[0022]C纤维素酶交联晶体的固定
质量分数为50%的戊二醛溶液9.2 mL加入到静止的溶液中，玻璃箱放置在摇床中，350r/m摇动12 h。此时纤维素酶分子之间相互交联，形成交联晶体，并被固定在硅胶薄板上。[0023]D纤维素酶酶活性测定
以羟甲基纤维素为底物，在50 1:进行酶降解反应。在250 mL烧杯中含有20 g/L的羟甲基纤维素柠檬酸缓冲液(pH 5.0,0.1 M)100 mL，加入游离的纤维素酶或固定的纤维素酶交联晶体(切取lcmX4cmXlcm固定维素酶的硅胶条)，在水浴锅中50 °C保温30 min。还原糖采用DNS法测定。酶活定义为:每分钟释放出I Mfflol还原糖所需要的酶量。
[0024]测定的固定酶的酶活与游离酶的酶活比值为1.1:1，表明固定的纤维素酶具有更高的催化活性。
[0025]E游离的纤维素酶和固定的纤维素酶晶体稳定性的测定
游离的纤维素酶或固定的纤维素酶交联晶体(切取lCmX4CmXlCm固定纤维素酶的硅胶条)在70 °C保温3 min，测定剩余的酶活性。以剩余的酶活性与初始酶活性的比值为度量酶稳定性的标准。鉴定结果如下表1，说明固定在硅胶板上的纤维素酶具有更好的稳定性。
[0026]表1.酶稳定性的测定 _
【权利要求】
1.一种纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于包括如下步骤:将硅胶板用水清洗干净，纤维素酶吸附后加入沉淀剂沉淀，加入交联剂交联，纤维素酶交联晶体被固定在硅胶板上。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于包括如下步骤: (1)硅胶板预处理:将硅胶板用水浸泡、清洗后干燥； (2)纤维素的吸附:将纤维素酶溶液与沉淀剂混合均匀，将预处理的硅胶板置于混合液中使纤维素吸附到硅胶板上； (3)纤维素酶交联晶体的固定:再加入交联剂交联形成纤维素酶交联晶体，并固定在硅胶板上。
3.根据权利要求2所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:步骤(2)中所述的沉淀剂为乙腈。
4.根据权利要求2所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:步骤(3)中所述的交联剂为戊二醛。
5.根据权利要求2所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:步骤(I)硅胶板预处理为:将硅胶板在去离子水中浸泡4 h，然后用去离子水冲洗3次，在25°C干燥24 h。
6.根据权利要求2所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:步骤(2)纤维素的吸附为:将纤维素酶溶解在的柠檬酸缓冲液中，再加入冷却到4 °C的乙腈混合均匀，预处理的硅胶板置 于混合液中摇晃5 min,然后静止20 min。
7.根据权利要求6所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:纤维素酶与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1:50，柠檬酸缓冲液与乙腈的体积比为1:2。
8.根据权利要求2所述的纤维素酶交联晶体在硅胶板上的固定方法，其特征在于:步骤(3)纤维素酶交联晶体的固定为:加入戊二醛溶液，于摇床中350 r/m摇动12 h。
9.一种固定有纤维素酶交联晶体的硅胶板，通过权利要求1-8任一项所述的方法得到。
10.根据权利要求9所述的固定有纤维素酶交联晶体的硅胶板，其特征在于:所述的硅胶板通过用去离子水冲洗后可重复利用。
【文档编号】C12N11/04GK103805589SQ201410071081
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】薛栋升, 汪江波, 彭春龙, 周敏 申请人:湖北工业大学