一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光qrt-pcr引物、探针及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。所述引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～3所示。本发明检测牛、羊赤羽病病毒的方法是以样品RNA为模板，利用上述引物和探针，进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测，反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。根据模拟标准品制备的标准曲线，可以进行定量一步法实时荧光QRT-PCR扩增检测。本发明所述检测牛、羊赤羽病病毒的方法安全、快速、特异性好、敏感性强，为畜牧业牛、羊赤羽病的检测以及进境牛羊的检疫工作提供了技术支持。
【专利说明】—组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒分子生物学检测【技术领域】。更具体地，涉及一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物、探针及其使用方法。
【背景技术】
[0002]赤羽病(Akabane disease, AKAD)又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒(Akabanevirus,AKAV)引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性病毒传染病。该病的病症主要有流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊等，能引起先天性关节弯曲和积水性无脑综合症。该病为虫媒性传染病，传播媒介为吸血的蚊、库蠓等。赤羽病是世界动物卫生组织(OIE)法定通报性疾病，也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。研究表明，该病在我国进口牛、羊的主要国家存在，因此有随着牛、羊进口引进该病的风险。如果该病随着大量牛、羊的进口传入我国，将给我国畜牧业造成严重的经济损失。
[0003]由于感染动物早期一般不出现临床症状，该病在8~9月份发生流产及早产，且数量激增，至10月份为最高峰，往往被误认为是由热应激引起，不易在感染早期发现。因此，及早发现牛、羊群是否感染赤羽病病毒，是减少生产损失的有效途径。由于感染早期动物体内的病毒复制有限，不易检测，因此感染早期的动物往往检测不出来。
[0004]为防治和消灭牛、羊赤羽病，首先必须迅速、准确地检测出赤羽病病毒。经过几十年的努力，赤羽病检测技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验，目前已发展为更敏感、更特异、更方便、更经济的分子生物学检测技术。张吉红等根据GenBank中赤羽病病毒的基因序列，设计了特异性引物和探针，建立了检测赤羽病病毒的Real-time RT-PCR方法，但是其敏感性并不是特别好，检测下限为1.18ng/^L，仍然满足不了对感染早期牛、羊群准确检测的要求。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有检测牛、羊赤羽病病毒方法的敏感性不足等问题，提供一组准确、快速、特异性好、敏感性更强的检测牛、羊赤羽病病毒的引物、探针及其使用方法。
[0006]本发明的目的是提供一组检测牛、羊赤羽病病毒的一步法实时荧光QRT-PCR引物和探针。
[0007]本发明另一目的是提供一种利用所述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒的方法。
[0008]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，所述引物为Pf99/AKAV和Prl84/AKAV，其核 苷酸序列如SEQ ID N0.1~2所示。
[0009]本发明还提供了一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，所述探针为Pbl32/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。
[0010]优选地，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA, ROX或DABCYl中的一种。
[0011]更优选地，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQl。
[0012]本发明所述引物和探针是根据Genebank上公布的赤羽病S基因保守片段序列，利用Primer Express 3.0基因分析软件设计。所有引物和探针的合成均由上海英骏生物技术有限公司完成。
[0013]本发明还提供了一种利用上述引物和探针检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Prl84/AKAV，以及探针Pbl32/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增；
所述扩增的结果判定方法为:反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。
[0014]优选地，所述样品的核酸为RNA。
[0015]优选地，所述实时荧光QRT-PCR扩增的反应体系如下:
【权利要求】
1.一组检测牛、羊赤羽病病毒核酸的引物，其特征在于，所述引物为Pf99/AKAV和Prl84/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2所示。
2.一种检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述探针为Pbl32/AKAV，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。
3.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM、HEX、TET、J0E、VIC、FITC、CY3或CY5中的一种，所述的淬灭荧光染料为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ROX 或 DABCYl 中的一种。
4.根据权利要求2所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的探针，其特征在于，所述的报告荧光染料为FAM，所述的淬灭荧光染料为BHQl。
5.—种检测牛、羊赤羽病病毒核苷酸的方法,其特征在于,该方法是以样品的核酸为模板，利用引物Pf99/AKAV和Prl84/AKAV、探针Pbl32/AKAV进行一步法实时荧光QRT-PCR扩增； 所述扩增的结果判定方法为:扩增反应结束后，如果出现特异性荧光扩增曲线，则判定样品的核酸中含有牛、羊赤羽病病毒核酸，即该样品为牛、羊赤羽病病毒阳性。
6.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述样品的核酸为RNA。
7.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述一步法实时荧光QRT-PCR扩增的反应体 系如下:
8.根据权利要求5所述检测牛、羊赤羽病病毒核酸的方法，其特征在于，所述一步法实时荧光QRT-PCR扩增的反应条件如下:50°C逆转录30min ;92°C变性3min ;以92°C、10s，55。。、30s，68。。、60s预扩增4个循环；92°C、10s，60°C、40s主扩增40个循环，收集荧光信号。
【文档编号】C12Q1/70GK103789455SQ201410070989
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】鱼海琼, 林志雄, 陈茹, 翟建新, 罗长保, 赵吟, 贾坤, 田纯见, 朱道中, 王宏 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心