一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法

一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法及制备的酸马乳。利用自筛选马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）WWMJ-1CGMCC?No.8432基础上，联合乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）和红曲霉菌（Monascusruber）组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，制备的酸马乳具有显著的降血脂功效，不仅保留了马乳中丰富的营养，更赋予酸马乳的保健功能，具有广泛的应用价值。
【专利说明】一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵【技术领域】，具体的，本发明涉及一种采用微生物菌种混合发酵制备功能酸马乳的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马乳是新疆少数民族饮食文化中的瑰宝。马乳的营养价值很高，与其他畜类奶相比含有丰富的蛋白质、乳糖、维生素和矿物质，并含有人体不可缺少的氨基酸和脂肪酸。马乳中富含多种营养物质，易被人体吸收利用，特别适合婴幼儿和老弱病人饮用，且具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用。
[0003]酸马乳是新疆少数民族特色食品中的一种，深受大家的喜爱。马乳中富含多种营养物质，易被人体吸收利用，且具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用。临床常用来辅助治疗结核、肝损坏、坏血病、心脏病、高血压、高血脂能等疾病。酸马乳之所以具有良好的医疗保健功能，其一是因为新鲜马乳在微生物的 发酵作用下产生了大量的生物活性物质；其二是因为马乳和酸马乳中不饱和脂肪酸含量较高，其中亚油酸和亚麻酸含量则更高，使得酸马乳具有降血脂等功能。据报道，现有成人高血脂症的患病率为每天仍以万人的速度递增，早期控制并及时治疗高脂血症迫在眉睫。目前，国内外未见采用多菌种复合发酵制备具备功能性酸马乳的报道，研究开发具有实用性的微生物菌种获得稳定的具有降血脂功能的酸马乳具有重要的意义。

【发明内容】

[0004]针对现有技术中未见有关利用复合菌种混合发酵制备降血脂酸马乳开发利用的现状，基于新疆地区各民族长期饮用酸马乳的地缘优势，充分利用产地的微生物群落资源，开发适用于降血脂酸马乳的复合微生物菌种制剂。本发明目的在于提供一种复合菌种混合发酵制备的降血脂酸马乳及其制备方法。
[0005]本发明的技术方案:通过以新疆产新鲜马乳为原料，利用自筛选马克思克鲁维酵母菌基础上，联合干酪乳杆菌、乳酸乳球菌和红曲霉菌组成复合菌种混合发酵，将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken试验,采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数,确定提供一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法及制备的酸马乳，制备的酸马乳具有降血脂功效，具有广泛的实用性和开发价值，为充分开发利用马乳资源具有重要的现实开发价值。
[0006]具体的，本发明提供了一种制备酸马乳的马克思克鲁维酵母菌(Jluyveromycesmarxi anus ) WWMJ-1。
[0007]本发明选用的马克思克鲁维酵母菌fflarjria/ws) WWMJ-1,根据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆乌鲁木齐南山地区哈萨克族牧民家采集的自制传统发酵酸马乳中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从酸马乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，从中优选出一株编号为WWMJ-1的菌株，菌种经培养后菌落呈边缘整齐、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子；该细菌发酵半乳糖，有时缓慢，不发酵蔗糖及麦芽糖，不发酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2S04、KN03 ;醇类同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明胶液化、硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验均为阴性，能够在15°C生长，具有接种后生长稳定，延迟期短，适应快。经微生物学分类与鉴定为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus) ?
[0008]本发明采用的菌种编号为WWMJ-1的马克思克鲁维酵母菌UUuyveromycesmarxianus),该细菌经YPD培养基分离培养，挑取疑似酵母菌菌落进行显微镜观察，将其初步界定酵母菌菌株；该菌株在YPD培养基平板上划线培养24-48h，能形成菌落呈边缘整齐、表面光滑、乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，无性繁殖均为芽殖，有时有假菌丝，无子囊孢子和掷孢子；该菌株培养条件:培养温度20-3(TC，最适培养温度28°C ；优先生长于Yro培养基表面，Yro培养基组分酵母膏10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，蒸馏水1.0L, YPD固体培养基加琼脂20.0g/L ;菌株在YPD固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm,正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。该菌种的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，28°C，135r/min培养24_48h。
[0009]参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》iiBergey，s Manual of SystematicBacterio-1ogy)))第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对马克思克鲁维酵母菌(.Kluyveromyces marxianus)菌株进行形态学测定、生理生化检测，结合该菌种的菌落形态、生理生化特性，以及5.8S rDNA同源分析、系统发育分析结果，确定菌种编号为WWMJ-1菌株为马克思克鲁维酵母菌UUuyveromyces marxianus),该菌种于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101， 保藏日期是2013年11月5日，保藏号是CGMCC N0.8432。经上述微生物学综合鉴定归属为马克思克鲁维酵母菌(Λ7uyveromyces marxianus)。
[0010]本发明选用外购菌种。
[0011]本发明外购一株乳酸乳球菌(ZaciococciAs Jacii1S),该菌株具有产酸能力强,发酵周期短的特点。该菌株培养条件:培养温度30_40°C，最适培养温度37°C;h优先生长于MRS培养基，培养基表面；MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-80 1.0 ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，MRS固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了乳酸乳球菌(ZaciococcWs Iactis)的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，37°C,135r/min 培养 18_24h。
[0012]本发明外购一株干酪乳杆菌casei),该菌株具有产酸能力强,发酵周期短的特点。该菌株培养条件:培养温度30-40°C，最适培养温度37°C;优先生长于MRS培养基，培养基表面；MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L,吐温-80 1.0 ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，MRS固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了干酪乳杆菌casei)的发酵工艺:在无菌条件下,挑取该菌株,37°C,135r/min 培养 18_24h。
[0013]红曲霉属常见腐生真菌，能产生许多如红曲色素、洛伐他汀A后文使用缩写Μ.K)、桔霉素(桔青霉素)等活性成分次级代谢产物。红曲中的Μ.K是医学界公认的能够降低人体胆固醇的理想药剂，具有高效、安全、低毒的特点。而红曲霉中有一种霉菌毒素一桔霉素已经成为我国红曲及相关产品出口的瓶颈。
[0014]本发明选用外购一株红曲霉菌(ifoftascm rMer),该菌株具有产M.K能力高,桔霉素产量低的特点。该菌株培养条件:培养温度28-35°C，最适培养温度30°C ;优先生长于麦芽汁培养基，培养基表面；麦芽汁培养基组分麦芽浸粉130g/L、氯霉素0.lg/L，蒸馏水
1.0L，麦芽汁固体培养基加琼脂20.0g/L。本发明提供了红曲霉菌rMer)的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，30 0C，135r/min培养48_72h。[0015]同时，本发明提供一种采用如上提供的菌种混合发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。
[0016](I)马乳预处理:将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65°C，在20MPa条件下均质10_15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
[0017](2)种子发酵液及母发酵液的制备。
[0018]种子发酵液:将4 °C下保存的乳酸乳球菌(ZaciococciAs 7acii5.)、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌种在无菌环境下接种,分别将乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)接种于 MRS 培养基置于 37°C培养 18-24h，将马克思克鲁维酵母菌焊cm marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432接种于YPD培养基置于28°C培养24-48h，将红曲霉菌iMonascus ruber)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48-72h活化，备用。
[0019]母发酵液:将步骤(1)预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoaasciAs rwAer)种子发酵液按照体积比计5%接种量分别接入相应的四个发酵容器中，分别置于37°C培养18-24h、28°C培养24-48h和30°C培养48-72h，备用。
[0020](3)发酵液的制备:发酵液由发酵液I和发酵液2组成。
[0021]发酵液I的制备:将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接种于步骤(1)预处理好选用发酵液I用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL,发酵温度32-33°C、发酵时间为50-55h条件下发酵得到发酵液I。
[0022]发酵液2的制备:将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5%接种于步骤(1)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5 g/100ml，发酵温度28-29°C、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2。
[0023](4)混合发酵液:将步骤(3)制备的发酵液I和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4°C下保存。
[0024]进一步，本发明提供一种采用如上提供的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，具体制备方法步骤如下。[0025](I)马乳预处理:将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到65°C，在20MPa条件下均质lOmin，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
[0026](2)种子发酵液及母发酵液的制备:
种子发酵液:将4 °C下保存的乳酸乳球菌Ueictococcus Iactis),干酪乳杆菌{Lactobacillus casei)、马克思克鲁维酵母菌菌UUuyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌种在无菌环境下接种,分别将乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)接种于 MRS 培养基置于 37°C培养 24h，将马克思克鲁维酵母菌marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 接
种于YPD培养基置于28°C培养48h，将红曲霉菌rMer)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48h活化,备用。
[0027]母发酵液:将步骤(1)预处理好的选用母发酵液用量的马乳按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoaasciAs rwAer )种子发酵液用量按照体积比计5%接种量接入发酵容器中，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，备用。
[0028](3)发酵液的制备:发酵液由发酵液I和发酵液2组成。
[0029]发酵液I的制备:将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液按照体积比计1.5: 1.5:5接种于步骤(1)预处理好选用发酵液I用量的马乳中，在糖添加量为4g/100mL，发酵温度33°C、发酵时间为53h条件下发酵得到发酵液I。
[0030]发酵液2的制备:将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7%接种于步骤(I)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5 g/100ml，发酵温度29°C、发酵时间7d条件下发酵得到发酵液2。
[0031](4)混合发酵液:将步骤(3)制备的发酵液I和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4°C下保存。
[0032]本发明提供采用上述确定的发酵工艺方法制备的酸马乳，制备的酸马乳具备特有产品典型性，其质量特征如下。
[0033](I)感官指标:色泽:微黄色；香气:具有酸马乳固有的奶味香，酸味适中；滋味:口感微涩；体态:乳浊液容许少许沉淀。
[0034](2)理化指标:总酸:150~160° T，还原糖含量≤6g/L，M.K含量为2.947Pg/mL，
桔霉素含量未检出。
[0035](3)微生物指标:菌落总数(cfu/mL) ( 100 ;大肠菌群(MPN/100 mL) ( 3 ;致病菌:未检出。
[0036]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下技术效果。
[0037](I)本发明提供的用于发酵制备酸马乳的马克思克鲁维酵母菌焊marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432,该菌株发酵能力强、热稳定性好,产香能力强,产生抗生素，且具有抑菌性；在发酵过程中产生主要是二氧化碳和酒精，使其富有更加独特的滋味和气味。[0038](2)本发明提供了采用特定发酵工艺方法制备酸马乳，本发明通过筛选获得的马克思克鲁维酵母菌OffiiFce1S marxianus ) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 基础上，联合乳酸乳球菌iLac tococcus lac iis )、干酿乳杆菌iLac tobaciIlus casei )、和红曲霉菌(.Monascus ruber、组成复合菌种混合发酵,将接种比例、发酵温度、发酵时间、糖添加量多个单因素试验对发酵酸马乳的影响，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验设计，采用响应面法优化确定酸马乳的最佳制备工艺参数，制备的酸马乳具备特有产品典型性，且具有显著的降血脂功效，不仅保留了马乳中丰富的营养赋予酸马乳的保健功能，具有广泛的实用性和开发价值。
[0039]【专利附图】

【附图说明】
图1显示为采用复合菌种混合发酵制备降血脂酸马乳的工艺流程图。
[0040]图2显示为保藏菌株马克思克鲁维酵母菌的菌落形态图。
[0041]图3显示为干马克思克鲁维酵母菌保藏菌株的系统进化发育树图。
[0042]图4酸马乳发酵接种比例与发酵温度交互作用的响应面图。
[0043]图5酸马乳发酵发酵温度与发酵时间交互作用的响应面图。
[0044]图6酸马乳发酵糖添加量与发酵温度交互作用的响应面图。
[0045]图7显示为不同红曲霉接种量对马乳的影响图。
[0046]图8显示为不同发酵温度对马乳的影响图。
[0047]图9显示为不同发酵时间对马乳的影响图。
[0048]图10接种量和发酵温度交互作用对M.K含量影响的响应面图。
[0049]图11接种量和发酵时间交互作用对M.K含量影响的响应面图。
[0050]图12发酵时间和发酵温度交互作用对M.K含量影响的响应面图。
【具体实施方式】
[0051]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0052]采用的主要的试剂:MRS培养基；YPD培养基；麦芽汁培养基；洛伐他汀标准品(纯度99.8%，规格25mg)、桔霉素标准品(纯度99.9%，规格IOmg) sigma公司；乙腈(色谱纯)Fisher Chemicals公司；甲醇、95%乙醇、磷酸均为分析纯；阳性对照药品血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司产品；胆固醇、猪胆盐，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；试验动物选用普遍的昆明种小鼠购自新疆医科大学动物实验中心。
[0053]本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0054]实施例一:马克思克鲁维酵母菌UUuyveromyces marxianus ) WWMJ-1 CGMCCN0.8432的筛选、分离纯化和鉴定
初筛:取传统发酵酸马乳ImL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上充分混合均匀。将发酵酸马乳以?ο倍级进行稀释，稀释度为ιο'ιο'ιο'ιο'ιο'ιο-6。用移液器吸取上述稀释度样液各lmL，采用倾注法倒入YPD培养基，平板置于28°C培养箱中培养24-48h。观察并记录菌落特征并挑取疑似酵母菌菌落，并对疑似的菌种进行编号。
[0055]菌种的纯化:将疑似菌株再接种于YPD琼脂培养基，于28 °C培养箱恒温培养24-48h，重复3-4次纯化酵母菌。纯化后的酵母菌菌株接种于YPD斜面，28 °C培养箱恒温培养24-48h后，4°C保存备用。
[0056]根据新疆的地理特殊性，从新疆乌鲁木齐南山地区哈萨克族自制传统发酵酸马乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，从中分离筛选出编号为CGMCCN0.8432的马克思克鲁维酵母菌(JUuyveromyces marxianus),其能够产乙醇。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》iiBergey，s Manual of Systematic ifecierio-Jo#》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对马克思克鲁维酵母菌进行形态学测定，生理生化检测，确定编号为WWMJ-1的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)菌株为马克思克鲁维酵母菌{Kluyveromyces marxianus)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，保藏日期是2013年11月5日，保藏号是CGMCC N0.8432。
[0057]菌株编号为WWMJ-1的培养条件:培养温度20_30°C，最适培养温度28°C ;优先生长于Yro培养基表面，Yro培养基组分采用酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加入20g/L琼脂。菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐；菌落不透明，呈乳白色或奶油色。见附图2。
[0058]菌株马克思克鲁维酵母菌fflarjria/ws)WWMJ_1CGMCC N0.8432 的鉴定。
[0059](I)生理生化鉴定:该菌种经Yro培养基分离培养，挑取疑似酵母菌菌落进行显微镜观察，将其初步界定酵母菌菌株；该菌株在YPD培养基平板上划线培养24-48 h，能形成菌落呈边缘整齐、表面光滑乳白色或奶油色，凸起的圆形，细胞呈椭圆或卵圆形，参见附图2。该细菌发酵半乳糖，有时缓慢，不发酵蔗糖及麦芽糖，不发酵蜜二糖，同化蔗糖，氮源同化(NH4)2SCV KNO3 ;醇类同化乙醇和山梨醇。水解尿素、明胶液化、硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验均为阴性，能够在15°C生长，经5.8S r DNA同源分析、系统发育分析结果都表明，编号为WWMJ-1的菌株经生理生化鉴定鉴定为马克思克鲁维酵母菌QUuyverowcesmarxianus)。
[0060](2)5.8S rDNA序列比对及系统发育分析:将测序得到的5.8S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的5.8S rDNA序列，用DNAstar构建系统进化树，结果参见附图3所示。菌株WWMJ-1隶属于马克思克鲁维酵母菌Q(1 uyveromyces marxianus)，与 Kluyveromyces marxianus 亲源关系最近，同源相似性达99%，但从基因序列菌株属性分析存在明显差异，确定菌株WWMJ-1为马克思克鲁维酵母菌，结合上述提供的菌种编号为WWMJ-1的菌落形态、生理生化特性，生物学分类名称为马克思克鲁维酵母菌{Kluyveromyces marxianus)。菌株WWMJ-1的具体序列参见附后的序列表。
[0061]实施例二:培养基的选用
MRS培养基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温_801mL，蒸馏水1000mL。
[0062]YPD培养基:酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。[0063]麦芽汁培养基:麦芽浸粉130g、氯霉素0.1g,蒸馏水1000mL。
[0064]上述各培养基的固体培养基采用相应添加琼脂20.0g/L。
[0065]马克思克鲁维酵母菌fflarjria/ws)WWMJ-1CGMCC N0.8432 的生理生化试验培养基:硝酸盐还原培养基:牛膏3g，蛋白胨5g，硝酸钾lg，蒸馏水I OOOmL，将各成分溶于蒸馏水中，调PH至7.2-7.4，分装试管，每管约5mL，121°C灭菌15min ；)产酸培养基:葡萄糖5g，灭菌的CaCO3 0.5g，酵母浸出液IOOmL,琼脂2g，灭菌12rC，20min;产酯培养基:葡萄糖5g，10%豆芽汁100ml，分装于50ml三角瓶中，每瓶20ml，灭菌121°C，20min ；无维生素基础培养基:硫酸铵5g，葡萄糖10g，组氨酸盐酸盐10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg,硼酸500mg,硫酸铜40 mg,碘化钾100 mg,三氯化铁200 mg,硫酸猛400 mg,钥酸钠200 mg,硫酸锌400 mg,磷酸二氢钾0.85g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.1g,氯化钙0.lg，蒸馏水1000mL ;碳源同化基础培养基:(NH4)2SO4 5 g, KH2PO4 lg, MgSO4.7H205g, CaCl2.2Η20 0.1g7NaCl 0.1g,糖或其他碳源5g,酵母膏0.2g,蒸懼水1000mL ;氮源同化基础培养基:葡萄糖20g, KH2PO4 lg, MgSO4.7H20 5g，酵母膏0.2g，蒸馏水1000mL ;尿素水解基础培养基:蛋白胨lg，氯化钠5g，葡萄糖lg，磷酸二氢钾2g，0.4%酚红溶液3mL，20%尿素溶液lOOmL，蒸馏水1000mL ;糖发酵培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，所试糖、苷或醇5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液lmL，蒸馏水lOOOmL，加热溶解各成分于蒸馏水中，调pH值至7.4，加入指示剂混匀，分装于装有倒置小玻管的小试管内，121°C灭菌15min。[0066]实施例三:复合菌种混合发酵制备酸马乳
参见附图1，采用自筛选的马克思克鲁维酵母菌marxianus) WWMJ-1和选用的干酿乳杆菌casei)、乳酸乳球菌(Lac iococcws I act is)和红曲霉菌iMonascus ruber)组成的复合菌种发酵制备酸马乳的方法,具体制备方法步骤如下。
[0067](I)马乳预处理:将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65°C，在20MPa条件下均质10_15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
[0068](2)种子发酵液及母发酵液的制备。
[0069]种子发酵液:将4 °C下保存的乳酸乳球菌(Zaciococcws /aciis)、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌种在无菌环境下接种,分别将乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)接种于 MRS 培养基置于 37°C培养 18-24h，将马克思克鲁维酵母菌焊cm marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432接种于YPD培养基置于28°C培养24-48h，将红曲霉菌iMonascus ruber)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48-72h活化，备用。
[0070]母发酵液:将步骤(1)预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoaasciAs rwAer)种子发酵液按照体积比计5%接种量分别接入相应的四个发酵容器中，分别置于37°C培养18-24h、28°C培养24-48h和30°C培养48-72h，备用。
[0071](3)发酵液的制备:发酵液由发酵液I和发酵液2组成。[0072]发酵液I的制备:将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接种于步骤(1)预处理好选用发酵液I用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL,发酵温度32-33°C、发酵时间为50-55h条件下发酵得到发酵液I。
[0073]发酵液2的制备:将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5%接种于步骤(1)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5 g/100ml，发酵温度28-29°C、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2。
[0074](4)混合发酵液:将步骤(3)制备的发酵液I和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4°C下保存。
[0075]采用上述确定的发酵工艺方法制备的酸马乳，制备的酸马乳具备特有产品典型性，其质量特征:感官指标:色泽:微黄色；香气:具有酸马乳固有的奶味香，酸味适中；滋味:口感微涩；体态:乳浊液容许少许沉淀；理化指标:总酸:150~160° T，还原糖含量(6g/L，Μ.K含量为2.947Pg/mL，桔霉素含量未检出;微生物指标:菌落总数(cfu/mL)(100 ;大肠菌群(MPN/100 mL) ( 3 ;致病菌:未检出。
[0076]实施例四:复合菌种混合发酵制备酸马乳
参见附图1，采用自筛选的马克思克鲁维酵母菌marxianus) WWMJ-1和选用的干酿乳杆菌casei)、乳酸乳球菌(Lac iococcws I act is)和红曲霉菌iMonascus ruber)组成的复合菌种发酵制备酸马乳的方法,具体制备方法步骤如下。
[0077](I)马乳预处理:将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到65°C，在20MPa条件下均质lOmin，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液1、发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20。
[0078](2)种子发酵液及母发酵液的制备。
[0079]种子发酵液:将4 °C下保存的乳酸乳球菌iLac tococcus Iac Hs )、干酪乳杆菌(.LactobaciIlus casei)、马克思克鲁维酵母菌菌UUuyveromyces marxianus) WWMJ-1CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoftascws rwAer)菌种在无菌环境下接种,分别将乳酸乳球菌(.Lactococcus Jacii1S)和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)接种于 MRS 培养基置于 37°C培养 24h，将马克思克鲁维酵母菌marxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432 接种于YPD培养基置于28°C培养48h，将红曲霉菌rMer)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48h活化,备用。
[0080]母发酵液:将步骤(1)预处理好的选用母发酵液用量的马乳按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的乳酸乳球菌ilactococcuslactis.、、干酪乳杆菌{Lactobacillus casei )、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromycesmarxianus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和红曲霉菌(ifoaasciAs rwAer )种子发酵液用量按照体积比计5%接种量接入发酵容器中，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，备用。
[0081](3)发酵液的制备:发酵液由发酵液I和发酵液2组成。
[0082]发酵液I的制备:将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液按照体积比计1.5:1.5:5接种于步骤(1)预处理好选用发酵液I用量的马乳中，在糖添加量为4g/100mL，发酵温度33°C、发酵时间为53h条件下发酵得到发酵液I。[0083]发酵液2的制备:将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7%接种于步骤(I)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5 g/100ml，发酵温度29°C、发酵时间7d条件下发酵得到发酵液2。
[0084](4)混合发酵液:将步骤(3)制备的发酵液I和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4°C下保存。
[0085]实施例五:降血脂酸马乳发酵试验设计
1.乳酸菌、酵母菌混合发酵试验设计:单因素试验设计
通过初步筛选，试用不同的乳酸菌，确定选用的两种乳酸菌，即干酪乳杆菌{LactobaciIlus casei)、乳酸乳球菌 iLactococcus Iactis)和红曲霉菌 iMonascusruber)和自筛选的马克思克鲁维酵母菌WWMJ-1作为制备酸马乳的菌种。
[0086]通过接种量为乳酸球菌％:乳酸杆菌％:酵母菌％=1:1:6、1.5:1.5:5,2:2:4,
2.5:2.5:3、3:3:2，发酵温度为26、28、30、32和34°C，发酵时间为1、2、3、4和5d及糖添加量2、4、6、8和10g/100mL，接种比例、发酵温度、发酵时间和糖的添加量四个单因素对发酵马乳品质的影响，选择较为显著的影响因素，筛选响应面试验设计可取的因素。
[0087](I)不同接种比例对发酵液的影响:表1不同接种比例对发酵液的影响
【权利要求】
1.一种适用于酸马乳发酵的马克思克鲁维酵母菌UU uyveromyces marxi anus )WWMJ-1,其特征在于,马克思克鲁维酵母菌(Jluyveromyces marxianus)WWMJ-1的菌种保藏编号为 CGMCC N0.8432。
2.一种复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下: (O马乳预处理:将新鲜马乳通过过滤除去马乳中的杂质和异物，再将马乳预热到60-65°C，在20MPa条件下均质10_15min，均质后将马乳巴氏杀菌，待发酵用；母发酵液、发酵液I和发酵液2需要预处理好的马乳用量按体积比为3:20:20 ； (2)种子发酵液及母发酵液的制备: 种子发酵液:将4°C下保存的马克思克鲁维酵母菌marxianus)WM^~ICGMCC N0.8432、乳酸乳球菌7acii5.)、干酿乳杆菌casei )和红曲霉菌iMonascus ruber)菌种在无菌环境下接种，分别将乳酸乳球菌(Xactococcuslactis )和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei )接种于MRS培养基置于37°C培养18_24h ；将马克思克鲁维酵母菌rnarxianus)mm-\ CGMCC N0.8432接种于YPD培养基置于28°C培养24-48h ;将红曲霉菌ruber)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48-72h活化，备用； 母发酵液:将步骤(1)预处理好的母发酵液选用马乳用量按体积比分为3:3:10:14分装于发酵容器中，在无菌条件下，将上述已活化好的马克思克鲁维酵母菌(Jluyveromycesmarxi anus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432、乳酸乳球菌 iLactococcus lac Hs) ^ 干酿乳杆菌{Lactobacillus casei )和红曲霉菌{Monascus ruber )种子发酵液按照体积比计5%接种量分别接入相应的四个 发酵容器中，分别置于37 °C培养18-24h、28 V培养24_48h和30 V培养48-72h，备用； (3)发酵液的制备:发酵液由发酵液I和发酵液2组成； 发酵液I的制备:将步骤(2)制备的乳酸乳球菌、干酪乳杆菌、马克思克鲁维酵母菌发酵液用量按照体积比计(1.4-1.5):(1.4-1.5):(5-5.2)接种于步骤(1)预处理好选用发酵液I用量的马乳中，在糖添加量为4-4.5g/100mL，发酵温度32-33°C、发酵时间为50_55h条件下发酵得到发酵液I ; 发酵液2的制备:将步骤(2)制备的红曲霉母发酵液按照体积比计7-7.5%接种于步骤(I)预处理好选用发酵液2用量的马乳中，在糖添加量为5g/100ml，发酵温度28_29°C、发酵时间7-8d条件下发酵得到发酵液2 ； (4)混合发酵液:将步骤(3)制备的发酵液I和发酵液2按照体积比计1:1的比例混合，进行巴氏杀菌后进行无菌灌装，在4°C下保存。
3.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的马乳预处理中，将马乳预热到65°C,在20MPa条件下均质IOmin,均质后将马乳巴氏杀菌。
4.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的分别将乳酸乳球菌iLactococcus Jacii1S)和干酿乳杆菌{Lactobacillus casei )接种于MRS培养基置于37°C培养24h,将马克思克鲁维酵母菌iKluyveromyces marxi anus) WWMJ-1CGMCC N0.8432接种于YI3D培养基置于28°C培养48h，将红曲霉菌(ifoftascws ^7/知^)接种于麦芽汁培养基置于30°C培养48h活化。
5.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的将上述已活化好的乳酸乳球菌iLactococcus Jaciis)、干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)、马克思克鲁维酵母菌UUuyveromyces marxi anus) WWMJ-1 CGMCC N0.8432和红曲霉菌(.Monascus ruber)种子发酵液分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h。
6.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的发酵液I的糖添加量为4g/100ml，发酵温度33°C、发酵时间为53h条件下发酵。
7.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的发酵液I的糖添加量为5g/100ml，发酵温度29°C、发酵时间7d条件下发酵。
8.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的乳酸乳球菌(Xactococcus Jaciis)、干酿乳杆菌{Lactobacillus casei)、马克思克鲁维酵母菌 iKluyveromyces marxi a/? ?5 ^ffWM J-1 CGMCC N0.8432 发酵液按照体积比计 1.5:1.5:5 接种制备发酵液I。
9.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备酸马乳的方法，其特征在于，所述的红曲霉菌{Monascus ruber)发酵液按照体积比计7%接种制备发酵液2。
10.上述任一权利要求所述复合菌种混合发酵方法制备获得酸马乳。
【文档编号】A23C9/127GK103834583SQ201410071070
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】武运, 王璐, 刘武军, 杨海燕, 王小标, 苗森, 高蕾, 周建中, 古丽娜孜, 黄文书, 夏俊芳 申请人:武运, 新疆农业大学