一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法。该方法通过采用碟片分离机和管式离心机的科学组合，对鸡艾美耳球虫卵囊进行分离纯化，孢子化卵囊纯化后，无较大杂质，且无极微小的杂质。玻片镜检极其干净，未孢子化卵囊也全部剔除干净，视野中均为孢子化卵囊，溶液背景清晰。本发明方法缩短了卵囊分离纯化时间，与传统技术相比，节省时间70%以上；整个卵囊纯化避免太多人为工作的干扰，减少了过多人为因素造成产品的不稳定，是目前球虫疫苗生产方法的突破；本方法只需两台离心机，便可连续生产，极大地降低企业的成本投入。
【专利说明】一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法。
【背景技术】
[0002]鸡球虫病iCoccidiosis、是由艾美耳属iEimeria)的一种或几种球虫(.Coccidium)同时或先后寄生于鸡肠道黏膜细胞所引起的疾病。世界上凡是有养鸡的地方就会有球虫病的发生，而规模化鸡场是鸡球虫病易发生的适宜场所，常常出现该病的爆发。据统计，全世界已报道的鸡球虫共有15种，其中，有5种具有明显的致病性，它们是:柔嫩艾美耳球虫(￡、毒害艾美耳球虫(/?.flecairii)、巨型艾美耳球虫、E.maxima)、燦形艾美耳球虫{E.acervulina)及和缓艾美耳球虫(B.mitis)。雏鸡和青年鸡易感染球虫,发病率和致死率高达80%以上，病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢；成年鸡一般不发病，但为带虫者，增重和产蛋能力降低，是传播球虫病的重要病源。因此，鸡球虫病对养禽业造成严重的经济损失，全球每年因该病造成的损失高达数百亿美元，我国每年因该病造成的经济损失不少于100亿元。
[0003]在养鸡业集约化程度日益提高的今天，鸡球虫病的防控也越来越重要。在上世纪80年代，大量抗球虫药物的出现，使得鸡球虫病的防控取得令人满意的成效。然而，大多数抗球虫药物多为化学类产品和抗生素类产品，这些产品的长期使用必然导致抗药性和药物残留现象的出现。而各种抗球虫药物的使 用均为伴料给药，实际上在上世纪90年代抗药现象已十分普遍，而新药研发的速度又十分缓慢，养鸡业面临无药可用的局面。进入21世纪以来，全球范围内化学药品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越来越多的关注，发达国家已基本禁止了化学抗球虫药物的使用，抗生素类抗球虫药物的使用也受到明显的限制，在美国、日本和欧共体已明令禁止此类产品出现在饲料中。我国也意识到在饲料中添加抗球虫药的危害，现在已经禁止部分抗球虫药添加在饲料中，这也使鸡球虫病的防治形势愈加紧张。
[0004]为了有效防治鸡球虫病，确保养鸡业的健康发展，目前疫苗接种预防被视为最理想的防控措施。现在世界上使用的球虫疫苗均为活卵囊疫苗。传统上使用的卵囊的纯化技术费时、费力，不适用于产业化生产，急切需要适用于规模化生产的技术工艺。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鸡艾美耳球虫卵囊纯化的工业化生产方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法，包括如下步骤:
Cl)粪样处理:收集鸡感染球虫后第120~192h的粪便，加水重悬粪便，浸泡I~3h后，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集沉淀，碟片分离机的离心条件为2500~3500g/min,离心8~12min ；
(2)经过碟片离心机后的上清再次利用蠕动泵经过管式离心机，离心收集沉淀，管式离心机的离心条件为2500~3500g/min,离心8~12min ；
(3)将两次离心的沉淀混合，向沉淀中加入2~4倍体积的饱和盐水，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集上清，碟片分离机的离心条件为1500 ~2500g/min,离心 8 ~12min ；
(4)上清中加入3~5倍饱和盐水体积的水，碟片离心机离心，收集沉淀，沉淀即为卵囊，用水洗涤后，沉淀用重铬酸钾溶液重悬，置25~30°C，待卵囊孢子化率达到80~90%后，收集卵囊，通过碟片离心机弃重铬酸钾溶液，碟片分离机的离心条件为2500~3500g/min,离心 8 ~12min ；
(5)以水重悬洗涤卵囊，然后以次氯酸钠溶液重悬卵囊，管式离心机离心，2500~3500g/min,离心8~12min,离心沉淀物即为纯化的孢子化卵囊,再次以水重悬洗漆，除去次氯酸钠溶液，然后以重铬酸钾溶液重悬孢子化卵囊低温保存备用。
[0007]作为优选的，步骤(1)加入水的量为粪便的5~15倍体积。
[0008]作为优选的，所述重铬酸钾溶液的浓度为2.5%，按质量百分比计。
[0009]作为优选的，步骤(5)所述次氯酸钠溶液的浓度为20~30%，按质量百分比计。
[0010]进一步优选，所述氯酸钠溶液的浓度为25%，按质量百分比计。
[0011]步骤(4 )和步骤(5 )所述低温保存是在置于4V保存。
[0012]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法缩短了卵囊分离纯化时间，与传统技术相比，节省时间70%以上；
(2)整个卵囊纯化避免太多人为工作的干扰，减少了过多人为因素造成产品的不稳定，是目前球虫疫苗生产方法的突破；
(3)本方法只需两台离心机，便可连续生产，极大地降低企业的成本投入。
【具体实施方式】
[0013]一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法，包括如下步骤:
Cl)粪样处理:收集鸡感染球虫后第120~192h的粪便，加水重悬粪便，浸泡I~3h后，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集沉淀，碟片分离机的离心条件为2500~3500g/min,离心8~12min ；
(2)经过碟片离心机后的上清再次利用蠕动泵经过管式离心机，离心收集沉淀，管式离心机的离心条件为2500~3500g/min,离心8~12min ；
(3)将两次离心的沉淀混合，向沉淀中加入2~4倍体积的饱和盐水，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集上清，碟片分离机的离心条件为1500 ~2500g/min,离心 8 ~12min ；
(4)上清中加入3~5倍饱和盐水体积的水，碟片离心机离心，收集沉淀，沉淀即为卵囊，用水洗涤后，沉淀用重铬酸钾溶液重悬，置25~30°C，待卵囊孢子化率达到80~90%后，收集卵囊，通过碟片离心机弃重铬酸钾溶液，碟片分离机的离心条件为2500~3500g/min,离心 8 ~12min ；
(5)以水重悬洗涤卵囊，然后以次氯酸钠溶液重悬卵囊，管式离心机离心，2500~3500g/min,离心8~12min, 离心沉淀物即为纯化的孢子化卵囊,再次以水重悬洗漆，除去次氯酸钠溶液，然后以重铬酸钾溶液重悬孢子化卵囊低温保存备用。[0014]下面结合实例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0015]实施例1
一种鸡艾美耳球虫卵囊纯化的工业化生产方法，具体操作如下:
(O粪样处理:收集鸡感染球虫后第120~192h的粪便，加10倍体积的双蒸水重悬粪便，浸泡2h后，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，3000g/min, IOmin,离心收集沉淀；
(2)经过碟片离心机后的上清再次利用螺动泵经过管式离心机,3000g/min,IOmin,离心收集沉淀；
(3)将两次离心的沉淀混合，向沉淀中加入3倍体积的饱和盐水，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，2000g/min，lOmin，离心收集上清；
(4)上清加4倍于饱和盐水体积的清水,碟片离心机离心3000g/min,IOmin,收集沉淀，沉淀即为卵囊，用双蒸水离心洗漆两次后，沉淀以2.5%重铬酸钾溶液重悬,置28°C,48h后孢子化率达到80~90%，收集卵囊，置于4°C冰箱保存备用；
(5)进一步纯化孢子化卵囊:取步骤(4)收集的卵囊，通过碟片离心机3000g/min，IOmin,弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，以25%次氯酸钠重悬卵囊，静止lOmin。用灭菌的管式离心机离心3000g/min, lOmin,离心沉淀物即为纯化的孢子化卵囊，以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，洗去次氯酸钠，以重铬酸钾重悬孢子化卵囊，置于4 °C冰箱保存备用。
[0016]利用本方法分离纯化得到的鸡艾美耳球虫卵囊具有以下特点:
(I)卵囊纯化后，溶液基本无较大杂质，但有较微小的杂质，孢子化时不会影响孢子化率。
[0017]( 2 )孢子化卵囊纯化后，无较大杂质，且无极微小的杂质。玻片镜检极其干净，未孢子化卵囊也全部剔除干净，视野中均为孢子化卵囊，溶液背景清晰。
[0018]以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【权利要求】
1.一种鸡艾美耳球虫卵囊分离纯化的工业化生产方法，包括如下步骤: (1)粪样处理:收集鸡感染球虫后第120~192h的粪便，加水重悬粪便，浸泡I~3h后，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集沉淀； (2)经过碟片离心机后的上清再次利用蠕动泵经过管式离心机，离心收集沉淀； (3)将两次离心的沉淀混合，向沉淀中加入2~4倍体积的饱和盐水，通过自流方式，使粪便混合液利用自身压力差，压入碟片分离机，离心收集上清； (4)上清中加入3~5倍饱和盐水体积的水，碟片离心机离心，收集沉淀，沉淀即为卵囊，用水洗涤后，沉淀用重铬酸钾溶液重悬，置25~30°C，待卵囊孢子化率达到80~90%后，收集卵囊，再通过碟片离心机弃重铬酸钾溶液； (5)以水重悬洗涤卵囊，然后以次氯酸钠溶液重悬卵囊，管式离心机离心，离心沉淀物即为纯化的孢子化卵囊，再次以水重悬洗涤，除去次氯酸钠溶液，然后以重铬酸钾溶液重悬孢子化卵囊低温保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)加入水的量为粪便的5~15倍体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在与，所述重铬酸钾溶液的浓度为2.5%，按质量百分比计。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述次氯酸钠溶液的浓度为，20~30%，按质量百分比计。
5.根据权利要求1所 述的方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的浓度为25%，按质量百分比计。
6.根据权利要求1所述的方 法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)所述低温保存是在置于4°C保存。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)、步骤(4)和步骤(5)的离心条件为2500~3500g/min,离心8~12min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)碟片分离机的离心条件为，1500 ~2500g/min,离心 8 ~ 12min。
【文档编号】C12R1/90GK103881913SQ201410082352
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】吴彩艳, 孙铭飞, 戚南山, 廖申权, 吕敏娜, 李娟 , 谢明权, 温列娜 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所