一株耻垢分枝杆菌极耐受过氧化氢突变菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耻垢分枝杆菌极耐受过氧化氢突变菌及其应用，本发明提供了一种耻垢分枝杆菌Mycobacterium?Smegmatis?mc251，其保藏号为CGMCC.NO8947。本发明的实验证明，该突变菌株是研究分枝杆菌应答过氧化氢分子机制很好的对象，进而为解释结核分枝杆菌潜伏感染以及耐药机制提供理论依据，为疫苗的研发提供基础。
【专利说明】一株耻垢分枝杆菌极耐受过氧化氢突变菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一株耻垢分枝杆菌极耐受过氧化氢突变菌及其应用。
【背景技术】
[0002]结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Μ.tb)是结核病的致病菌。活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)在结核分枝杆菌潜伏感染、耐药性和宿主之间的相互作用中起着非常重要的作用。过氧化氢(H2O2)是活性氧中的一种重要形式。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis)与结核分枝杆菌同属于分枝杆菌科分支杆属，是一种条件致病菌。基因上的大量同源性与生长优势均使得M.smegmatis成为研究M.tb首选的模式菌株。由于巨噬细胞内H2O2的生理浓度为5-10mM，在长期的共进化中，M.tb天然的抗H2O2,而作为研究M.tb的模式菌株M.smegmatis mc2155相对于M.tb对H2O2敏感，M.smegmatis几乎能够完全被清除而M.tb能够部分潜伏下来,可能与他们的抗H2O2能力有关。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株耻垢分枝杆菌极耐受过氧化氢突变菌及其应用。
[0004]本发明提供了耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc251,其保藏号为CGMCC.N08947。
[0005]上述耻垢分枝杆菌mc251在制备具有抗氧化性产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0006]上述耻垢分枝杆菌mc251在制备耐受H2O2的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0007]上述耻垢分枝杆菌mc251在制备耐受巨噬细胞吞噬的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0008]上述产品为试剂盒。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种具有抗氧化性或耐受H2O2或耐受巨噬细胞吞噬的产品。
[0010]本发明提供的产品，包括上述的耻垢分枝杆菌mc251或其发酵产物或其重悬液或其代谢产物或其培养液。
[0011]耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc251,于 2014 年 3 月 21 日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8947，分类命名为耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis。
[0012]本发明的实验证明，本发明筛选耐H2O2耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatismc251，并且测定突变株对H2O2的最小抑菌浓度(MIC)、世代时间、在宿主细胞中的存活率、在饥饿条件下的生长情况以及对巨噬细胞生理H2O2浓度的反应来鉴定此突变株的表型。另外，对此突变菌株进行了全基因组测序，与野生型全序列比对，找到若干突变位点(SNPs，单核苷酸多态性)。因此，该突变菌株是研究分枝杆菌应答过氧化氢分子机制很好的对象，进而为解释结核分枝杆菌潜伏感染以及耐药机制提供理论依据，为疫苗的研发提供基础。与野生型相比，突变株极耐受过氧化氢，生长速度变慢，在宿主细胞中的存活率增高，在饥饿条件下有生长优势，这些表型都与病原菌结核分枝杆菌相似，其表型更像结核分枝杆菌，使得其可能作为可行的活疫苗载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc251的菌落形态。
[0014]图2为突变菌株mc251对H2O2的最小抑菌浓度。
[0015]图3为突变菌株mc251过氧化氢处理点板实验。
[0016]图4为突变菌株mc251世代时间、starvation点板以及Macrophage killingassay。
【具体实施方式】
[0017]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019]实施例1、耻垢分枝杆菌突变菌株的获得
[0020]一、突变菌株的获得
[0021]利用耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc2155作为对象,通过逐步提高液体培养基中H2O2的浓度来筛选耐H2O2耻垢分枝杆菌,命名为MycobacteriumSmegmatismc251。
[0022]具体过程如下:
[0023](I)根据测得的me2155对H2O2的最小抑菌浓度选择菌液初始H2O2处理浓度(0.039mM)；
[0024](2)将新鲜的mc2155菌液按1:1000接种至5ml含H2O2的7H9培养基。(H2O2的浓度设置要稍小于mc2155对H2O2的最小抑菌浓度)
[0025](3)待该菌液生长至对数后期再按步骤(2)逐步提高H2O2浓度，使菌株受到持续高浓度H2O2刺激而对H2O2产生耐受。
[0026](4)由于筛选出的耐H2O2菌液是一个群体,所以将这些菌液在7H10固体培养基上划线得到的单菌落再培养收集到的菌体才是对H2O2有单一 MIC (最小抑菌浓度)的突变株。
[0027](5)为了保证得到的单克隆有遗传稳定性，需要再将上述得到的对H2O2有单一 MIC突变株在没有H2O2压力条件下传10次，划7H10平板后得到的单菌落即为突变菌耻垢分枝杆菌 Mycobacterium Smegmatis mc251。
[0028]耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc251,于 2014 年 3 月 21 日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8947，分类命名为耻垢分枝杆菌Mycobacteriumsmegmatis。[0029]二、耻垢分枝杆菌 Mycobacterium Smegmatis mc251 的表型
[0030]1、耻垢分枝杆菌 Mycobacterium Smegmatis mc251 的形态特征
[0031]菌落形态特征如图1所示，菌落干燥，细皱至粗褶，乳脂白色；细菌形态纤细杆菌，长3.0-5.0微米，有时弯曲，有分枝或Y形细胞。
[0032]2、生理生化特征
[0033]mc251需氧菌，革兰氏阳性菌，可被石碳酸品红染色法以及罗丹明荧光染色法染色。
[0034]3、世代时间测定
[0035]1)活化菌液:上述一制备耻垢分枝杆菌突变菌株mc251和野生型mc2155种子液按1:50接种5ml至对数生长期(OD6qq=0.5左右)，再按初始OD为0.02接种IOml，长至OD6tltl=0.1左右。
[0036]2)测定菌液OD值，并使初始OD均为0.1。
[0037]3)按浓度稀释涂平板，计数得N0。
[0038]4)将OD=0.1的菌液分装到15ml离心管，每管2ml。37°C，200rpm，培养20h，涂平
板计数得Nt。
[0039]2)根据公式n= (IgNt-1gNci)/lg2计算世代时间。
[0040]结果如图4a所示，突变菌株mc251世代时间为3.448±0.087小时，野生型me2155世代时间为2.734±0.051小时，突变株比野生型要长，即生长速度变慢。
[0041]4、Starvation 点板检测
[0042]将上述一制备耻垢分枝杆菌突变菌株mc251和野生型mc2155从种子液按1:100的比例接到5mL的7H9培养基中，摇到0D600=0.3，取出Iml菌液，按10倍梯度稀释至10」，将浓度从高到低的菌液依次点营养有限的培养基(M9)平板以及营养丰富的培养基(M9+10%ADS)平板。
[0043]结果如图4b所示，突变菌株mc251在饥饿条件下(M9培养基)生长比野生型要好很多，在营养丰富培养基上(M9+10%ADS)生长没有什么差别。
[0044]5、耻垢分枝杆菌突变菌株全基因组测序
[0045]I)取IOml由上述一制备耻垢分枝杆菌突变菌株mc251的菌液离心12000rpm，lmin,弃上清，加500ul DNA裂解液，充分混匀，重悬菌体；
[0046]2)加入300ul5M NaCl，充分混匀，沉淀蛋白，12000rpm离心15min ；
[0047]3)取上清,加氯仿800ul,混匀，12000rpm离心10min ；
[0048]4)取上清，加2.5倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀15min ；
[0049]5) 2000rpm离心10min,弃上清，用70%乙醇Iml洗一次；
[0050]6)再离心2min，弃净乙醇，烘干，溶于50ul水，存于_20°C ；
[0051]7)将基因组DNA进行测序。
[0052]测序后(genbank号JAJD00000000及提交时间2014.1.12)与野生型mc2155的基因组DNA (genbank号NC_008596提交时间2006.10.19)进行比对，找到若干突变位点(SNPs，单核苷酸多态性)，如表1所示。
[0053]表1为与野生型mc2155比对后突变菌株mc251的基因组DNA的SNPs
[0054]
【权利要求】
1.耻垢分枝杆菌Mycobacterium Smegmatis mc251,其保藏号为 CGMCC.N08947。
2.权利要求1所述的耻垢分枝杆菌mc251在制备具有抗氧化性产品中的应用。
3.权利要求1所述的耻垢分枝杆菌mc251在制备耐受H2O2的产品中的应用。
4.权利要求1所述的耻垢分枝杆菌mc251在制备耐受巨噬细胞吞噬的产品中的应用。
5.一种具有抗氧化性或耐受H2O2或耐受巨噬细胞吞噬的产品，包括权利要求1所述的耻垢分枝杆菌mc251 或其发酵产物或其重悬液或其代谢产物或其培养液。
【文档编号】C12N1/20GK103898021SQ201410128566
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】米凯霞, 李晓静, 陶均, 胡新玲 申请人:中国科学院微生物研究所