水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用。所述病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本发明更进一步公开了融合表达病毒载体在制备用于提高视神经脊髓炎和多发性硬化的临床诊疗水平方面的应用。本发明采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。该项目的建立将极大提高视神经脊髓炎疾病谱和多发性硬化的诊疗水平，提高患者的劳动能力和生活质量，将产生很大的社会效益和经济效益。
【专利说明】水通道蛋白-4自身抗体的检测方法及融合表达病毒载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法及其融合表达病毒载体。水通道蛋白(aquaporin，AQP)_4抗体阳性是视神经脊髓炎诊断的重要支持条件，抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性。本发明属于疾病分子鉴定和诊断领域，结合病毒载体构建，转染，荧光免疫染色及流式细胞分析技术，主要应用于NMO和MS的临床鉴别诊断，提高NMO和MS的诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的指标;AQP_4检测平台的建立能为进一步研究AQP-4抗体的致病机制提供基础。
【背景技术】[0002]多发性硬化(MultipleSclerosis, MS)和视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica, NMO)是中枢神经系统最为常见的脱髓鞘疾病，已成为中青年非外伤致残首要疾病之一。两种疾病均常累及视神经和脊髓，因此临床上较难区分，尤其是发病早期。目前研究认为MS是由CD4辅助T细胞(包括Thl和Thl7亚群)介导的自身免疫疾病，故治疗多以免疫调节为主，如β -干扰素等。而NMO以体液免疫为主,治疗多以免疫抑制为主。因此，早期鉴别诊断对指导两种疾病的治疗和评估预后非常重要。2004年Lennon等通过间接免疫荧光染色方法检测发现视神经脊髓炎病人血清中存在着一种特异性自身抗体NMO-1gG，它在视神经炎(Optic neuritis, ON)、长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally extensivetranverse myelitis, LETM)患者血清中的阳性率也较高,2006年Wingerchuk DM修订了NMO诊断标准，将NMO-1gG抗体阳性做为诊断的重要支持条件，该诊断标准强调了水通道蛋白-4抗体在NMO诊断中的重要价值。在此基础上，Wingerchuk DM又于2007年提出了视神经脊髓炎疾病谱，认为0N、LETM (包括伴有自身免疫病和/或有颅内病灶)为视神经脊髓炎的限定型，连同视神经脊髓型多发性硬化(OSMS)—同被归为NMO的疾病谱。后续研究还发现，AQP4抗体滴度与患者病情的严重程度、预后、复发具有相关性，临床上用免疫球蛋白和血浆置换治疗NMO疗效较好。NMO患者尸检的病理显示病灶中血管周围有大量的免疫球蛋白和补体沉积、星型胶质细胞破坏和再生，其分布与AQP-4表达的分布相一致。通过AQP-4抗体阳性血清与转染AQP-4cDNA的HEK293细胞孵育，并用抗人IgG示踪已结合的抗体，发现NMO中的AQP-4抗体为IgGl，而IgGl具有激活补体功能。进一步的体外实验证实AQP-4抗体与表达AQP-4分子的HEK细胞结合后能激活补体。2009年Bennett等研究发现，在已经诱导出EAE的大鼠鞘内注射人工合成的AQP-4抗体能够导致病灶内星型胶质细胞的死亡，与NMO病灶病理改变相似。这提示AQP4抗体可能不仅仅是NMO的标志物，有可能是致病性抗体。
[0003]目前国际上检测AQP-4抗体的技术主要有间接免疫荧光法(IndirectImmunofluorescence, HF)、突光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay,FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、突光免疫细胞染色法(Cell-Based Assay, CBA)(文献支持 Clin Immunol.2011 Mar; 138(3):239-46,Neurology.2012 Feb 28;78 (9):665-71 ；)及酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特异性最为理想。然而，CBA法平均检测周期超过两天，荧光效率不稳定，而且需要人为观察，费时费力，而且可能会增加检测中的人为误差；FIPA法涉及到同位素的应用，环境危害性大大增加。此外，针对AQP-4自身抗体的检测国内目前只少数研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常规应用于临床，因此何种方法作为“金标准”被推荐应用于临床AQP-4抗体的检测尚待阐明。
[0004]传统检测AQP-4的方法如间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法等敏感性和特异性均不高，放射免疫沉淀法涉及放射源污染问题。因此，我们应用稳定转染AQP-4的细胞系，采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色法(CBA)结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体。
[0005]传统CBA方法应用的质粒为EGFP标记的人AQP4 cDNA质粒及对照EGFP cDNA质粒，应用聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体方法进行瞬时转染。耗时长，人力物力损耗大，且荧光效率不稳定。因此需要更为稳定的转染方法以获得更敏感稳定的结果。
【发明内容】
[0006]本发明通过提供一种流式细胞术检测水通道蛋白-4自身抗体的方法，及其融合表达病毒载体。采用灵敏度和特异性更高的荧光免疫细胞染色结合流式细胞检测技术，用于临床定性、定量检测AQP-4抗体，使检测结果更加稳定，且极大节约人力和时间成本。AQP4抗体检测技术的平台的建立，有利于提高视神经脊髓炎和多发性硬化的临床诊疗水平。应用于NMO和MS的临床鉴别诊断，提高NMO和MS的诊断水平；能辅助作为用药疗效、病情监测、复发预测的 指标;AQP-4检测平台的建立能为进一步研究AQP-4抗体的致病机制提供基础。
[0007]因此，本发明的一个目的是一种水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体，其特征在于所述表达病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP，具有SEQ ID N0.2所示序列。
[0008]构建好的病毒载体的完整序列: acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttaca
aggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtggga
【权利要求】
1.一种水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体,其特征在于所述表达病毒载体为pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP 具有 SEQ ID N0.2 所示序列。
2.—种产生水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行: I)载体构建:构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体； 无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列(GGGGS)相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；pEGFP-ΝΙ载体上扩增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和 EGFPR: 5’- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’， 扩增片段切胶回 收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EFl-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EFl-copGFP序列； 以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 (Ml)序列，所用引物为:
AQP4F: 5’ -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’ 和 AQP4R: 5’ -CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤I获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体，如SEQ ID N0.2所/Jn ο
3.—种检测来自个体的生物样品中是否存在水通道蛋白-4自身抗体的方法，其特征在于按如下的步骤进行: 1)载体构建:构建强组成型启动子CMV介导的融合表达人AQP-4基因及荧光标记基因EGFP的慢病毒载体； 无终止密码子的人AQP-4基因与EGFP基因用5个氨基酸组成的柔性序列(GGGGS)相连接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整个融合蛋白的N端，以保证AQP-4蛋白的天然状态的拓扑结构、亚细胞位置和两个蛋白相对独立的功能；pEGFP-ΝΙ载体上扩增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和 EGFPR: 5’- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用BamHI和SalI双酶切后与经同样酶双酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体片段相连接，用EGFP置换掉原载体中的EFl-copGFP序列；以人视神经cDNA为模板，扩增AQP-4 (Ml)序列，所用引物为:AQP4F: 5’ -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3，和 AQP4R: 5，-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’，扩增片段切胶回收后连入T载体，经测序比对序列正确后将其用XbaI和BglII双酶切后与经XbaI和BamHI双酶切后的步骤I获得质粒载体相连接，得到慢病毒质粒载体(如SEQ ID N0.2所示)； 2)病毒包装及HEK293稳定转染细胞系的获得:细胞系及其培养:人胚肾HEK293细胞系由本室常规培养，细胞置于含有10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，放入37°C，5% CO2孵箱，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验； 细胞的复苏和传代:预先向50ml离心管中加入20mL DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37°C水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70%酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心10分钟，弃上清，重悬细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37°C、5%C02、饱和湿度下培养； 待HEK293细胞长至70%密度时，撤掉旧的培养基，用PBS清洗细胞，利用CaCl2法包装表达AQP-4-EGFP(pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP)融合蛋白的慢病毒，收集病毒悬液在6 μ g/ml Polybrene存在的情况下感染HEK293细胞，I周后，分选阳性稳定转染细胞；继续传代培养后进行二次筛选，获得100%转染过的稳定表达融合蛋白的HEK293细胞系；所述的传代培养指的是细胞生长至对数生长期，用胰酶消化贴壁细胞2-5分钟，后传代至培养皿继续培养; 3)细胞免疫荧光染色法结合流式细胞术测定血清AQP-4抗体: 获得待检血清后，用含1%BSA (Sigma) DMEM-Hepes洗液稀释待测血清，收集转染及未转染的HEK293细胞，按I:1的比例混合，总数为5X105，用流式staining缓冲液(1XPBS含3%的马血清及0.02%的叠氮钠NaN3)清洗I次，离心后弃去上清，用100 μ I稀释过的血清或人Ig对照重悬细胞，4度孵育30min,然后加入流式staining缓冲液清洗I次,离心收集细胞后加入IOOul稀释后的Fast blue标记的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining缓冲液清洗I次，然后用300ul流式staining缓冲液重悬细胞,流式细胞仪双通道检测荧光信号，以未转染细胞亚群及人Ig染色组为对照，判断AQP-4抗体阳性样本，依据EGFP阳性细胞类群中的Fast blue信号强弱用来标示抗体浓度的相对量； 4)统计分析:使用GraphPadPrism 4软件对数据进行绘图及统计分析得出结果。
4.权利要求1所述水通道蛋白-4自身抗体融合表达病毒载体在制备用于提高视神经脊髓炎和多发性硬化临床诊疗方面的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103937836SQ201410139698
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】闫亚平, 施福东, 金薇娜, 李敏淑, 齐媛 申请人:天津医科大学总医院